專利名稱：一種草石蠶莖尖脫毒快繁技術的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種草石蠶脫毒繁殖技術，特別是涉及一種草石蠶莖尖脫毒快繁技術。
背景技術：
草石蠶sieboldii )為我國傳統蔬菜之一，具有廣闊的市場開發前景，其肉質根莖中含有的水蘇糖(80g/kgDM)，是一種能顯著促進雙歧桿菌增殖的功能性低聚糖，被譽為“超強雙歧因子”。傳統上，以根莖無性繁殖而致的病毒積累與傳播給生產帶來嚴重影響。進行離體誘導條件下的種苗生產，不僅能解決種性退化和病害蔓延的問題，而且能節約繁種用地。對草石蠶醫用、藥用及保健價值的不斷認識，有利的促進了草石蠶產業化的開發，加速了草石蠶種植業的發展，特別是在河北、河南、陜西等省草石蠶種植面積每年急劇增加，草石蠶傳統的栽培措施及單一的農家品種己難以滿足生產需要，而且病毒病的發生十分普遍，生產中急需對其栽培技術的研究與脫毒植株的種植應用，同時建立高效的再生體系以實現工廠化供苗，解決生產中草石蠶出苗率低(309Γ50%)，苗期長的問題。所查文獻“草石蠶不定芽誘導及高效增殖體系的建立”(張國裕等，《西北農林科技大學學報》)中研究了以草石蠶莖尖、葉片、莖段組織為外植體，不同激素配比對其不定芽誘導與增殖效果的影響，莖尖直接誘導較大不定芽再生率較低。文獻“草石蠶莖尖培養快繁及離體根狀莖的誘導”(張國裕等，《園藝學報》)提到一種以草石蠶“二細一粗”品種為試材，選用理想培養基后成苗率為74%
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種草石蠶莖尖脫毒快繁技術。本發明的技術方案概述如下:
一種草石蠶莖尖脫毒快繁技術，由如下步驟組成:
(I)草石蠶根莖的啟動培養:以大田中栽培的草石蠶地下部根狀莖為外植體，用
0.05-0.15%的升汞消毒10-30min，然后接種在附加各種不同激素種類及配比的MS培養基上進行啟動培養，培養基組成為MS+6-BA (0.5-2.0 mg/L )+ NAA (0.05-0.30 mg/L)，通過根莖上的腋芽可以直接誘導不定芽。(2)草石蠶不定芽的增殖培養:通過根莖上的腋芽先誘導出不定芽芽團，將不定芽芽團切割下來進行增殖培養，培養基組成為MS+6-BA (3.0-5.0 mg/L)+ GA3 (0.5-2.0 mg/L);不定芽伸長培養基為 MS+6-BA (0.5-3.0mg/L) + NAA (0.2-1.0 mg/L) + GA3 (0.5-2.0mg/L)ο(3)莖尖剝離和接種:取上述無菌試管苗帶莖尖切段，放在帶濾紙的培養皿上，解剖鏡下剝去幼葉，切下帶葉原基的生長點(0.2-0.6mm)ο(4)草石蠶莖尖愈傷組織的培養:將上述剝離的莖尖接種到各種不同激素種類及濃度培養基上誘導愈傷組織，培養基組成為MS+6-BA (0.5- 3.0mg/L) + NAA (0.05-0.30mg/L)ο(5)愈傷組織不定芽的分化:將莖尖培養獲得的愈傷組織轉入不定芽誘導分化培養基上，進行不定芽的誘導培養，培養基組成為MS+6-BA (0.5- 3.0mg/L)+ NAA (0.05-0.30mg/L)+ GA (0.5-2.0 mg/L)。(6)脫毒苗的鑒定:應用目測法、指示植物法和血清鑒定(serologic test)等三種方法對脫毒效果進行檢測。(7)脫毒苗生根與移栽:待脫毒苗伸長到l-2cm時，切下，轉接于添加0.2-0.7mg/LNAA的MS培養基上，經7d左右即有根長出。待有7-8條根時，將發育良好的再生苗從培養瓶中取出，洗去附著的培養基，栽于盛有經過消毒處理的蛭石的營養缽中，加蓋塑料膜保持濕度和溫度。5-7d后逐漸通風煉苗，7d澆I次1/10MS營養液。(8)大田 定植。步驟(I)優選為:以大田中栽培的草石蠶地下部根狀莖為外植體，用0.1%的升汞消毒18min，然后接種在附加各種不同激素種類及配比的MS培養基上進行啟動培養，通過根莖上的腋芽可以直接誘導不定芽，培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L。步驟(2)優選為:通過根莖上的腋芽先誘導出不定芽芽團，將不定芽芽團切割下來進行增殖培養，增殖培養基為MS+6-BA4.5 mg/L+ GA3LO mg/L ;不定芽伸長培養基以MS+6-BA 1.5mg/L+ NAA 0.4 mg/L+ GA3L O mg/L。步驟(3)優選為:取上述無菌試管苗帶莖尖切段，放在帶濾紙的培養皿上，解剖鏡下剝去幼葉，切下帶葉原基的生長點(0.3-0.5mm)ο步驟(4)優選為:將上述剝離的莖尖接種到各種不同激素種類及濃度培養基上誘導愈傷組織，培養基組成為MS+6-BA 1.0mg/L+ NAA 0.1 mg/L，出愈率高，愈傷組織顏色新鮮。步驟(5)優選為:將莖尖培養獲得的愈傷組織轉入不定芽誘導分化培養基上，進行不定芽的誘導培養，培養基組成為MS+6-BA 1.0mg/L+ NM 0.1 mg/L+ GA 1.0 mg/L，不定芽發生率高達80%。步驟(6)優選為:應用目測法、指示植物法和血清鑒定(serologic test)等三種方法對脫毒效果進行了檢測，結果表明其脫毒率達到88%。步驟(7)優選為:待脫毒苗伸長到l_2cm時，切下，轉接于添加0.5mg/L NAA的MS培養基上，經7d左右即有根長出，生根率可達100%。待有7-8條根時，將發育良好的再生苗從培養瓶中取出，洗去附著的培養基，栽于盛有經過消毒處理的蛭石的營養缽中，加蓋塑料膜保持濕度和溫度。5-7d后逐漸通風煉苗，7d澆I次1/10MS營養液，成活率可達95%以上。本發明的有益效果是:
I)本發明以河北保定清苑縣傳統的農家品種試材，研究其離體快繁及莖尖脫毒培養的關鍵技術，不定芽發生率高達80%，探索出了草石蠶脫毒植株獲得的較優途徑并建立了植株再生快繁的最佳培養體系。2)本發明所涉及的草石蠶莖尖的脫毒快繁技術，脫毒率達到85%以上，對于減少草石蠶的病毒病危害，提高產量、質量，擴大繁殖系數解決種條的繁殖供應問題，具有重要意義。3)高效再生體系的建立及離體根狀莖的誘導為進一步進行基因轉化育種和進行草石蠶根狀莖形成、生長發育生理生化特性的研究奠定了基礎。
具體實施例方式本發明涉及一種草石蠶莖尖脫毒快繁技術，依序包括:1)草石蠶根莖的啟動培養；
2)草石蠶不定芽的增殖培養；3)莖尖剝離和接種；4)草石蠶莖尖愈傷組織的培養；5)愈傷組織不定芽的分化；6)脫毒苗的鑒定；7)脫毒苗生根與移栽；8)大田定植。本發明對于減少草石蠶的病毒病危害，提高產量、質量，擴大繁殖系數解決種條的繁殖供應問題，具有重要意義
下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。實施例1
一種草石蠶莖尖脫毒快繁技術，由如下步驟組成:
(I)草石蠶根莖的啟動培養:以大田中栽培的草石蠶地下部根狀莖為外植體，用0.12%的升汞消毒15min，然后接種在附加各種不同激素種類及配比的MS培養基上進行啟動培養，培養基組成為MS+6-BA 0.7 mg/L + NAA 0.15 mg/L，通過根莖上的腋芽可以直接誘導不 定芽。(2)草石蠶不定芽的增殖培養:通過根莖上的腋芽先誘導出不定芽芽團，將不定芽芽團切割下來進行增殖培養，培養基組成為MS+6-BA3.0mg/L+ GA30.5mg/L ;不定芽伸長培養基為 MS+6-BA 0.8mg/L+ NAA 0.6 mg/L+ GA30.8 mg/L。(3)莖尖剝離和接種:取上述無菌試管苗帶莖尖切段，放在帶濾紙的培養皿上，解剖鏡下剝去幼葉，切下帶葉原基的生長點0.3mm。(4)草石蠶莖尖愈傷組織的培養:將上述剝離的莖尖接種到各種不同激素種類及濃度培養基上誘導愈傷組織，培養基組成為MS+6-BA 0.7mg/L+ NAA 0.15 mg/L，出愈率高，愈傷組織顏色新鮮。(5)愈傷組織不定芽的分化:將莖尖培養獲得的愈傷組織轉入不定芽誘導分化培養基上，進行不定芽的誘導培養，培養基組成為MS+6-BA 0.8mg/L+ NM 0.08 mg/L+ GA 0.8mg/L,不定芽發生率達78%。(6)脫毒苗的鑒定:應用目測法、指示植物法和血清鑒定(serologic test)等三種方法對脫毒效果進行檢測，脫毒率為85%。(7)脫毒苗生根與移栽:待脫毒苗伸長到l_2cm時，切下，轉接于添加0.3mg/L NAA的MS培養基上，經7d左右即有根長出，生根率達100%。待有7-8條根時，將發育良好的再生苗從培養瓶中取出，洗去附著的培養基，栽于盛有經過消毒處理的蛭石的營養缽中，加蓋塑料膜保持濕度和溫度。5-7d后逐漸通風煉苗，7d澆I次1/10MS營養液，成活率可達95%以上。。(8)大田定植。實施例2
一種草石蠶莖尖脫毒快繁技術，由如下步驟組成:
(I)草石蠶根莖的啟動培養:以大田中栽培的草石蠶地下部根狀莖為外植體，用0.1%的升汞消毒18min，然后接種在附加各種不同激素種類及配比的MS培養基上進行啟動培養，通過根莖上的腋芽可以直接誘導不定芽，培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L + NM 0.1 mg/L。(2)草石蠶不定芽的增殖培養:通過根莖上的腋芽先誘導出不定芽芽團，將不定芽芽團切割下來進行增殖培養，增殖培養基為MS+6-BA4.5 mg/L+ GA3LO mg/L ;不定芽伸長培養基以 MS+6-BA 1.5mg/L+ NAA 0.4 mg/L+ GA3LO mg/L。(3)莖尖剝離和接種:取上述無菌試管苗帶莖尖切段，放在帶濾紙的培養皿上，解剖鏡下剝去幼葉，切下帶葉原基的生長點0.4mm。(4)草石蠶莖尖愈傷組織的培養:將上述剝離的莖尖接種到各種不同激素種類及濃度培養基上誘導愈傷組織，培養基組成為MS+6-BA 1.0mg/L+ NAA 0.1 mg/L，出愈率高，愈傷組織顏色新鮮。(5)愈傷組織不定芽的分化:將莖尖培養獲得的愈傷組織轉入不定芽誘導分化培養基上，進行不定芽的誘導培養，培養基組成為MS+6-BA 1.0mg/L+ NAA 0.1 mg/L+ GA 1.0mg/L,不定芽發生率高達80%。(6)脫毒苗的鑒定:應用目測法、指示植物法和血清鑒定(serologic test)等三種方法對脫毒效果進行檢測，脫毒率為88%。(7)脫毒苗生根與移栽:待脫毒苗伸長到l_2cm時，切下，轉接于添加0.5mg/LNAA的MS培養基上，經7d左右即有根長出，生根率可達100%。待有7-8條根時，將發育良好的再生苗從培養瓶中取出，洗去附著的培養基，栽于盛有經過消毒處理的蛭石的營養缽中，力口蓋塑料膜保持濕度和溫度。5-7d后逐漸通風煉苗，7d澆I次1/10MS營養液，成活率可達95%以上。(8)大田定植 。實施例3
一種草石蠶莖尖脫毒快繁技術，由如下步驟組成:
(1)草石蠶根莖的啟動培養:以大田中栽培的草石蠶地下部根狀莖為外植體，用0.06%的升汞消毒25min，然后接種在附加各種不同激素種類及配比的MS培養基上進行啟動培養，通過根莖上的腋芽可以直接誘導不定芽，培養基為MS+6-BA 1.8 mg/L + NAA 0.25 mg/L0 (2)草石蠶不定芽的增殖培養:通過根莖上的腋芽先誘導出不定芽芽團，將不定芽芽團切割下來進行增殖培養，增殖培養基為MS+6-BA 5.0 mg/L+ GA3L 8 mg/L ;不定芽伸長培養基以 MS+6-BA 2.8mg/L+ NAA 1.0mg/L+ GA32.0 mg/L。(3)莖尖剝 離和接種:取上述無菌試管苗帶莖尖切段，放在帶濾紙的培養皿上，解剖鏡下剝去幼葉，切下帶葉原基的生長點0.5mm。(4)草石蠶莖尖愈傷組織的培養:將上述剝離的莖尖接種到各種不同激素種類及濃度培養基上誘導愈傷組織，培養基組成為MS+6-BA 2.5mg/L+ NAA 0.3 mg/L，出愈率高，愈傷組織顏色新鮮。(5)愈傷組織不定芽的分化:將莖尖培養獲得的愈傷組織轉入不定芽誘導分化培養基上，進行不定芽的誘導培養，培養基組成為MS+6-BA3.0mg/L+ NAA 0.3mg/L+ GA2.0mg/L,不定芽發生率高達77%。(6)脫毒苗的鑒定:應用目測法、指示植物法和血清鑒定(serologic test)等三種方法對脫毒效果進行檢測，脫毒率為86%。(7)脫毒苗生根與移栽:待脫毒苗伸長到l_2cm時，切下，轉接于添加0.7mg/LNAA的MS培養基上，經7d左右即有根長出，生根率可達100%。待有7-8條根時，將發育良好的再生苗從培養瓶中取出，洗去附著的培養基，栽于盛有經過消毒處理的蛭石的營養缽中，力口蓋塑料膜保持濕度和溫度。5-7d后逐漸通風煉苗，7d澆I次1/10MS營養液，成活率可達95%以上。(8)大田定植。·
權利要求
1.一種草石蠶莖尖脫毒快繁技術，其特征在于，包括以下步驟 I)草石蠶根莖的啟動培養以大田中栽培的草石蠶地下部根狀莖為外植體，用O.05-0. 15%的升汞消毒10-30min，然后接種在附加各種不同激素種類及配比的MS培養基上進行啟動培養；2)草石蠶不定芽的增殖培養通過根莖上的腋芽先誘導出不定芽芽團，將不定芽芽團切割下來進行增殖培養；3)莖尖剝離和接種取上述無菌試管苗帶莖尖切段，放在帶濾紙的培養皿上，解剖鏡下剝去幼葉，切下帶葉原基的生長點；4)草石蠶莖尖愈傷組織的培養將上述剝離的莖尖接種到各種不同激素種類及濃度培養基上誘導愈傷組織；5)愈傷組織不定芽的分化將莖尖培養獲得的愈傷組織轉入不定芽誘導分化培養基上，進行不定芽的誘導培養；6)脫毒苗的鑒定；7)脫毒苗生根與移栽；8)大田定植。
2.根據權利要求I所述的一種草石蠶莖尖脫毒快繁技術，其特征在于所述步驟I)為以大田中栽培的草石蠶地下部根狀莖為外植體，用O. 05-0. 15%的升萊消毒10-30min,然后接種在附加各種不同激素種類及配比的MS培養基上進行啟動培養，培養基組成為MS+6-BA(O. 5-2.0 mg/L )+ NAA (0.05-0. 30 mg/L)，通過根莖上的腋芽可以直接誘導不定芽。
3.根據權利要求I所述的一種草石蠶莖尖脫毒快繁技術，其特征在于所述步驟2)為通過根莖上的腋芽先誘導出不定芽芽團，將不定芽芽團切割下來進行增殖培養，培養基組成為 MS+6-BA (3. 0-5. O mg/L) + GA3 (O. 5-2. O mg/L);不定芽伸長培養基為 MS+6-BA(O. 5-3. Omg/L) + NAA (O. 2-1. O mg/L) + GA3 (O. 5-2. O mg/L)。
4.根據權利要求I所述的一種草石蠶莖尖脫毒快繁技術，其特征在于所述步驟3)為取上述無菌試管苗帶莖尖切段，放在帶濾紙的培養皿上，解剖鏡下剝去幼葉，切下帶葉原基的生長點(O. 2-0. 6mm)ο
5.根據權利要求I所述的一種草石蠶莖尖脫毒快繁技術，其特征在于所述步驟4)為將上述剝離的莖尖接種到各種不同激素種類及濃度培養基上誘導愈傷組織，培養基組成為MS+6-BA (O. 5- 3. Omg/L)+ NAA (O. 05-0. 30 mg/L)。
6.根據權利要求I所述的一種草石蠶莖尖脫毒快繁技術，其特征在于所述步驟5)為將莖尖培養獲得的愈傷組織轉入不定芽誘導分化培養基上，進行不定芽的誘導培養，培養基組成為 MS+6-BA (O. 5- 3. Omg/L) + NAA (O. 05-0. 30 mg/L) + GA (O. 5-2. O mg/L)。
7.根據權利要求I所述的一種草石蠶莖尖脫毒快繁技術，其特征在于所述步驟7)為待脫毒苗伸長到l_2cm時，切下，轉接于添加O. 2-0. 7mg/L NAA的MS培養基上，經7d左右即有根長出，待有7-8條根時，將發育良好的再生苗從培養瓶中取出，洗去附著的培養基，栽于盛有經過消毒處理的蛭石的營養缽中，加蓋塑料膜保持濕度和溫度，5-7d后逐漸通風煉苗，7d澆I次1/10MS營養液。
全文摘要
本發明涉及一種草石蠶莖尖脫毒技術，步驟包括1)草石蠶根莖的啟動培養；2)草石蠶不定芽的增殖培養；3)莖尖剝離和接種；4)草石蠶莖尖愈傷組織的培養；5)愈傷組織不定芽的分化；6)脫毒苗的鑒定；7)脫毒苗生根與移栽；8)大田定植。應用草石蠶莖尖脫毒技術，草石蠶種苗不定芽發生率、脫毒率和成活率均較高，可用于推廣種植擴大畝產量。
文檔編號A01H4/00GK103250637SQ20131011185
公開日2013年8月21日 申請日期2013年4月2日 優先權日2013年4月2日
發明者尚愛芹, 張金澤, 周志橋, 林靜, 高加濤, 段素芳, 侯曉慧, 桑若杰 申請人:河北農業大學, 中國食品發酵工業研究院