專利名稱：一種組織工程化人涎腺多形性腺瘤活體組織模型的建立方法
技術領域：
本發明涉及一種腫瘤模型的建立方法，具體地說是一種組織工程化人涎腺多形性腺瘤活體組織模型的建立方法。
背景技術：
臨床上常見的部分良性腫瘤具有易復發或多發的特性，手術過程中的不慎操作，往往會造成術后腫瘤沿手術切口呈串珠狀種植性生長。術后腫瘤的種植性生長及復發給患者的生理和心理上帶來極大的創傷和痛苦；多次復發還可能導致腫瘤惡變，尤其是發生于口腔頜面部的某些良性腫瘤，如人涎腺多形性腺瘤，WHO將其定義為臨界瘤，由于其發生部位的特殊性，也給再次手術帶來困難，嚴重影響了患者的生存質量。 目前國內外學者對人涎腺多形性腺瘤進行的研究，其研究對象多局限于離體標本，主要是對腫瘤的臨床流行病學、病因學、病理學、分子生物學以及手術方式的改進、基因治療方面的研究與探索。有學者通過將人涎腺多形性腺瘤的組織塊移植至裸鼠背部皮下，以試圖建立移植瘤動物模型，但所建立的動物模型存在組織塊消失和退化的缺點，因而未能在研究中大量應用。也有學者通過轉基因技術制備了人多形性腺瘤PLAGl轉基因小鼠模型，由于其為轉基因技術制備的動物模型，雖然轉基因小鼠頜下腺腫瘤模擬了人類多形性腺瘤，但在腫瘤的組織發生上與人多形性腺瘤有較大差異，組織學表現上也存在差異，甚至在腫瘤發生晚期階段出現惡變傾向。由于目前存在涎腺多形性腺瘤細胞培養困難、活體組織模型建立更加困難的問題，致使腫瘤的組織及形態發生機理、種植或復發機理難以取得突破性進展。
發明內容
本發明的目的是提供一種組織工程化人涎腺多形性腺瘤活體組織模型的建立方法，以解決目前人涎腺多形性腺瘤不能建立活體組織模型的問題，為難以進行活體研究的良性腫瘤研究提供一種活體組織模型。本發明是這樣實現的一種組織工程化人涎腺多形性腺瘤活體組織模型的建立方法，包括以下步驟( I)材料與試劑的制備培養液1:取少量RPM1-1640培養液，加入15-20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U鏈霉素，混勻，加RPM1-1640補至IOOml ；培養液I1:取少量RPM1-1640培養液，加入5_10ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U鏈霉素，混勻，加RPM1-1640補至IOOml ；培養液II1:取少量RPM1-1640培養液，加入15_20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U鏈霉素、O. 25g透明質酸，混勻，加RPM1-1640補至IOOml ；處理液1:取少量RPM1-1640培養液，加入10-15ml胎牛血清、10000U青霉素、5000U鏈霉素，混勻，加RPM1-1640補足至IOOml ；處理液I1:取少量RPM1-1640培養液，加入15-20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U鏈霉素、Ig透明質酸，混勻，加RPM1-1640補至IOOml ；選擇脫細胞真皮基質、膠原凝膠、膠原海綿或聚乳酸中的一種作為支架材料，所述支架材料以緩沖液清洗2-4次，于所述處理液II中浸泡7-14天后，在0-4°C溫度下保存，得到經處理的支架材料；(2)原代培養(2-1)涎腺多形性腺瘤細胞原代培養患者手術取下的涎腺多形性腺瘤腫瘤組織，于所述處理液I中浸泡處理，取腫瘤組織塊，清洗2-3次之后，于所述培養液I中切成適于進行細胞培養的組織塊，置于培養瓶底部，培養瓶于CO2培養箱中倒置，使組織塊貼附于培養瓶底部，2小時后將培養瓶放正，加入所述培養液I，在CO2培養箱中繼續培養，24小時后 更換所述培養液I，此后每隔I天定期更換一次所述培養液I，18-22天后，得到原代培養的腫瘤細胞；(2-2)皮下纖維組織細胞原代培養來自同一患者的正常皮下纖維組織，于所述處理液I中浸泡處理，然后進行清洗，切成適于進行細胞培養的組織塊，置于培養瓶底部，力口入所述培養液II后，于CO2培養箱中培養，24小時后更換所述培養液II，此后每隔3天定期更換一次培養液II，15-19天后，得到原代培養的成纖維細胞；(3)傳代培養(3-1)涎腺多形性腺瘤細胞傳代培養所得到的原代培養的腫瘤細胞，棄去培養液，以緩沖液清洗2-3次，加消化液進行消化，倒置顯微鏡下觀察大部分細胞變圓時，加入所述培養液I終止消化，吹打后收集細胞懸液，離心棄上清后，加所述培養液I稀釋，然后按1: 3-4的比例分瓶后加入培養液I，置于CO2培養箱中進行培養，每隔I天更換所述培養液I 一次，進行腫瘤細胞傳代培養；在傳代培養過程中，采用反復貼壁法去除腫瘤細胞中的成纖維細胞；(3-2)成纖維細胞傳代培養所得到的原代培養的成纖維細胞，棄去培養液，以緩沖液清洗2-3次，加消化液進行消化，倒置顯微鏡下觀察大部分細胞變圓時，加入所述培養液II終止消化，吹打后收集細胞懸液，離心棄上清后，加所述培養液II稀釋，然后按1: 3-4的比例分瓶后加入所述培養液II，置于CO2培養箱中培養，每隔2天更換所述培養液II 一次，進行成纖維細胞傳代培養；( 4 )體外共同培養(4-1)將對數生長期的傳代培養的腫瘤細胞制成單細胞懸液，調整腫瘤細胞濃度為I X IO6個/ml，取Iml單細胞懸液，離心后棄上清，吸取離心管底細胞團塊接種于經處理的支架材料中央，于CO2培養箱中孵育，I小時后加入所述培養液III進行體外培養,每8小時更換所述培養液III一次，連續進行3-5天體外培養，得到腫瘤細胞支架組織；(4-2)將對數生長期的傳代培養的成纖維細胞制成單細胞懸液，調整成纖維細胞濃度為I X IO6個/ml，取O. 5ml單細胞懸液，離心后棄上清，吸取離心管底細胞團塊接種于所述腫瘤細胞支架組織中央，加入所述培養液III，在CO2培養箱中進行體外共同培養，每8小時更換所述培養液III一次，連續進行7-10天體外共同培養，得到共同培養的支架組織；(5)移植在對共同培養的支架組織進行組織學鑒定確認后，將共同培養的支架組織作為移植物移植入裸鼠背部皮下，連續飼養3-6個月后，建立組織工程化人涎腺多形性腺瘤活體組織模型。所述CO2培養箱的培養條件是培養溫度為37°C，CO2濃度為占空氣總量的5%，并在飽和濕度環境下。所述離心的操作條件是離心轉速為1200r/min，離心操作時間為5分鐘。所述清洗的操作步驟是先用O. OlM PBS緩沖液進行清洗，再用胎牛血清與RPM1-1640培養液的混合液進行清洗；所述混合液中的胎牛血清與RPM1-1640培養液的體積比為1: 5。所述緩沖液為PBS緩沖液、hanV s緩沖液或D-hanV s緩沖液中的一種。本發明的最大特點是運用組織工程學的方法和技術，建立起了人涎腺多形性腺瘤 的活體組織模型，該活體組織模型沒有模型中組織塊的消失或退化的問題，在腫瘤組織發生上與人多形性腺瘤沒有差異，在組織學表現上也沒有差異，因此，為人涎腺多形性腺瘤的研究提供一種有用的、可信的和可行的活體組織研究模型，為研究這類腫瘤的發病機制及探討各種創新治療方法提供了研究基礎，同時也為其他良性腫瘤的活體組織模型的建立，提供了一種可供借鑒的思路。
圖1是本發明的流程圖。圖2是所建立的組織工程化人涎腺多形性腺瘤活體組織模型的組織學觀察結果。圖3是所建立的組織工程化人涎腺多形性腺瘤活體組織模型的免疫組織化學染色觀察結果。
具體實施例方式參考圖1，本發明人涎腺多形性腺瘤活體組織模型的建立方法，包括以下步驟( I)材料與試劑的制備培養液I的制備取少量RPM1-1640培養液，加入20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U鏈霉素，混勻，加RPM1-1640補足至100ml。培養液II的制備取少量RPM1-1640培養液，加入IOml胎牛血清、1000U青霉素、1000U鏈霉素，混勻，加RPM1-1640補足至100ml。培養液III的制備取少量RPM1-1640培養液，加入20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U鏈霉素、O. 25g透明質酸，混勻，加RPM1-1640補足至100ml。處理液I的制備取少量RPM1-1640培養液，加入IOml胎牛血清、10000U青霉素、5000U鏈霉素，混勻，加RPM1-1640補足至100ml。處理液II的制備取少量RPM1-1640培養液，加入20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U鏈霉素、Ig透明質酸，混勻，加RPM1-1640補足至100ml。O. OlM PBS緩沖液的制備稱取KH2PO4 · H2OO. 27g,Na2HPO4 · 12H20 2. 85g,NaCl8. 50g,
KClO. 20g,加少量雙蒸水溶解后，繼續加入雙蒸水定容至1000ml，高壓滅菌，4°C保存。支架材料的處理脫細胞真皮基質(acellular dermal matrix,縮寫為ADM),在生物安全柜內，于無菌條件下將其切割成5X5X2mm3大小，用O. OlM PBS緩沖液浸洗3次后，在4° C溫度條件下浸泡于所述處理液II中7-14天。實驗動物4周齡、雌性、16-17克的BALB/C_nu裸鼠，由中國醫學科學院實驗動物研究所提供。
組織來源人涎腺多形性腺瘤腫瘤組織取自外科手術切除的標本，并經兩名病理醫師診斷為涎腺多形性腺瘤，再取同一患者的正常皮下纖維組織，無菌、0-4°C條件下保存于含100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的RPM1-1640培養液中備用。(2)原代培養(2-1)涎腺多形性腺瘤細胞的原代培養將保存的涎腺多形性腺瘤標本取出，置于處理液I中浸泡15分鐘，去除腺瘤標本中的腺體組織、腫瘤包膜、血凝塊及壞死組織等，得到所需要的腫瘤組織塊，將腫瘤組織塊先用O. OlMPBS緩沖液進行清洗，再用胎牛血清與RPM1-1640培養液的混合液(胎牛血清與RPM1-1640培養液的體積比為1: 5)清洗，重復清洗3次后，置于培養液I中，將腫瘤組織塊切成適于細胞培養的I X I X Imm3大小的組織塊，置于25ml培養瓶的底部，將培養瓶倒置于CO2培養箱中靜置2小時(CO2培養箱培養的培養條件是溫度為37°C，CO2濃度為占空氣總量的5%，并在飽和濕度環境下，下同)，使組織塊貼附于培養瓶的底部，然后將培養瓶放正，加入培養液I，在CO2培養箱中繼續培養，24小時后更換培養液I 一次，此后每隔I天定期更換培養液I 一次，18-22天后，得到原代培養的腫瘤細胞。在組織塊培養7-9天之后，倒置顯微鏡下觀察，可以看到組織塊周圍長出一小片細胞，稱之為“細胞暈”，隨腫瘤細胞不斷的分裂生長，“細胞暈”的面積逐漸擴大，與相鄰的“細胞暈”逐漸融合；培養到18-22天，“細胞暈”融合率可達80-90%，顯微鏡下觀察顯示，大部分腫瘤細胞呈多邊形或短梭狀，小部分腫瘤細胞成長梭狀。(2-2)皮下纖維組織細胞的原代培養來自于同一患者的皮下纖維組織，置于處理液I中浸泡15分鐘后，先用O. OlMPBS緩沖液進行清洗，再用體積比為1: 5的胎牛血清與RPM1-1640培養液的混合液清洗，重復清洗3次后，切成適于細胞培養的IX Imm2大小的組織塊，置于25ml培養瓶中，加入培養液II，于37° C、5%C02、飽和濕度的CO2培養箱中培養，24小時后更換培養液II 一次，此后每隔3天定期更換培養液II 一次，15-19天后，得到原代培養的成纖維細胞。在組織塊培養12-14天后，倒置顯微鏡下觀察，可以看到組織塊周圍細胞游出，細胞胞體較大，成梭形或不規則形；培養至15-19天左右時，“細胞暈”融合率達80-90%，此時細胞細長，排列成放射狀或漩渦狀。(3)傳代培養(3-1)涎腺多形性腺瘤細胞的傳代培養用通過步驟(2-1)得到的原代培養的腫瘤細胞，棄去培養液I，以O. OlM PBS緩沖液清洗三次后，加入消化液消化，倒置顯微鏡下觀察大部分細胞變圓時，加入培養液I終止消化，吹打后收集細胞懸液，于1200r/min條件下離心5分鐘，棄上清，加入培養液I進行稀釋，然后按1: 3的比例分瓶后，加入培養液I，置于37° C、5%C02、飽和濕度的CO2培養箱中培養，每隔I天更換培養液I 一次，進行腫瘤細胞的傳代培養。本步驟所用到的消化液是O. 25%的胰蛋白酶與O. 02%的EDTA的混合液，混合液中的O. 25%的胰蛋白酶和O. 02%的EDTA的體積比為1:1。傳代后48小時左右時，細胞開始貼壁生長，此時細胞多數呈多邊形，部分短梭狀細胞變為圓形或橢圓形。在傳代培養過程中，采用反復貼壁法去除腫瘤細胞中混雜的成纖維細胞，其具操作過程如下在腫瘤細胞傳代培養過程中，每隔3-6天，倒去舊培養液I后，在更換新的培養液I之前，先將所培養的腫瘤細胞用hank' s緩沖液清洗3次，然后加入消化液(體積比為I I的O. 2%EDTA和O. 25%胰蛋白酶混合液)，37°C條件下消化10分鐘。顯微鏡下檢查，可 見成纖維細胞成圓形，腫瘤細胞維持原狀，消化完畢后吸出消化液,加hanV s緩沖液吹打細胞，使成纖維細胞脫落后吸出，腫瘤細胞用hanV s緩沖液輕輕漂洗3次，加入新培養液I繼續培養。(3-2)成纖維細胞的傳代培養用通過步驟(2-2)得到的原代培養的成纖維細胞，棄去培養液II，以O. OlM PB S緩沖液清洗三次后，加入消化液消化，倒置顯微鏡下觀察大部分細胞變圓時，加入培養液II終止消化，吹打后收集細胞懸液，于1200r/min條件下離心5分鐘，棄上清，加入培養液II進行稀釋，然后按1: 4的比例分瓶后，加入培養液II，置于37° C、5%C02、飽和濕度的CO2培養箱中培養，每隔2天更換培養液II 一次，進行成纖維細胞的傳代培養。本步驟所用到的消化液是O. 25%的胰蛋白酶與O. 02%的EDTA的混合液，混合液中的O. 25%的胰蛋白酶和O. 02%的EDTA的體積比為1:1。傳代后24小時左右時，細胞開始貼壁生長，此時細胞多為長梭形，可見線狀細胞關起。( 4 )體外共同培養(4-1)傳代培養的腫瘤細胞生長至第3-4代時，到達對數生長期。按常規方法將對數生長期的腫瘤細胞制成單細胞懸液，調整腫瘤細胞濃度為I X IO6個/ml，取Iml單細胞懸液于1200r/min條件下離心5分鐘，棄上清后，吸取離心管底細胞團塊接種于經處理的支架材料中央，置于37° C、5%C02、飽和濕度的CO2培養箱中孵育I小時后，加入培養液III在CO2培養箱中繼續培養，每8小時更換培養液III一次，連續進行3天體外培養，得到腫瘤細胞支架組織。(4-2)傳代培養的成纖維細胞生長至第3-4代時，到達對數生長期。按常規方法將對數生長期的成纖維細胞制成單細胞懸液，調整成纖維細胞濃度為I X IO6個/ml，取O. 5ml單細胞懸液于1200r/min條件下離心5分鐘后棄上清，吸取離心管底細胞團塊接種于所述腫瘤細胞支架組織中央，加入培養液III，在CO2培養箱中進行體外共同培養，每8小時更換培養液III一次，連續進行7天的體外共同培養，得到共同培養的支架組織。成纖維細胞在生長過程中，可以分泌多種細胞外基質及生長因子，為腫瘤細胞的生長以及為進而形成的組織塊提供營養。(5)在對共同培養的支架組織進行組織學鑒定確認后，在SPF動物室內，將共同培養的支架組織作為移植物移植入裸鼠背部皮下，術后裸鼠繼續在SPF條件下飼養3個月，SP建成組織工程化人涎腺多形性腺瘤活體組織模型。(6)移植術后3個月，在動物全麻狀態下取出移植物，對所建立的組織模型進行組織學檢查及免疫組織化學染色觀察，通過觀察可見在組織模型的表面有毛細血管生長，移植物由植入前相對松散的組織塊變為實性團塊，生長的腫瘤呈類圓形，周圍可見纖維包膜包繞，組織學顯示其具有涎腺多形性腺瘤典型的組織學特征，腫瘤細胞呈梭形、多邊形或圓形，HE染色觀察，可見雙導管結構(圖2);免疫組織化學染色觀察，可見雙導管結構外層細胞S-100蛋白染色陽性(圖3)。以上為以人涎腺多形性腺瘤為例給出的組織工程化涎腺多形性腺瘤活體組織模型的建立方法，涎腺多形性腺瘤屬于良性腫瘤的一種，由于其具有一般良性腫瘤尤其是臨 界瘤所具有的一般特點，因此以上實施例所給出的方法也為其他類型的良性腫瘤的活體組織模型的建立提供了可供借鑒的方法和思路。
權利要求
1.一種組織工程化人涎腺多形性腺瘤活體組織模型的建立方法，其特征是，包括以下步驟(1)材料與試劑的制備培養液1:取少量RPM1-1640培養液，加入15-20ml胎牛血清、IOOOU青霉素、1000U鏈霉素，混勻，加RPM1-1640補至IOOml ；培養液I1:取少量RPM1-1640培養液，加入5-10ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U鏈霉素，混勻，加RPM1-1640補至IOOml ；培養液II1:取少量RPM1-1640培養液，加入15-20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U鏈霉素、O. 25g透明質酸，混勻，加RPM1-1640補至IOOml ；處理液1:取少量RPM1-1640培養液，加入10-15ml胎牛血清、10000U青霉素、5000U鏈霉素，混勻，加RPM1-1640補足至IOOml ；處理液I1:取少量RPM1-1640培養液，加入15_20ml胎牛血清、1000U青霉素、1000U鏈霉素、Ig透明質酸，混勻，加RPM1-1640補至IOOml ；選擇脫細胞真皮基質、膠原凝膠、膠原海綿或聚乳酸中的一種作為支架材料，所述支架材料以緩沖液清洗2-4次，于所述處理液II中浸泡7-14天后，在0-4°C溫度下保存，得到經處理的支架材料；(2)原代培養(2-1)涎腺多形性腺瘤細胞原代培養患者手術取下的涎腺多形性腺瘤腫瘤組織，于所述處理液I中浸泡處理，取腫瘤組織塊，清洗2-3次之后，于所述培養液I中切成適于進行細胞培養的組織塊，置于培養瓶底部，培養瓶于CO2培養箱中倒置,使組織塊貼附于培養瓶底部，2小時后將培養瓶放正，加入所述培養液I，在CO2培養箱中繼續培養，24小時后更換所述培養液I，此后每隔I天定期更換一次所述培養液I，18-22天后，得到原代培養的腫瘤細胞；(2-2)皮下纖維組織細胞原代培養來自同一患者的正常皮下纖維組織，于所述處理液 I中浸泡處理，然后進行清洗，切成適于進行細胞培養的組織塊，置于培養瓶底部，加入所述培養液II后，于CO2培養箱中培養，24小時后更換所述培養液II，此后每隔3天定期更換一次培養液II，15-19天后，得到原代培養的成纖維細胞；(3)傳代培養(3-1)涎腺多形性腺瘤細胞傳代培養所得到的原代培養的腫瘤細胞，棄去培養液， 以緩沖液清洗2-3次，加消化液進行消化，倒置顯微鏡下觀察大部分細胞變圓時，加入所述培養液I終止消化，吹打后收集細胞懸液，離心棄上清后，加所述培養液I稀釋，然后按 I 3-4的比例分瓶后加入培養液I，置于CO2培養箱中進行培養，每隔I天更換所述培養液I 一次，進行腫瘤細胞傳代培養；在傳代培養過程中，采用反復貼壁法去除腫瘤細胞中的成纖維細胞；(3-2)成纖維細胞傳代培養所得到的原代培養的成纖維細胞，棄去培養液，以緩沖液清洗2-3次，加消化液進行消化，倒置顯微鏡下觀察大部分細胞變圓時，加入所述培養液II 終止消化，吹打后收集細胞懸液，離心棄上清后，加所述培養液II稀釋，然后按1: 3-4的比例分瓶后加入所述培養液II，置于CO2培養箱中培養，每隔2天更換所述培養液II 一次，進行成纖維細胞傳代培養；(4)體外共同培養(4-1)將對數生長期的傳代培養的腫瘤細胞制成單細胞懸液，調整腫瘤細胞濃度為 I X IO6個/ml，取Iml單細胞懸液，離心后棄上清，吸取離心管底細胞團塊接種于經處理的支架材料中央，于CO2培養箱中孵育，I小時后加入所述培養液III,在CO2培養箱中進行體外培養，每8小時更換所述培養液III一次，連續進行3-5天體外培養，得到腫瘤細胞支架組(4-2)將對數生長期的傳代培養的成纖維細胞制成單細胞懸液，調整成纖維細胞濃度為I X IO6個/ml，取O. 5ml單細胞懸液，離心后棄上清，吸取離心管底細胞團塊接種于所述腫瘤細胞支架組織中央，加入所述培養液III，在CO2培養箱中進行體外共同培養，每8小時更換所述培養液III一次，連續進行7-10天體外共同培養，得到共同培養的支架組織；(5)移植在對共同培養的支架組織進行組織學鑒定確認后，將共同培養的支架組織作為移植物移植入裸鼠背部皮下，連續飼養3-6個月后，建立組織工程化人涎腺多形性腺瘤活體組織模型。
2.根據權利要求1所述的組織工程化人涎腺多形性腺瘤活體組織模型的建立方法，其特征是，所述CO2培養箱的培養條件是培養溫度為37°C，在空氣中含有5%的CO2,并在飽和濕度環境下。
3.根據權利要求1所述的組織工程化人涎腺多形性腺瘤活體組織模型的建立方法，其特征是，所述離心的操作條件是離心轉速為1200r/min,離心操作時間為5分鐘。
4.根據權利要求1所述的組織工程化人涎腺多形性腺瘤活體組織模型的建立方法， 其特征是，所述清洗的操作步驟是先用O. OlM PBS緩沖液進行清洗，再用胎牛血清與 RPM1-1640培養液的混合液進行清洗；所述混合液中的胎牛血清與RPM1-1640培養液的體積比為1: 5。
5.根據權利要求1所述的組織工程化人涎腺多形性腺瘤活體組織模型的建立方法，其特征是，所述緩沖液為PBS緩沖液、hanV s緩沖液或D-hanV s緩沖液中的一種。
全文摘要
本發明公開了一種組織工程化人涎腺多形性腺瘤活體組織模型的建立方法，其包括以下步驟取自同一患者的涎腺多形性腺瘤腫瘤組織和正常皮下纖維組織細胞分別經原代培養和傳代培養后，于相同的培養液中在支架組織上進行體外共同培養，然后移植于裸鼠背部皮下，以建立腫瘤的活體組織模型。該方法運用組織工程學的方法和技術建立了人涎腺多形性腺瘤活體組織模型，為研究人涎腺多形性腺瘤的發病機制及探討各種創新治療方法，提供了研究基礎，同時也為其他類型的良性腫瘤的活體組織模型的建立提供了可供借鑒的方法和思路。
文檔編號A01K67/027GK103013921SQ201210570059
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月25日 優先權日2012年12月25日
發明者任貴云, 王潔, 董福生, 張艷寧 申請人:河北醫科大學口腔醫學院