專利名稱：一種生物樣本玻璃化冷凍載體及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物樣品冷凍裝置領域，具體地，包括為輔助生殖技術領域中用于無菌玻璃化冷凍胚胎或卵細胞提供安全有效、操作簡易的密閉式冷凍載體。
背景技術：
在人工輔助生殖技術中，將體外受精后得到的多個胚胎或者從女性體內取出的多個卵子放入_196°C的液氮凍存，以供短期或長期的擇期胚胎移植，成為了提高體外受精、胚胎移植成功率的常用方法。玻璃化冷凍生物樣本其臨床意義在于在冷卻劑如液氮中可長期存儲，經冷卻劑凍存的胚胎或細胞會停止發育并可保存數十年，第二是凍存生物樣本在復溫后，可恢復一個或多個生物學意義上的活細胞。當常溫材料凍存時，常溫材料與極低溫冷卻劑，如液氮相遇時產生的萊頓弗羅斯特效應，會在凍存材料表面形成阻隔熱傳導汽膜，并減慢所需凍存材料的降溫速度，一般需增加冷凍保護劑濃度來防止生物樣本冷凍過程中冰晶化的形成，而高濃度冷凍保護劑對生物樣本具毒害性，導致復蘇后的細胞質量降低，因此，追求快速冷凍的玻璃化冷凍技術得到發展。目前，為了加快冷凍速率， 國內外玻璃化冷凍載體較普遍的都采用開放式，有拉伸麥管法、石英毛細管法、Cryoloop法、Cryotip法等。2005年，Kuwayama提出了通過最小化溶液體積提高冷卻速率的新方法一Cryotop法等，即將載有樣本的冷凍載體直接浸入液氮中。但由于生物樣本與液氮直接接觸，不能提供生物樣本儲存的無菌環境，存在交叉污染風險，且液氮對細胞的直接毒性作用也未可預測(Covo A, Domingo J, Perez S，etal.Vitrification:an effective new approach to oocyte banking and preservingfertility in cancer patients [J].Clin Transl Oncol，2008，10 (5): 268-273;封閉式麥管玻璃化冷凍法用于人早期胚胎冷凍效果觀察，山東醫藥2010年底50卷第15期；)，而新近的研究更表明，液氮中的低分子化合物對生物樣本具有毒性(YPanagiotidis, PVanderzwalmenj Y Prapasj E kasapi，et, al Open versus closed vitrification ofblastocysts from an oocyte-donation programme: a prospective randomized study.Reproductive BioMedicine Online, In Press, Uncorrected Proof，Mar2013)o 專利申請(200710192245.9)公開了一種阻止外源病源性物質污染生物樣本的密封型玻璃化冷凍裝置，但盡管做到了與冷卻劑隔離的封閉體系，但由于需要熱塑封閉等各種步驟，該類型的冷凍載體的操作仍顯復雜。因此，本領域迫切需要開發一種玻璃化冷凍效率高、操作方便、安全無毒的生物樣品密閉式冷凍裝置。
發明內容
本發明提供的高效玻璃化冷凍且操作簡易的生物樣本密閉保存裝置。本發明提供了一種生物樣本玻璃化冷凍載體，所述的載體包括本體和密封帽，其中所述本體的近端和密封帽底部相互密封形成一密閉的冷凍樣本放置區，所述的冷凍樣本放置區設有一冷凍樣本放置平臺，并且所述的本體設有冷卻劑流通通道，且所述密封帽設有與所述冷卻劑流通通道相對應的導流孔，使得進行生物樣本冷凍時，在所述通道內流通的冷卻劑與所述的冷凍樣本放置區的外表面接觸并冷卻所述冷凍樣本放置區內的生物樣本。在另一優選例中，在所述通道內流通的冷凍液體與所述的冷凍樣本放置平臺的外表面直接接觸，從而冷卻放置于所述冷凍樣本放置平臺上的生物樣本。在另一優選例中，在用生物樣本玻璃化冷凍載體進行生物樣本冷凍時，在所述的玻璃化冷凍載體外所流動的冷凍劑，與所述的冷凍樣本放置平臺的外表面直接接觸，從而冷卻放置于所述冷凍樣本放置平臺上的生物樣本。 在另一優選例中，所述的本體近端和密封帽之間還設有密封墊圈。在另一優選例中，所述的冷凍樣品放置平臺為一適宜樣本大小的平坦表面；并且(a)被設置于設于所述本體近端的頂部，或者被固定于所述本體近端的頂部;或(b)被設置于所述密封帽的底部(尤其是內底面)；或被固定于所述密封帽的底部。在另一優選例中，所述的冷凍樣品放置平臺與所述本體近端頂面在同一水平面；或所述的冷凍樣品放置平臺低于所述的本體近端頂面水平。在另一優選例 中，所述的的冷凍樣品放置區高度為0.5-5mm在另一優選例中，所述的放置平臺成型方式包括與載體本體或密封帽一體成型、粘接成型、扣接成型。在另一優選例中，所述的生物樣本包括:細胞、組織、器官。在另一優選例中，所述的細胞包括卵細胞、胚胎細胞。在另一優選例中，所述的本體還包括本體遠端的持握部以及位于本體近端和遠端之間的、用于和密封帽密封嚙合的嚙合部。在另一優選例中，所述的通道包括位于所述持握部的遠端開口以及設于所述本體側壁的側開口，且所述的遠端開口和所述的側開口相連通。在另一優選例中，所述的遠端開口自所述持握部向所述本體中心內部延伸至所述本體近端，與冷凍樣品放置平臺共同構成遠端設有開口并中空的所述本體。在另一優選例中，所述本體側壁的側開口位于所述冷凍樣品放置區和所述嚙合部之間，更佳地，所述本體側壁的側開口緊貼于所述冷凍樣品放置區。在另一優選例中，所述本體側壁的側開口為至少2個，更佳地，為4-6個。在另一優選例中，所述的嚙合部表面設有用于與密封帽密閉嚙合的活動緊固部件。在另一優選例中，所述的活動緊固部件包括螺旋緊固部件、套接緊固部件、扣接緊固部件。在另一優選例中，所述的密封帽外頂面或側面設有一樣本信息標記區。在另一優選例中，所述的密封帽具有不同色彩，用以區別不同發育周期的胚胎、不同類別細胞或組織。
在另一優選例中，所述的平臺直徑l_15mm，較佳地，為3-12mm，更佳的為5_10mm ；最佳地，為6-8mm ;和/或所述的平臺厚度為0.06-0.15mm,較佳地，為0.07-0.12mm,更佳地0.08-0.1Omm ；和/或所述生物樣本放置區高度為0.5_5mm,優選的為更優選的為2_3mm。在另一優選例中，所述的載體在放置生物樣本后的冷凍速率至少為10000-20000。。/ 分鐘？；較佳地，為 30000-500000C / 分鐘；更佳地，為 60000-100000°C /分鐘。在另一優選例中，所述的本體及密封帽材料相同或不同，且選自下組:高分子材料、金屬；和/或所述的載體平臺材料選自下組:高分子材料、金屬。在另一優選例中，所述的高分子材料包括PE (聚乙烯)、HDPE (高密度聚乙烯)；PP(聚丙烯)；PET (聚對苯二甲酸乙二醇酯)；在另一優選例中，所述的金屬包括不銹鋼、鈦合金。在另一優選例中，所述的高分子材料或金屬為醫用高分子材料或醫用金屬。在另一優選例中，所述的持握部直徑6_15mm，所述遠端開口直徑2_10mm ;和/或
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所述的本體側開口的大小為l_3mmX 1-3mm ;和/或所述的密封帽導流孔大小為2-5mmX2-5mm。在另一優選例中，所述的冷凍液體流通通道呈階梯狀、去頂圓柱狀。在另一優選例中，所述的本體側開口可以是圓形孔、橢圓孔、異形孔或扁平孔。在另一優選例中，所述的本體側開口至少為2個，更佳地為4-6個，所述的密封帽導流孔孔至少為2個，更佳地為4-6個。本發明第二方面，提供了一種生物樣本的密閉式玻璃化冷凍方法，包括步驟:a)提供本發明第一方面所述生物樣本玻璃化冷凍載體，所述的載體包括本體和密封帽，并且將所述的生物樣本，放置于所述生物樣本玻璃化冷凍載體的冷凍樣本放置平臺上,從而形成含生物樣本的載體本體；b)將步驟a)的含生物樣本的載體本體與所述密封帽嚙合并擰緊，從而形成含生物樣本的密封載體；c)將步驟b)的含生物樣本的密封載體在標記區進行樣本信息標記；d)將步驟c)已標記有生物樣本信息的密封載體置入冷卻劑中保存。在另一優選例中，所述的生物樣本的密閉式玻璃化冷凍方法還包括對含有生物樣本的密封載體進行標記；和/或對冷凍載體進行標記后放置生物樣本并進行密封，從而得到已標記的生物樣本密封載體。本發明第三方面，提供了一種生物樣本凍存組合裝置，所述的組合裝置包括i) 一個或多個本發明第一方面所述的載體；ii)液氮；和iii)液氮儲存裝置。本發明還提供了一種本發明第一方面所述的生物樣本密閉式玻璃化冷凍載體的用途，用于對生物樣本進行密閉冷凍保存。應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
圖1顯示了本發明生物樣本玻璃化冷凍載體一的裝配示意圖。圖2顯示了本發明生物樣本玻璃化冷凍載體二的裝配示意圖。圖3顯示了本發明生物樣本玻璃化冷凍載體三的裝配示意圖。其中，附圖標記對應的載體各部件名稱及功能如下:I冷凍液體流通通道；2導流孔；4側孔；5遠端開口 ；10密封帽；11樣本標記區；12持握部；13遠端；20冷凍樣品放置平臺；22密封圈；23冷凍樣品放置區；24近端。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，首次提供了一種用于生物樣品密閉冷凍保存的載體及裝置。試驗證明，本發明載體的所設計的冷卻劑流通通道、冷卻劑導流孔及生物樣品冷凍平臺在使生物樣品與冷凍液密閉隔離的同時，仍能達到高效的玻璃化冷凍效果，復溫后胚胎成活率高，且操作簡單。在此基礎上，完成了本發明。冷凍樣品放置平臺及放置區本發明本體近端與本發明密封帽的內底面互相密封形成一密閉的冷凍樣本放置區，且所述的冷凍樣本放置區設有一冷凍樣本放置平臺。所述的平臺可固定連接于所述本體近端的頂面，與所述本體近端共同構成近端封閉的中空狀本體結構。其中，所述平臺的平面可以與所述本體近端的頂面在同一水平，或低于本體近端的頂面。且所述平臺可通過各種常規的固定連接方式與本體近端頂面固定，通常，可以為與本體壓模成型、通過高分子粘結物質與本體近端連接，或通過扣接連接扣合于本體近端。一種優選的連接方式為與本體壓模成型。所述的平臺還可以固定連接于所述密封帽的內底面。當所述平臺與所述密封帽連接后，所述的本體倒扣入密封帽，并由本體近端與平臺嵌合，并形成密閉的冷凍樣本放置區。通常，沿著所述的冷凍樣品放置區的周徑，均設有密封圈，用于密閉本體近端和密封帽之間的空隙，保障冷凍樣品放置區達到的密閉，有效隔離生物樣本與冷卻劑的接觸，從而防止冷凍劑中的未知病原體等毒性物質對生物樣本的交叉污染與毒害。本發明冷凍樣品放置平臺的材料為無毒且可以耐受驟冷與驟熱溫度變化的醫用高分子材料、金屬。通常，可用于本發明冷凍樣品放置平臺的材料包括PE、HDPE、PET、PP、醫用不銹鋼、醫用鈦合金。本發明冷凍樣品放置平臺的其特征在于，所述的平臺直徑l_15mm，較佳地，為3-12mm,更佳的為5_10mm ;最佳地為6_8mm ;和/或載體平臺的厚度為0.06-0.15mm,較佳地，為 0.07-0.12mm,更佳地 0.08-0.10mm。此外，本發明生物樣本玻璃化冷凍載體的尺寸可以根據所需冷凍的生物樣本具體大小及多余冷凍保護劑的移除的操作而改變。通常，冷凍載體平臺的直徑可以為1_15_，高度 0.5_5mm。
冷凍液流通通道
可用于本發明的冷卻劑流通通道包括以下部分:(a)位于本體遠端的遠端開口；(b)位于本體近端的側開口；(c)位于密封帽側壁、與本體近端側開口位置相對應的導流孔。其中，所述的遠端開口、側開口經由本體中心內部相互連通，且對應于位于所述的密封帽側壁的導流孔。所述的側開口位于本體近端，更佳地，所述的側開口緊貼于冷凍樣品放置平臺。通常，所述的側開 口和導流孔分別至少為兩個，更佳地為四個或更多。在本發明中，當密封帽與本體相互閉合密封后，置入冷凍液體中，冷凍液體可經冷凍液流通通道由遠端開口 -側開口-導流孔循環交流，如此，冷卻劑流動的過程，即可使生物樣本載體平臺表面進行預冷，由于載體平臺的足夠薄，從而降低Ieidenfrost效應,使位于冷凍放置平臺的組織樣本迅速冷卻。在本發明中，所述本體側開口直徑l_3mm，或2X3mm橢圓橫向孔，所述的密封帽導流孔直徑為2-5mmX2-5mm的橢圓橫向孔。可用于本發明的遠端開口或本體側開口或導流孔的立體形狀沒有特別限制，可以為任何有利于冷凍劑流通的、互相對應匹配的形狀，通常，本發明中各開口或導流孔的立體形狀呈階梯狀、去頂圓柱狀。快速冷凍生物樣本的方法本發明中快速冷凍生物樣本的方法，包括步驟:a)提供權利要求1所述生物樣本玻璃化冷凍載體，所述的載體包括本體和密封帽，并且將所述的生物樣本，放置于所述生物樣本玻璃化冷凍載體的冷凍樣本放置平臺上，從而形成含生物樣本的載體本體；b)將步驟a)的含生物樣本的載體本體與所述密封帽嚙合并擰緊，從而形成含生物樣本的密封載體；c)將步驟b)的含生物樣本的密封載體在標記區進行樣本信息標記；d)將步驟c)已標記有生物樣本信息的密封載體置入冷卻劑中保存。通常，所述的生物樣本的密閉式玻璃化冷凍方法還包括對含有生物樣本的密封載體進行標記；和/或對冷凍載體進行標記后放置標本并進行密封，從而得到已標記的密封載體。使用本發明玻璃化冷凍載體以及快速冷凍生物樣本的方法，可達到20000°C /分鐘的冷卻速率，更佳地，40000-100000°C /分鐘的冷卻速率，視采用載體平臺不同材料或大小而獲得不同的冷卻速率和生物樣本玻璃化效果。此外，本發明中的載體在應用于實驗或診療時，需進行無菌化處理后使用，并在操作過程中保持無菌環境。材料與外觀可用于制備本發明生物樣本玻璃化冷凍載體的材料為無毒，并經過無菌處理，且可以耐受驟冷與驟熱溫度變化的高分子材料或金屬。在另一優選例中，所述的高分子材料包括PE (聚乙烯)、HDPE (高密度聚乙烯)；PP(聚丙烯)；PET (聚對苯二甲酸乙二醇酯)。
在另一優選例中，所述的金屬包括不銹鋼、鈦合金。在另一優選例中，所述的高分子材料或金屬為醫用高分子材料或醫用金屬。在本發明中，本體與密封帽以相互扣接或螺紋旋轉連接等各種活動套接方式相互扣合密封。通常，所述的扣接或螺紋旋轉連接裝置可以通過各種常規方法達到密封的效果，如增加可以耐受驟冷與驟熱溫度變化的密封圈，如改變螺紋的形態或角度等，保證密閉裝置在驟冷驟熱過程中的密閉自鎖。本發明中的本體和密封帽的外觀形狀沒有特別限制，可以為任何互相匹配的柱形外觀，如圓柱形、六角柱形，從而便于操作者持握以及在放置胚胎、卵子等生物樣本時載體的穩定。此外，本發明的本體和密封帽可以采用各種不同色彩，以區分載體用于不同生物樣本、組織、細胞等的凍存標識。本發明的有益效果:1.密封保存生物樣本，安全無毒:本發明載體及方法用于將生物樣本與冷凍液體隔離、密閉保存，安全無污染，減少了冷凍液體對生物樣本的潛在毒性危險。2.冷凍速率快，達到高效玻璃化冷凍:采用本發明載體以及方法可以達到ioooo-1ooooo°c /分鐘的冷凍速率，視采用載體平臺不同材料或大小而獲得不同的冷卻速率和生物樣本玻璃化效果。從而起到快速玻璃化冷凍并避免生物樣本冷凍過程中受冰晶破壞的影響。3.操作方便:本發明載體采用螺紋緊固或套接、扣接式緊固等密封方式，操作時僅需將生物樣本放置于平臺后擰緊密封帽，即可放入液氮儲存，代替了傳統熱塑密封的復雜程序。4.安全有效:由于本裝置的特殊結構及操作簡易，在樣本升溫后取出如同樣本裝載一般方便，升溫后不易發生生物樣本的丟失。實施例1:密封性能測試各取50套密閉式玻璃化冷凍載體一(如圖1)和載體三(如圖3)，滅菌后，分別放入液氮中一天、一周、30天、60天、90天后，于液氮中取出，迅速投入37°C水中，放置10分鐘，取出后放于濾紙上站立數秒，打開密封帽，用干凈濾紙擦拭放置平臺，鏡下觀察濾紙有否水印，結果如表I所示:表I
權利要求
1.一種生物樣本玻璃化冷凍載體，其特征在于，所述的載體包括本體和密封帽，其中所述本體的近端和密封帽底部相互密封形成一密閉的冷凍樣本放置區，所述的冷凍樣本放置區設有一冷凍樣本放置平臺， 并且所述的本體設有冷卻劑流通通道，且所述密封帽設有與所述冷卻劑流通通道相對應的導流孔，使得進行生物樣本冷凍時，在所述通道內流通的冷卻劑與所述的冷凍樣本放置區的外表面接觸并冷卻所述冷凍樣本放置區內的生物樣本。
2.如權利要求1所述的載體，其特征在于，所述的冷凍樣品放置平臺為一適宜樣本大小的平坦表面； 并且(a)被設置于設于所述本體近端的頂部，或者被固定于所述本體近端的頂部； 或(b)被設置于所述密封帽的底部(尤其是內底面)；或被固定于所述密封帽的底部。
3.如權利要求1所述的載體，其特征在于，所述的本體還包括本體遠端的持握部以及位于本體近端和遠端之間的、用于和密封帽密封嚙合的嚙合部。
4.如權利要求1或3所述的載體，其特征在于，所述的通道包括位于所述持握部的遠端開口以及設于所述本體側壁的側開口，且所述的遠端開口和所述的側開口相連通。
5.如權利要求1或3所述的載體，其特征在于，所述的嚙合部表面設有用于與密封帽密閉嚙合的活動緊固部件。
6.如權利要求1所述的載體，其特征在于，所述的平臺直徑較佳地,為3_12mm,更佳的為5-10mm ;最佳地， 為6_8mm ;和/或 所述的平臺厚度為0.06-0.15mm，較佳地，為0.07-0.12mm，更佳地0.08-0.1Omm ;和/或 所述生物樣本放置區高度為0.5-5mm,優選的為更優選的為2_3mm。
7.如權利要求1所述的載體，其特征在于，所述的載體在放置生物樣本后的冷凍速率至少為10000-20000 °C /分鐘？；較佳地，為30000-50000 °C /分鐘；更佳地，為60000-100000 °C / 分鐘。
8.如權利要求1所述的載體，其特征在于，所述的本體及密封帽材料相同或不同，且選自下組:高分子材料、金屬；和/或 所述的載體平臺材料選自下組:高分子材料、金屬。
9.如權利要求4所述的載體，其特征在于，所述的持握部直徑6-15mm，所述遠端開口直徑2-10mm ;和/或 所述的本體側開口的大小為l_3mmX 1-3mm ;和/或 所述的密封帽導流孔大小包為2-5mmX2-5mm。
10.如權利要求1所述的，其特征在于，所述的本體側孔至少為2個，更佳地為4個，所述的密封帽導流孔孔至少為2個，更佳地為4-6個。
11.一種生物樣本的密閉式玻璃化冷凍方法，其特征在于，包括步驟: a)提供權利要求1所述生物樣本玻璃化冷凍載體,所述的載體包括本體和密封帽,并且將所述的生物樣本，放置于所述生物樣本玻璃化冷凍載體的冷凍樣本放置平臺上，從而形成含生物樣本的載體本體； b)將步驟a)的含生物樣本的載體本體與所述密封帽扣合并擰緊，從而形成含生物樣本的密封載體；c)將步驟b)的含生物樣本的密封載體在標記區進行樣本信息標記； d)將步驟C)已標記有生物樣本信息的密封載體置入冷卻劑中保存。
12.—種生物樣本凍存組合裝置，其特征在于，所述的組合裝置包括i) 一個或多個權利要求I所述的載體 ；ii)液氮；和iii)液氮儲存裝置。
全文摘要
本發明提供了一種生物樣本玻璃化冷凍載體以及快速、簡便、密閉式無菌冷凍生物樣本的方法。具體地，所述的載體包括本體和密封帽，其中所述本體近端和密封帽內底面相互密封形成一密閉的冷凍樣本放置區，所述的冷凍樣本放置區設有一冷凍樣本放置平臺，并且所述的本體設有冷凍液體流通通道，且所述密封帽設有與所述冷凍液體流通通道相對應的導流孔，使得進行生物樣本冷凍時，在所述通道內流通的冷凍液體與所述的冷凍樣本放置區的外表面接觸并冷卻所述冷凍樣本放置區內的生物樣本。本發明生物樣本玻璃化冷凍載體及方法具有安全、無毒、玻璃化冷凍及復溫操作效率高等優勢，在生物樣本冷凍領域有廣闊的運用前景。
文檔編號A01N1/02GK103190393SQ20131012180
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月9日 優先權日2013年4月9日
發明者樓偉 申請人:上海安久生物科技有限公司