專利名稱：歐洲鵝耳櫪的組培快繁方法
技術領域：
本發明涉及一種歐洲鵝耳櫪的組培快繁方法，屬于植物組織培養領域。
背景技術：
歐洲鵝耳櫪(Carpinus be tulus )又名西洋千金榆，落葉喬木，屬于樺木科(Betulaceae)鵝耳櫪屬iCarpinusL.),主要分布在歐洲、伊朗、土耳其。其枝葉濃密,株型緊湊、葉型秀麗，秋色葉金黃，果穗奇特，頗為美觀，是道路、城市綠地和四旁綠化的良好樹種。另外，其多分枝，極耐修剪，可以通過人工整形形成各種造型，用以豐富植物景觀，如在早期的英國和美國花園中常修剪成綠籬。又因其抗寒性強，抗風力強，適應性廣，少病蟲害，為我國東部沿海城市園林綠化及荒山造林的理想樹種。歐洲鵝耳櫪幼葉含有抗癌物質正受到越來越多的研究，其材質也相當堅硬可以制造地板、樂器、車削及各種工具的手柄等，也可以制造成高質量的木炭。故要加快歐洲鵝耳櫪引種與應用的步伐，使之能廣泛地在我國的工業、城市林業、園林綠化及荒山造林中得以推廣應用，市場前景十分廣闊。目前，歐洲鵝耳櫪主要通過種子繁殖，但種子成熟后，外部會形成堅硬的外殼，影響種子的發芽率，致使發芽率較低。通過層積處理可以促進種子的發芽，但層積的時間較長，且經過層積處理種子的發芽率仍然較低。歐洲鵝耳櫪扦插很難生根，黃化和燙漂、綁扎處理能提高其扦插生根率，但生根率仍然較低。歐洲鵝耳櫪的組培快繁研究在過去鮮有報道，僅個別學者利用莖段和頂芽作為外植體對歐洲鵝耳櫪進行離體快速繁殖獲得了完整植株，但為歐洲鵝耳櫪的工廠化育苗奠定了一定的理論基礎，不過離工廠化育苗還有一定的差距。
發明內容
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本發明的主要目的是克服歐洲鵝耳櫪組織培養過程中，不定芽難以誘導、成活率和繁殖系數低的不足，提供一種歐洲鵝耳櫪的組織培養快速繁殖方法。本發明的技術解決方案:一種歐洲鵝耳櫪的組培快繁方法，其特征是該方法包括如下工藝步驟:
1)選擇生長飽滿的莖尖，表面消毒后接種在含0.5^10.0mg/L 6-芐基氨基嘌呤的WPM基本培養基上進行不定芽誘導培養，培養基中還包含6.5g/L瓊脂粉和30.0g/L蔗糖；
2)待不定芽長出后，剪取1.5 2.0cm莖尖在附加0.f 2.0mg/L的6-芐基氨基嘌呤，0.Γ2.0mg/L的激動素，(T0.5mg/L的吲哚丁酸植物激素MS基本培養基上進行增殖培養；
3)剪取生長健壯、長3 4cm的單苗進行生根培養，基本培養基大量元素減少1/2，其他元素保持不變，簡稱1/2基本培養基；附加(Tl.0 mg/L吲哚丁酸，(Tl.0mg/的萘乙酸；培養溫度為25±2°C，pH 5.8 6.0，光照12h/天，光照強度為2000 Ix ；
4)當單苗根長到3飛cm時，將生根試管苗的瓶口封口膜打開，在培養室散射光下進行開口煉苗，使試管苗逐漸與外界接觸，在I周內將周圍環境濕度保持在70% 80%，逐步提高小苗適應外界環境的能力；5天后取出試管苗洗凈根部的培養物質，移栽到育苗基質中生長，基質由珍珠巖、泥炭土、園土的重量比為2:2:1組成，充分混合后用多菌靈消毒。本發明的有益效果:解決了歐洲鵝耳櫪組培過程中新芽不易啟動、成活率和繁殖系數低的問題，通過培養基組分的調整，誘導了歐洲鵝耳櫪產生大量不定芽和較高的生根率，移栽后成活率高達85%，提供了一種歐洲鵝耳櫪的組織培養快速繁殖方法，對于歐洲鵝耳櫪的工廠化育苗具有重要意義。
具體實施例方式一種歐洲鵝耳櫪的組培快繁方法，包括如下工藝步驟:
O選擇生長飽滿的莖尖，表面消毒后放在含0.5 10.0mg/L 6-芐基氨基嘌呤(benzyIaminopurine,簡稱BA)進行誘導培養,基本培養基是WPM (Woody Plant Medium,簡稱 WPM)，主要包含以下成分:NH4NO3 400mg/L、Ca (NO3) 2.4Η20 556mg/L、CaCl2.2Η20 96mg/L、MgSO4.7Η20 370mg/L,KH2PO4 170mg/L,K2SO4 990mg/L,H3BO3 6.2mg/L、MnS04.Η20 17.7mg/L、ZnSO4.7H20 8.6mg/L、NaMoO4.2H20 0.25mg/L、CuSO4.5H20 0.25mg/L、FeSO4.7H20 27.8mg/UNa2-EDTA 37.3mg/L、肌醇 100mg/L、甘氨酸 2mg/L、煙酸 0.5mg/L、煙酸硫胺素 1.0mg/L、鹽酸吡哆醇0.5mg/L ;基本培養基還包含6.5g/L的瓊脂粉和30.0g/L蔗糖。2)待不定芽誘導長出后，1.5 2.0cm莖尖進行增殖培養，基本培養基是MS (Murashige and Skoog,簡稱MS)；附加0.1 2.0mg/L 的6-節基氛基嘿呤(benzyIaminopurine,簡稱 BA), 0.1 2.0mg/L 的激動素(kinetin,簡稱 KT), O 0.5mg/L 的口引哚丁酸(indole butyric acid,簡稱IBA)植物激素；還包含6.0g/L的瓊脂粉和30.0g/L 的蔗糖；主要包含以下成分:=NH4NO3 1650mg/L、KNO3 1900mg/L、MgSO4.7H20 370mg/L、KH2PO4 170mg/L、CaCl2.2H20 440 mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4.4H20 22.3mg/L、ZnSO4.7H20 8.6mg/L、NaMoO4.2H20 0.25mg/L、CuSO4.5H20 0.025mg/L、CoCl2.6H200.025mg/L、FeSO4.7H20 27.8mg/L、Na2-EDTA 37.25mg/L、肌醇 100mg/L、甘氨酸 2mg/L、煙酸0.5mg/L、鹽酸批卩多醇0 .5mg/L、鹽酸硫胺素0.1 mg/L。3)剪取生長健壯、長3 4cm的單苗進行生根培養，基本培養基為1/2WPM (WPM培養基大量元素減少1/2，其他元素保持不變，簡稱1/2WPM)培養基，主要包含以下成分=NH4NO3200mg/L、Ca (NO3)2.4H20 278mg/L、CaCl2.2H20 48mg/L、MgSO4.7H20 185mg/L、KH2P04 85mg/UK2SO4 495mg/L, H3BO3 6.2mg/L、MnS04.H2O 17.7mg/L、ZnSO4.7H20 8.6mg/L、NaMoO4.2H200.25mg/L、CuSO4.5H20 0.25mg/L、FeSO4.7H20 27.8mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、肌醇 IOOmg/L、甘氨酸2mg/L、煙酸0.5mg/L、煙酸硫胺素1.0mg/L、鹽酸批P多醇0.5mg/L ;附加(Tl.0 mg/L 口引哚丁酸(indole butyric acid,簡稱 ΙΒΑ),0 1.0mg/的萘乙酸(naphthylene aceticacid，簡稱NAA);還包含6.5g/L瓊脂粉和15.0g/L的蔗糖，pH 5.8 6.0，光照12h/d，光照強度為2000 Ix0培養至60天時統計其增殖倍數、平均株高、生根率、平均根數和平均根長。當根長到:T5cm時，將生根試管苗的瓶口封口膜打開，在培養室散射光下進行開口煉苗，使試管苗逐漸與外界接觸，在I周內將周圍環境濕度保持在709Γ80%，逐步提高小苗適應外界環境的能力。5d后取出試管苗洗凈根部的培養物質，移栽到育苗基質中生長，基質由珍珠巖、泥炭土、園土 2:2:1組成，充分混合后用多菌靈消毒。選取生長飽滿的莖 尖，表面消毒后接種在誘導培養基上；培養4周統計誘導率。剪取1.5 2.0cm莖段接種于增殖培養基上，60天統計增殖倍數。剪取生長健壯、長3 4cm的單苗接種于生根培養基上誘導生根。培養50天統計生根率、平均根數和平均根長。當根長到3 5cm時進行煉苗移栽，30天后，調查其移栽成活率。實施例1
選取生長飽滿的莖尖，表面消毒后接種在附加0.5mg/L BA的誘導培養基上；基本培養基為WPM，基本培養基還包含6.5g/L瓊脂粉和30.0g/L的蔗糖。待不定芽長出，剪取1.5 2.0cm莖段進行增殖，基本培養基是MS ;附加的植物激素為0.lmg/L的BA、0.5mg/L的KT和0.0 lmg/L的IBA ;還包含6.0g/L的瓊脂粉和30.0g/L的蔗糖。60天統計增殖倍數。剪取生長健壯、長:T4cm的單苗進行生根培養，基本培養基為1/2WPM ;附加的植物激素為0.0 lmg/L的NAA,0.5mg/L的IBA ;還包含6.5g/L的瓊脂粉和15.0g/L的蔗糖，PH 5.8 6.0，光照12h/d，光照強度為2000 Ix0 60天后統計增殖倍數、平均株高、生根率、平均根數和平均根長。結果表明每個外植體平均分化2.86個不定芽，平均芽長達3.25cm ;生根率達56.8%，平均根數達2.95，平均根長達4.48cm。將生根試管苗的瓶口封口膜打開，在培養室散射光下進行開口煉苗，使試管苗逐漸與外界接 觸，在I周內將周圍環境濕度保持在70°/Γ80%，逐步提高小苗適應外界環境的能力。5d后取出試管苗洗凈根部的培養物質，移栽到育苗基質中生長，基質由珍珠巖、泥炭土、園土 2:2:1組成，充分混合后用多菌靈消毒，成活率達70%。實施例2
選取生長飽滿的莖尖，表面消毒后接種在附加2.0mg/L BA的誘導培養基上；基本培養基為WPM，基本培養基還包含6.5g/L瓊脂粉和30.0g/L的蔗糖。待不定芽長出，剪取1.5 2.0cm莖段進行增殖，基本培養基是MS ;附加的植物激素為1.0mg/L的BA、2.0mg/L的KT和0.0 lmg/L的IBA ;還包含6.0g/L的瓊脂粉和30.0g/L的蔗糖。60天統計增殖倍數。剪取生長健壯、長3 4cm的單苗進行生根培養，基本培養基為1/2WPM ;附加的植物激素為0.5mg/L的NAA,0.5mg/L的IBA ;還包含6.5g/L的瓊脂粉和15.0g/L的蔗糖，PH 5.8 6.0，光照12h/d，光照強度為2000 Ix0 60天后統計增殖倍數、平均株高、生根率、平均根數和平均根長。結果表明每個外植體平均分化2.54個不定芽，平均芽長達3.89cm ;生根率達65.8%，平均根數達2.35，平均根長達3.08cm。將生根試管苗的瓶口封口膜打開，在培養室散射光下進行開口煉苗，使試管苗逐漸與外界接觸，在I周內將周圍環境濕度保持在70°/Γ80%，逐步提高小苗適應外界環境的能力。5d后取出試管苗洗凈根部的培養物質，移栽到育苗基質中生長，基質由珍珠巖、泥炭土、園土 2:2:1組成，充分混合后用多菌靈消毒，成活率達65%。實施例3
選取生長飽滿的莖尖，表面消毒后接種在附加1.0mg/L BA的誘導培養基上；基本培養基為WPM，基本培養基還包含6.5g/L瓊脂粉和30.0g/L的蔗糖。待不定芽長出，剪取1.5
2.0cm莖段進行增殖，基本培養基是MS ;附加的植物激素為1.0 mg/L的BA、0.5mg/L的KT和
0.5mg/L的IBA ;還包含6.0g/L的瓊脂粉和30.0g/L的蔗糖。60天統計增殖倍數。剪取生長健壯、長3 4cm的單苗進行生根培養，基本培養基為1/2WPM ;附加的植物激素為0.0lmg/L的NAA ;還包含6.5g/L的瓊脂粉和15.0g/L的蔗糖，PH 5.8 6.0，光照12h/d，光照強度為2000 Ix0 60天后統計增殖倍數、平均株高、生根率、平均根數和平均根長。結果表明每個外植體平均分化4.06個不定芽，平均芽長達3.87cm ;生根率達76.8%，平均根數達3.65，平均根長達3.76cm。將生根試管苗的瓶口封口膜打開，在培養室散射光下進行開口煉苗，使試管苗逐漸與外界接觸，在I周內將周圍環境濕度保持在709Γ80%，逐步提高小苗適應外界環境的能力。5d后取出試管苗洗凈根部的培養物質，移栽到育苗基質中生長，基質由珍珠巖、泥炭土、園土 2:2:1組成， 充分混合后用多菌靈消毒，移栽成活率高達85%。
權利要求
1.一種歐洲鵝耳櫪的組培快繁方法，其特征是該方法包括如下工藝步驟: 1)選擇生長飽滿的莖尖，表面消毒后接種在含0.5^10.0mg/L 6-芐基氨基嘌呤的WPM基本培養基上進行不定芽誘導培養，培養基中還包含6.5g/L瓊脂粉和30.0g/L蔗糖； 2)待不定芽長出后，剪取1.5 2.0cm莖尖，在附加0.f 2.0mg/L的6-芐基氨基嘌呤，0.Γ2.0mg/L的激動素，(T0.5mg/L的吲哚丁酸植物激素的MS基本培養基上進行增殖培養; 3)剪取生長健壯、長:T4cm的單苗進行生根培養，WPM基本培養基大量元素減少1/2，其他元素保持不變，簡稱1/2WPM基本培養基；附加(Tl.0 mg/L吲哚丁酸，(Tl.0mg/的萘乙酸；培養溫度為25±2°C，pH 5.8 6.0，光照12h/天，光照強度為2000 Ix ； 4)當單苗根長到3 5cm時，將生根試管苗的瓶口封口膜打開，在培養室散射光下進行開口煉苗，使試管苗逐漸與外界接觸，在I周內將周圍環境濕度保持在70°/Γ80%，逐步提高小苗適應外界環境的能力；5天后取出試管苗洗凈根部的培養物質，移栽到育苗基質中生長，基質由珍珠巖、泥炭土、園土的重量比為2:2:1組成，充分混合后用多菌靈消毒。
2.根據權利要求1所述的歐洲鵝耳櫪的組織培養方法，其特征是:步驟I)中的WPM基本培養基主要包含以下成分=NH4NO3 400mg/L、Ca(NO3)2.4H20 556mg/L、CaCl2.2H20 96mg/UMgSO4.7Η20 370mg/L,KH2PO4 170mg/L,K2SO4 990mg/L,H3BO3 6.2mg/L、MnS04.H2O 17.7mg/L、ZnSO4.7H20 8.6mg/L、NaMoO4.2H20 0.25mg/L、CuSO4.5H20 0.25mg/L、FeSO4.7H2027.8mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、肌醇 100mg/L、甘氨酸 2mg/L、煙酸 0.5mg/L、鹽酸硫胺素`1.0mg/L、鹽酸吡哆醇0.5mg/L ;步`驟2)中的MS基本培養基中還包含6.0g/L瓊脂粉和30.0g/L 的蔗糖；主要包含以下成分:NH4N03 1650mg/L、KN03 1 900mg/L、MgSO4.7H20 370mg/UKH2PO4 170mg/L、CaCl2.2H20 440 mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4.4H20 22.3mg/L、ZnSO4.7H20 8.6mg/L、NaMoO4.2H20 0.25mg/L、CuSO4.5H20 0.025mg/L、CoCl2.6H20`0.025mg/L、FeSO4.7H20 27.8mg/L、Na2-EDTA 37.25mg/L、肌醇 100mg/L、甘氨酸 2mg/L、煙酸0.5mg/L、鹽酸批P多醇0.5mg/L、鹽酸硫胺素0.1 mg/L。
3.根據權利要求1所述的歐洲鵝耳櫪的組織培養方法，其特征是:步驟3)中的1/2WPM基本培養基，主要包含以下成分=NH4NO3 200mg/L、Ca(NO3)2.4H20 278mg/L、CaCl2.2H2048mg/L、MgSO4.7H20 185mg/L、KH2PO4 85mg/L、K2SO4 495mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4.H2O`17.7mg/L、ZnS04.7Η20 8.6mg/L,NaMoO4.2Η20 0.25mg/L、CuS04.5Η20 0.25mg/L、FeS04.7Η20`27.8mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、肌醇 100mg/L、甘氨酸 2mg/L、煙酸 0.5mg/L、煙酸硫胺素`1.0mg/L、鹽酸批卩多醇0.5mg/L ;附力口 0 1.0 mg/L卩引哚丁酸,(Tl.0mg/的萘乙酸；還包含`6.5g/L瓊脂粉和15.0g/L的蔗糖，PH 5.8 6.0，光照12h/d，光照強度為2000 Ix ;培養至60天時統計其增殖倍數、平均株高、生根率、平均根數和平均根長；當根長到3飛cm時，將生根試管苗的瓶口封口膜打開，在培養室散射光下進行開口煉苗，使試管苗逐漸與外界接觸，在I周內將周圍環境濕度保持在70°/Γ80%，逐步提高小苗適應外界環境的能力；5天后取出試管苗洗凈根部的培養物質，移栽到育苗基質中生長，基質由珍珠巖、泥炭土、園土 2:2:1組成，充分混合后用多菌靈消毒。
全文摘要
本發明涉及一種歐洲鵝耳櫪的組培快繁方法，其特征是包括如下工藝選取生長飽滿的莖尖，表面消毒后接種在誘導培養基上；培養4周統計誘導率。剪取1.5~2.0cm莖段接種于增殖培養基上，60天統計增殖倍數。剪取生長健壯、長3~4cm的單苗接種于生根培養基上誘導生根。培養50天統計生根率、平均根數和平均根長。當根長到3~5cm時進行煉苗移栽，30天后，調查其移栽成活率。本發明的優點能夠誘導歐洲鵝耳櫪試管苗快速增殖產生大量不定芽，成活率高達85%，為歐洲鵝耳櫪的工廠化育苗提供了一條有效的途徑。
文檔編號A01H4/00GK103181325SQ20131011056
公開日2013年7月3日 申請日期2013年4月1日 優先權日2013年4月1日
發明者祝遵崚, 金建邦, 徐惠群, 仲秀林 申請人:南京林業大學, 江蘇紫藤園藝綠化工程有限公司