專利名稱：一種獲得巴戟天體細胞再生植株的方法及其培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種獲得巴戟天體細胞再生植株的方法及其培養基。
背景技術：
巴戟天(Morinda off icinalis How.)是菌草科多年生木質藤本植物，肉質根入藥，根皮含蒽醌化合物，環烯醚萜甙、植物留醇及多糖、低聚糖等藥用成分。具有補腎壯陽、強筋骨、祛風濕等功效，用途十分廣泛，是目前我國出口創匯和內需的主要中藥品之一，力口上近年來巴戟天的市場需求量大，以至巴戟天的栽培規模不斷擴大，由于巴戟天種植是剪取自身藤條作為種苗，對于大規模種植時所需種苗產生了瓶頸制約，本技術是利用植物細胞的全能性進行苗木培育植物體的每一個細胞都攜帶著一套完整的基因組，并具有發育為完整植株的潛能，因為每個細胞都是來自于受精卵，所以有與受精卵具有相同的遺傳物質。基于植物此特點，有必要對巴戟天進行組培快繁研究，為種植戶提供優質、大量巴戟天種苗，切實解決巴戟天苗木需求的瓶頸，提高巴戟天種植產量。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種用于獲得巴戟天(Morinda officinalis How.)體細胞再生植株的成套培養基，它含有獨立包裝的培養基A (即誘導培養基)，所述培養基A為由MS基本培養基、細胞分裂素、生長素、蔗糖或葡萄糖、和凝固劑制成的固體培養基；所述培養基A中的所述細胞分裂素的含量為O. lmg/L ；所述培養基A中的所述生長素的含量為0. lmg/L ο在上述成套培養基中，所述培養基A中的所述細胞分裂素為6-BA或KT ；和/或，所述培養基A中的所述生長素為2，4-D或NAA ；和/或，所述培養基A中的所述蔗糖或葡萄糖的含量為20g/L ；和/或，所述培養基A中的所述凝固劑為瓊脂，所述瓊脂在所述培養基A中的含量為 7 — 8g/L。在上述成套培養基中，還可含有獨立包裝的培養基B (即增殖培養基)，所述培養基B為由MS基本培養基、細胞分裂素、生長素、蔗糖和凝固劑制成的固體培養基；所述培養基B中的所述細胞分裂素的含量為I. 0—2. 0mg/L ；所述培養基B中的所述生長素的含量為0. 5mg/L。在上述成套培養基中，所述培養基B中的所述細胞分裂素為6-BA ；和/或，所述培養基B中的所述生長素為2，4-D或NAA ；和/或，所述培養基B中的所述蔗糖的含量為20g/L ；和/或，所述培養基B中的所述凝固劑為瓊脂，所述瓊脂在所述培養基B中的含量為 7 — 8g/L。在上述成套培養基中，還可含有獨立包裝的培養基C (即生根培養基)，所述培養基C為由1/2 —1/8的MS基本培養基、NAA和凝固劑制成的固體培養基；
所述培養基C中的所述NAA的含量為O. 01—0. lmg/L,如O. 01mg/L、0. 05mg/L或
O.lmg/L ；所述培養基C中的所述凝固劑具體為瓊脂，所述瓊脂在所述培養基C中的含量為4—6g/L。本發明的另一個目的是提供一種獲得巴戟天(Morinda officinalis How.)體細胞再生植株的方法，所述方法包括將所述巴戟天的帶節莖段用所述培養基A進行誘導培養 獲得巴戟天不定芽的步驟。所述方法還可包括將所述巴戟天不定芽用所述培養基B進行擴繁培養以獲得更多不定芽的步驟。所述方法還可包括將所述巴戟天不定芽用所述培養基C進行生根培養的步驟。在上述方法中，所述將所述巴戟天的帶節莖段用所述培養基A進行誘導培養前，包括將所述巴戟天的帶節莖段按照包括如下步驟I) -2)的方法進行消毒的步驟I)用體積百分含量為75%的乙醇溶液浸泡30秒；2)用有效氯質量百分含量為10%的次氯酸鈉溶液浸泡20分鐘。在上述方法中，所述誘導培養的光照條件為先黑暗培養7天再按照如下光照條件培養每天24小時中光照12小時，光照的強度為1000—30001UX，其余時間為黑暗；所述誘導培養的溫度為26°C—28°C ；和/或，所述擴繁培養的光照條件為先在每天24小時中光照12小時、光照強度為20001UX、其余時間為黑暗的條件下培養7天，再移至每天24小時中光照12小時，光照強度為1000— 1500LUX，其余時間為黑暗的條件下培養；所述擴繁培養的溫度為26°C—28°C ；和/或，所述生根培養的光照條件為先在每天24小時中光照12小時，光照強度為1000— 1500LUX，其余時間為黑暗的條件下培養，再移至1000-20001UX條件下培養；所述生根培養的溫度為22°C。所述MS基本培養基的溶劑為水，溶質及其濃度如表I所示。使用本發明所提供的培養基和培養方法進行巴戟天體細胞再生植株培養的優點如下誘發巴戟天不定芽的時間短，從接種帶節莖段至獲得l-3cm長的不定芽只需15天，而現有技術一般為20-30天；增殖頻率高，繁殖系數為(46-56)/50天，現有技術一般為6/50天；生長周期短、且苗齊苗壯、生長良好。本發明為巴戟天組培快繁提供了一種高效的方法和途徑。
圖I為巴戟天經誘導培養獲得的帶不定芽的莖段。圖2為巴戟天不定芽經擴繁培養獲得的叢生芽。圖3為巴戟天的生根培養。圖4為包括根莖葉的巴戟天再生植株。圖5為經組織培養獲得的巴戟天再生植株移栽后的杯苗。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
下述實施例中所用的MS基本培養基的溶劑為水，溶質及其濃度如表I所示。表I. MS基本培養基
大量元素j培養基中濃度(g· L/1)
NH4NO31.65
KNO^~L9
KH2PO4O. 17
MgSO4 · 7H20O. 37
CaCl2 · 2H200. 44
微量元素培養基中濃度(m g · L'1)
FeSO4 · 7H2027. 8
Na2EDTA37. 3
MnSO4 · 4H2022. 3
ZnSO4 · 4Η20δΓθ
H3BO36.2
Κ 0.83
Na2MoO4 · 2Η20O. 25
CuSO4 · 5Η20O. 025
CoCl2 · 6Η20O. 025
有機成分培養基中濃度(mg · L/1)
甘氨酸270
鹽酸硫胺素0Π鹽酸吡哆素
煙酸VB50Γδ
肌醇100
實施例I、獲得巴戟天體細胞再生植株的方法I、外植體的獲取選擇生長優良的巴戟天(Morinda officinalis How.)枝條,采集巴戟天新梢生至30 50 cm的莖，選擇晴好的天氣，剪下新枝，除去葉子，留一小段葉柄，立即放入裝有少量清水的塑料袋運回組培室；先用自來水沖洗15分鐘，去掉老葉，剪成約3 cm 5 cm長的帶節莖段。2、外植體的消毒將步驟I獲得的巴戟天帶節莖段在超凈工作臺中進行如下消毒處理用體積百分含量為75%的乙醇溶液浸泡30秒；除去液體后用無菌水洗一遍；用有效氯質量百分含量為10%的次氯酸鈉溶液浸泡20分鐘，除去液體用無菌水洗三至五次；用無菌吸水紙吸干巴戟天帶節莖段表面水 份。3、芽的誘導培養無菌條件下，將經步驟2消毒處理過的帶節莖段的兩端傷口剪去，獲得I一2cm長的帶節莖段，插入誘導培養基中進行不定芽誘導培養；培養的光照條件為先黑暗培養I周再按照如下光照條件培養:每天24小時中光照12小時，光照的強度為1000— 3000LUX，其余時間為黑暗；培養溫度為26°C—28°C ;空氣濕度在70%以下。經上述誘導培養的莖段，其莖節處會長出不定芽(圖1)，當不定芽長為I一3 Cm時，可用于步驟4的增殖培養。上述誘導培養基的基礎培養基是MS基本培養基(表I )，向MS基本培養基中添加激素 NAA O. lmg/L、6-BA O. lmg/L,葡萄糖 20g/L 和瓊脂 7g/L,滅菌前調 pH 值為 5. 7,121 °C 高壓滅菌20min，得到的固體培養基即為該誘導培養基。統計方法隨機取30— 45個帶節莖段，每10 —15個為一個重復，在帶節莖段插入誘導培養基7天后，統計污染率(長菌莖段數/插入莖段數);在插入誘導培養基14天后，統計誘導率(即獲得長I一3 cm不定芽的莖段數占插入莖段數的百分比)。結果如表2所示。4、芽的擴繁培養無菌條件下，將步驟3獲得的長為1-3 Cm的不定芽切下，接種于增殖培養基上進行擴繁培養獲得叢生芽(圖2);培養的光照條件為先在每天24小時中光照12小時、光照強度為20001UX、其余時間為黑暗的條件下培養7天，再移至每天24小時中光照12小時，光照強度為1000-1500LUX，其余時間為黑暗的條件下培養；培養溫度為26°C—28°C ;空氣濕度在70%以下。上述增殖培養基的基礎培養基是MS基本培養基，向MS基本培養基中添加NAAO. 5mg/L、6-BA 2mg/L、鹿糖20g/L和瓊脂7g/L,滅菌前調pH值為5. 7,121°C高壓滅菌20min，得到的固體培養基即為該增殖培養基。每個接種的不定芽經擴繁培養發育為一個叢生芽，當叢生芽長到高為2 Cm時，將叢生芽分成的高為I一2cm單個不定芽，轉移至新配制的增殖培養基按照同樣方法進行再次擴繁培養。統計方法隨機取96—120個初次擴繁培養的不定芽，每32— 40個不定芽為一個重復，經擴繁培養50天后(即擴繁2次，每次25天)，統計繁殖系數(即獲得高為I一2cm的不定芽數目/初次擴繁培養的不定芽數目)，結果如表2所示。5、生根培養從經步驟4擴繁培養2次獲得的高為2 cm的叢生芽上取高為I一2 Cm的不定芽轉移到生根培養基中進行生根培養(圖3)，獲得包括根莖葉的巴戟天再生植株(圖4);生根培養的光照條件為先在每天24小時中光照12小時，光照強度為1000— 1500LUX，其余時間為黑暗的條件下培養，再移至1000-200LUX條件下培養；所述生根培養的溫度為22°C。上述生根培養基的基礎培養基是1/2的MS基本培養基，向1/2MS基本培養基中添加NAA O. 01mg/L、瓊脂4g/L，滅菌前調pH值為5. 7，121°C高壓滅菌20min，得到的固體培養基即為該生根培養基。 統計方法隨機取60個進行生根培養的不定芽，每20個為一個重復，經生根培養7天后，統計生根率(即生根的再生植株數占進行生根培養的不定芽數的百分比)，同時觀察再生植株主根粗壯，須根較多，葉色濃綠，苗莖紫紅。結果如表2所示。6、再生植株的移栽待步驟5獲得的包括根莖葉的再生植株長至含5片葉以上時，從培養基中取出，洗去培養基，用多菌靈浸泡10分鐘，移栽到黃心土和泥炭土(或椰糠)為2:10的混合基質中，置于溫室中進行常規栽培管理，定時澆水，注意遮光保濕。30天后統計再生植株的移栽成活率，結果如表2所不。表2.巴戟天體細胞植株再生實驗結果(一)
SM~j污染率(％)~j誘導率(％)~j繁殖系數(50天)~j生根率(％) j成活率(％)
11080598085
2685527590
3789587884 平均~~ 85 56 77 86實施例2、獲得巴戟天體細胞再生植株的方法I、外植體的獲取與實施例I中步驟I的方法相同。2、外植體的消毒與實施例I中步驟I的方法相同。3、芽的誘導培養按照實施例I中步驟3的方法進行，不同之處在于誘導培養基是向MS基本培養基中添加 2，4-D O. lmg/L, KT O. lmg/L,蔗糖 20g/L 和瓊脂 8g/L。4、芽的擴繁培養按照實施例I中步驟4的方法進行，不同之處在于增殖培養基是向MS基本培養基中添加 NAA O. 5mg/L、6-BA 2mg/L、鹿糖 20g/L 和瓊脂 7. 5g/L。
5、生根培養按照實施例I中步驟5的方法進行，不同之處在于生根培養基的基礎培養基是1/6的MS基本培養基，向該基礎培養基中添加NAA O. 05mg/L和瓊脂5g/L。6、再生植株的移栽按照實施例I中步驟6的方法進行。結果如表3所示。表3.巴戟天 體細胞植株再生實驗結果權利要求
1.用于獲得巴戟天(Morindaofficinalis How.)體細胞再生植株的成套培養基,其特征在于所述成套培養基中含有獨立包裝的培養基A，所述培養基A為由MS基本培養基、細胞分裂素、生長素、蔗糖或葡萄糖、和凝固劑制成的固體培養基； 所述培養基A中的所述細胞分裂素的含量為O. lmg/L ； 所述培養基A中的所述生長素的含量為O. lmg/L。
2.根據權利要求I所述的成套培養基，其特征在于 所述培養基A中的所述細胞分裂素為6-BA或KT ； 和/或，所述培養基A中的所述生長素為2，4-D或NAA ； 和/或，所述培養基A中的所述蔗糖或葡萄糖的含量為20g/L ； 和/或，所述培養基A中的所述凝固劑為瓊脂，所述瓊脂在所述培養基A中的含量為7—8g/L。
3.根據權利要求I或2所述的成套培養基，其特征在于所述成套培養基中含有獨立包裝的培養基B，所述培養基B為由MS基本培養基、細胞分裂素、生長素、蔗糖和凝固劑制成的固體培養基； 所述培養基B中的所述細胞分裂素的含量為I. 0—2. Omg/L ； 所述培養基B中的所述生長素的含量為O. 5mg/L。
4.根據權利要求3所述的成套培養基，其特征在于 所述培養基B中的所述細胞分裂素為6-BA ； 和/或，所述培養基B中的所述生長素為2，4-D或NAA ； 和/或，所述培養基B中的所述蔗糖的含量為20g/L ； 和/或，所述培養基B中的所述凝固劑為瓊脂，所述瓊脂在所述培養基B中的含量為7—8g/L。
5.根據權利要求I一4中任一所述的成套培養基，其特征在于所述成套培養基中含有獨立包裝的培養基C，所述培養基C為1/2 —1/8的MS基本培養基、NAA和凝固劑制成的固體培養基； 所述培養基C中的所述NAA的含量為O. 01—0. lmg/L ； 所述培養基C中的所述凝固劑具體為瓊脂，所述瓊脂在所述培養基C中的含量為4一6g/L。
6.獲得巴戟天(Morindaofficinalis How.)體細胞再生植株的方法,其特征在于所述方法包括將所述巴戟天的帶節莖段用權利要求I或2中的所述培養基A進行誘導培養獲得巴戟天不定芽的步驟。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述方法包括將所述巴戟天不定芽用權利要求3或4中的所述培養基B進行擴繁培養的步驟。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于所述方法包括將所述巴戟天不定芽用權利要求5中的所述培養基C進行生根培養的步驟。
9.根據權利要求6—8中任一所述的方法,其特征在于 所述將所述巴戟天的帶節莖段用權利要求I或2中的所述培養基A進行誘導培養前，將所述巴戟天的帶節莖段按照包括如下步驟I) -2)的方法進行消毒的步驟 I)用體積百分含量為75%的乙醇溶液浸泡30秒；2)用有效氯質量百分含量為10%的次氯酸鈉溶液浸泡20分鐘。
10.根據權利要求6—9中任一所述的方法,其特征在于 所述誘導培養的光照條件為先黑暗培養7天再按照如下光照條件培養每天24小時中光照12小時，光照的強度為1000— 30001UX，其余時間為黑暗；所述誘導培養的溫度為260C-280C ； 和/或，所述擴繁培養的光照條件為先在每天24小時中光照12小時、光照強度為20001UX、其余時間為黑暗的條件下培養7天，再移至每天24小時中光照12小時，光照強度為1000— 1500LUX，其余時間為黑暗的條件下培養；所述擴繁培養的溫度為26°C—28°C ； 和/或，所述生根培養的光照條件為先在每天24小時中光照12小時，光照強度為1000— 1500Lux，其余時間為黑暗的條件下培養，再在1000-2000Lux條件下培養；所述生根培養的溫度為22°C。
全文摘要
本發明公開了一種獲得巴戟天體細胞再生植株的方法及其培養基。所述培養基為成套培養基，包括誘導培養基、增殖培養基和/或生根培養基；所述誘導培養基為在MS基本培養基中添加細胞分類素(6-BA或KT)0.1mg/L和生長素(2,4-D或NAA)0.1mg/L；所述增殖培養基為在MS基本培養基中添加細胞分類素(6-BA)1.0—2.0mg/L和生長素(2,4-D或NAA)0.5mg/L；所述生根培養基為在1/2—1/8MS基本培養基中添加NAA 0.01—0.1mg/L。本發明的優點如下誘發巴戟天不定芽的時間短，從接種帶節莖段至獲得1-3cm長的不定芽只需15天；增殖頻率高，繁殖系數為(46—56)/50天；生長周期短、且苗齊苗壯、生長良好。本發明為巴戟天組培快繁提供了一種高效的方法和途徑。
文檔編號A01H4/00GK102960251SQ20121051093
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月3日 優先權日2012年12月3日
發明者秦垂新, 羅江清, 姚松君, 郭愛玲, 鄭志娟, 梁展, 陳偉文, 孫君社, 鄭志安, 張秀清 申請人:無限極(中國)有限公司, 高要市董福行農副產品種植管理有限公司