Eat1基因的應用及恢復eat1基因缺失導致水稻雄性不育的方法
【專利摘要】本發明涉及一種生物工程【技術領域】中EAT1基因的應用及恢復EAT1基因缺失導致水稻雄性不育的方法；所述的EAT1基因編碼如SEQ?ID?NO.3所示的氨基酸，所述的應用是：通過基因變異或抑制表達獲得水稻雄性不育株系并可以用來生產種子；本發明還涉及一種恢復EAT1基因缺失導致水稻雄性不育的方法，通過引物擴增EAT1基因，使用遺傳轉化手段轉化突變體植株，能夠使得突變體恢復到野生型表型。本發明獲得的水稻突變體營養生長階段沒有任何異常，但純合體植株完全不育。如果應用于雜交育種中，可以免除母本去雄的工作，大大提高生產效率，降低人工成本，在農業生產上具有重要的應用。
【專利說明】EAT1基因的應用及恢復EAT1基因缺失導致水稻雄性不育的方法
[0001]本申請是申請號為201210223656.0,申請日為2012.6.29，發明名稱為《水稻雄性不育株系創制的方法及其用途》的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明涉及的是一種生物工程【技術領域】中的水稻株系創制的方法，具體是一種EATl基因的應用及恢復EATl基因缺失導致水稻雄性不育的方法。
【背景技術】
[0003]水稻是世界上主要的糧食作物之一，更是我國最重要的糧食作物。中國是世界上最大的稻米生產國和消費國，約有60%以上的國人以稻米為主食。我國水稻年播種面積超過3000萬公頃，占世界的20%，占全國糧食作物播種面積的30%;2011年，水稻總產量1.987億噸，占糧食總產量的42%，單位面積產量比所有糧食作物平均單產高出45%以上；單位面積產量6.35噸/公頃，比全球平均產量3.85噸/公頃高65%。其中一個重要因素就是雜交水稻的廣泛種植。
[0004]雄性不育系:是指一種雄性退化(主要是花粉退化)但雌蕊正常的母水稻，由于花粉無力生活，不能自花授粉結實，只有依靠外來花粉才能受精結實，因此借助這種母水稻作為遺傳工具，通過人工輔助授粉的方法，就能產生大量雜交種子。從育種戰略上看，雜交水稻的發展可以分為三系法、兩系法和一系法三個發展階段。每進入一個新階段，都是育種上的一次突破，從而會把水稻的產量提高到一個新臺階。現在生產上用的雜交水稻屬于三系法品種間雜交優勢利用的范疇，這種三系雜交稻一般要比常規水稻增產20%左右，當前仍處于方興未艾時期。但是，三系法雜交水稻種子優勢表現復雜，受恢復系和保持系關系限制，使優良組合的篩選比較困難。因此，科學家一直在篩選和培育新的不育系，以期擴展細胞質背景，為遠緣雜交和雜種優勢的利用奠定基礎。
【發明內容】
[0005]本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種EATl基因的應用及恢復EATl基因缺失導致水稻雄性不育的方法；本發明利用EATl基因及其蛋白參與調控水稻雄性生殖的特點，及其利用轉基因技術控制水稻雄性生殖發育，通過突變該蛋白序列或抑制該蛋白的表達產生新的水稻雄性不育株系，在農業生產上具有十分重要的應用。
[0006]本發明是通過以下的技術方案實現的，
[0007]第一發明，本發明涉及一種EATl基因的應用，所述的EATl基因編碼如SEQ IDN0.3所示的氨基酸，所述的應用是:通過基因變異或抑制表達獲得水稻雄性不育株系并可以用來生產種子。
[0008]第二方面，本發明還涉及一種恢復EATl基因缺失導致水稻雄性不育的方法，通過引物擴增EATl基因，使用遺傳轉化手段轉化突變體植株，能夠使得突變體恢復到野生型表型。
[0009]優選地，所述的EATl基因編碼如SEQ ID N0.3所示的氨基酸。
[0010]優選地，所述方法包括如下步驟:
[0011]將含EATl互補構建的根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105轉入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中EATl互補構建含有編碼如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；具體包括如下步驟:
[0012](a)提供攜帶表達EATl互補構建載體的根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) EHA105 ；
[0013](b)將水稻細胞或組織或器官與步驟(a)中的農桿菌接觸，從而使編碼如SEQ IDN0.3所示氨基酸的核苷酸轉入水稻細胞，并且整合到水稻細胞的染色體上；
[0014](c)選擇轉入所述核苷酸的水稻細胞或組織，再生，獲得水稻植株。
[0015]本發明具有如下的有益效果:本發明通過控制水稻HLH結構域的轉錄因子EATl基因及其編碼蛋白獲得水稻雄性生殖發育的變異株，實現控制水稻生殖過程；本發明獲得的水稻突變體在營養期與來源親本無明顯差異，進入生殖生長階段后雄性生殖發育異常，花粉敗育，得到完全不育的植株，在雜交水稻構建和農業生產上具有十分重要的應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1為pHB載體及EATl干擾構建示意圖。
[0017]圖2為eatl突`變體植株的形態學觀察示意圖。
[0018]圖3為互補突變體得到野生型表型示意圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如 Sambrook 等分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0020]所述EATl基因為編碼如SEQ ID N0.3所示氨基酸序列的核苷酸序列。
[0021]實施例1、水稻雄性不育株系創制的方法
[0022]1.1通過基因工程或其他手段創制eatl水稻雄性不育株系
[0023]本實施例中EATl基因的編碼區序列如SEQ ID N0.3所示。本實施例的eatl突變材料是由常規粳稻品種武育粳7號(又名9522)經過對EATl基因的RNA干擾或者序列變異獲得。
[0024]1.2水稻育性控制蛋白基因的克隆
[0025]利用發明人構建的包含育性控制蛋白基因EATl及其突變基因eatl組成的、本領域內技術人員清楚的水稻基因定位克隆(map-based cloning或position cloning)群體，按分子標記定位于I個小的基因組片段內，例如IOOKb內。在此基礎上，用常規方法分離包含該片段的基因組DNA克隆。經測序和進一步的雜交鑒定確定其中一個含完整水稻雄性生殖發育控制蛋白EATI。
[0026]經全核苷酸序列分析結果表明:水稻雄性育性EATl基因全長為3433bp (SEQ IDN0.6，包含調控區和內含子)。經軟件分析和cDNA克隆，其ORF如SEQ ID N0.2所示，編碼全長為464個氨基酸的水稻雄性生殖發育控制蛋白，其序列如SEQ ID N0.3所示。
[0027]1.3水稻育性控制蛋白基因的點突變
[0028]本實施例的eatl突變材料是由常規粳稻品種武育粳7號(又名9522)經過對EATl基因的序列變異獲得，經過對EATl突變基因eatl的序列比較，水稻雄性生殖發育控制蛋白的移碼和提前終止會使得水稻雄性生殖器官不能正常發育，造成植株不育；本實施例EATl突變基因是在編碼區的2個堿基對缺失(其序列如SEQ ID N0.4所示)引起水稻雄性生殖發育控制蛋白翻譯得提前終止和功能喪失。
[0029]1.4通過RNAi手段降低水稻品種中的EATl的表達水平
[0030]為了對EATl蛋白進行應用，構建了 EATl基因RNAi的載體，并轉化野生型9522植株，以期降低EATl的表達，從而達到改變水稻育性的目的。
[0031]從水稻cDNA克隆(EAT1_EST clone)中用引物
[0032]EATl-R1-F: 5，AAGAGCTCGAATTCCCACCTTCAACATCAACTAGA3，和
[0033]EATl-R1-R:5’ AAACTAGTCTGCAGCAATAATCACATCTCGTTCGT3’
[0034]擴增出EATl基因編碼區序列的第197位至第688位共491bp的特異性片段；將這個片段分別通過EcoRI/PstI和Sacl/Spel正反向插入連入加入含有水稻Intron序列的pBluescript SK載體；測序驗證正確，再用EcoRI和SpeI酶切切下含有EATl正反向特異性片段和Intron和片段，連入經同樣酶切的pHB載體中(圖1)。再次測序檢驗核苷酸序列是否正確，成功構建pHB-EATl-RNAi質粒。
`[0035]將含有EATl基因RNA干擾構建的農桿菌在含有Kan (50 μ g/ μ I)的YEB平板上劃線，獲的單菌落。挑單菌落接種到3ml含抗生素的YEB液體培養基中于28°C振蕩培養過夜，第2天按1%接種量轉接入50ml含抗生素的AB液體培養基中，200rpm繼續振蕩培養至OD600為0.6至0.8左右時，將新鮮的農桿菌菌液于5000rpm、4離心5分鐘，收集并重懸于1/3體積的AAM液體培養基中，此時即可用于轉化水稻各種受體材料。
[0036]本實施例采用常規的農桿菌轉化方法轉化水稻9522的幼胚愈傷。取授粉后12_15天的9522未成熟種子經70%乙醇浸泡I分鐘后，于NaClO溶液中(與水1:3混合，加2_3滴吐溫20)消毒90分鐘以上，用無菌水沖洗4-5次，然后用解剖刀和鑷子挑出幼胚并接種月N6D2培養基上誘導愈傷組織，在26± I°C、避光條件下培育，4天后可用于轉化。將幼胚愈傷浸泡入新鮮的AAM農桿菌菌液中并不時搖動，20分鐘后將水稻材料移出，在無菌濾紙上吸去過多的菌液，隨即轉移到N6D2C培養基上，于26°C共培養3天。共培養時，在共培養培養基中加入乙酰丁香酮，使用濃度為ΙΟΟμΜ。3天后，從共培養培養基上取出愈傷組織，切去胚芽并轉入含有25mg/L Hyg的選擇培養基上進行選擇培養。7_12天后將抗性愈傷組織轉到含有50mg/L Hyg的選擇培養基上繼續篩選。10-12天后生長旺盛的抗性愈傷組織轉移到預分化培養基上培養一周左右，再移至分化培養基上分化(12小時光照/天)。再生的小苗在1/2Μ\Η培養基上生根壯苗，隨后移入人工氣候室營養液栽培。
[0037]獲得的再生植株移栽成活后以除草劑再次篩選轉化植株；陽性植株提取葉片總DNA，經PCR進一步鑒定轉化植株。RT-PCR分析陽性植株中EATl基因的表達水平，表達水平降低到野生型20%以下為有效RNA干擾植株。
[0038]1.5ΕΑΤ1蛋白活性喪失或表達水平導致水稻雄性發育異常[0039]對eatl突變體植株的形態學觀察。如圖2，野生型和突變型eatl的表型對比顯示，野生型花藥發育成熟期花藥呈黃色(B)，其中含有豐富的淀粉粒可被I2/KI染成藍色(Α，B,C)，而eatl突變型花藥較野生型略小，呈淡黃色；與野生型花藥成熟期相對應的時期已經幾乎觀察不到花粉粒，剖開藥室腔只能看到少數退化的小孢子殘留物，更無法被I2/KI著色。
[0040]1.6EATl 表達特征
[0041]利用eatl突變株的來源親本9522各個器官組織，提取RNA，進行反轉錄得到cDNA第一鏈，利用熒光定量PCR的方法確定EATl基因的表達模式(如圖3)，發現EATl基因在水稻雄性生殖發育時期有著廣泛且顯著的表達；除此之外，營養發育過程中的根、莖和葉中也有極微弱的表達。
[0042]1.7EAT1基因在創制其他水稻品系雄性不育株系中的應用
[0043]將eat I突變體與秈稻品種9311、龍特甫或廣陸矮4號水稻品系雜交，在F2代中具有秈型特征的植株中均出現了雄性不育株系，符合3:1分離規律，進而證明EATl基因在其他水稻品種中發生核苷酸序列變化時，同樣可以產生雄性不育植株。[0044]實施例2eatl突變體在水稻制種中的用途
[0045]將eatl突變體作為父本與三系或兩系雜交組合中的不育親本雜交，得到Fl代。在F2代中篩選同時具有雄性不育及不育特征的植株，將該植株與原不育親本對應的保持系雜交。再次在F2代中篩選同時具有雄性不育及不育特征的植株與保持系雜交，經多代雜交篩選后獲得新的雄性不育不育系，適宜作為雜交組合中的母本。
[0046]實施例3恢復eatl突變體雄性不育性狀的方法
[0047]將編碼EATl基因的基因組核苷酸序列轉入突變體eatl植株，能夠使突變體恢復到野生型表型。
[0048]從水稻日本晴BAC克隆(0SJNba0093F12)中用引物:
[0049]EATl-COM-F: 5，AAAAGTCGACCCGAACTGCCGTCTTAATGT3，和
[0050]EAT1-COM-R: 5，AAAAGGTGACCGCAGTGACCAGATTGAGATAAC3，
[0051]擴增出EATl基因的5225bp的基因組序列片段。
[0052]將該片段通過SalI和BstEII插入到用于轉化水稻的雙元載體pCAMBIA1301載體中；測序驗證正確，該載體通過電擊導入根癌農桿菌EHA105，得到EATl互補根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105,使用遺傳轉化手段轉化突變體eatl和野生型9522成熟胚愈傷，以觀察是否會使突變體恢復到野生型表型。Ttl代獲得互補植株，Ttl代互補植株可以產生花粉，并被I2/KI染色，即表現出的野生型表型。
[0053]綜上所述，本發明通過控制水稻HLH結構域的轉錄因子EATl基因及其編碼蛋白獲得水稻雄性生殖發育異常的變異株，實現控制水稻雄性生殖發育和育性；本發明獲得的水稻突變體在營養生長時期與來源親本無明顯差異，進入生殖生長階段后，雄性生殖器官發育異常、花粉敗育引起植株不育，在農業生產上具有十分重要的應用。
【權利要求】
1.一種EATl基因的應用，其特征在于，所述的EATl基因編碼如SEQ ID N0.3所示的氨基酸，所述的應用是:通過基因變異或抑制表達獲得水稻雄性不育株系并可以用來生產種子。
2.一種恢復EATl基因缺失導致水稻雄性不育的方法，其特征在于，通過引物擴增EATl基因，使用遺傳轉化手段轉化突變體植株，能夠使得突變體恢復到野生型表型。
3.如權利要求2所述的恢復EATl基因缺失導致水稻雄性不育的方法，其特征在于，所述的EATl基因編碼如SEQ ID N0.3所示的氨基酸。
4.如權利要求2所述的恢復EATl基因缺失導致水稻雄性不育的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:
將含EATl互補構建的根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105轉入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中EATl互補構建含有編碼如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；具體包括如下步驟: (a)提供攜帶表達EATl互補構建載體的根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105 ； (b)將水稻細胞或組織或器官與步驟(a)中的農桿菌接觸，從而使編碼如SEQID N0.3所示氨基酸的核苷酸轉入水稻細胞，并且整合到水稻細胞的染色體上； (c)選擇轉入所述核苷酸的水稻細胞或組織，再生，獲得水稻植株。
【文檔編號】A01H5/00GK103602657SQ201310383378
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2012年6月29日 優先權日:2012年6月29日
【發明者】張大兵, 牛寧寧, 羅治靖, 陳明姣, 袁政, 梁婉琪 申請人:上海交通大學