通過缺失或消除非必需基因而減毒的重組副流感病毒疫苗的制作方法

專利名稱：通過缺失或消除非必需基因而減毒的重組副流感病毒疫苗的制作方法
背景技術：
人副流感病毒3型(HPIV3)是幼兒和1歲以下兒童嚴重下呼吸道感染的一般誘因。它是僅次于呼吸道合胞病毒(RSV)的、導致該年齡段兒童因病毒性下呼吸道疾病入院的誘因(Collins等，p1205-1243，于B.N.Fields(Knipe等編輯)Fields Virology，3rded.，vol.1.，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996；Crowe等，Vaccine 13415-421，1995；Marx，J.Infect.Dis.1761423-1427，1997)。該病毒的感染使3歲以下兒童發生顯著病癥。HPIV1和HPIV2是喉氣管支氣管炎(哮吼)的主要病因，也能引起嚴重肺炎和細支氣管炎(Collins等，3rded.In“Fields Virology”，B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley，R.M.Chanock，J.L.Melnick，T.P.Monath，B.Roizman，和S.E.Straus，Eds.，Vol.1，p1205-1243，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996)。在為期20年的長期性研究中，發現HPIV1、HPIV2和HPIV3分別占因呼吸道疾病入院總數的6.0、3.2和11.5％，三者的總和占入院總數的18％，因此，需要有效的疫苗。(Murphy等，Virus Res.111-15，1988)。也發現副流感病毒占兒童中并發中耳炎的、由病毒誘發的中耳積液誘因的很大比例(Heikkinen等，N.Engl.J.Med.340260-264，1999，在此引入作為參考)。因此，需要發展一種抗這些病毒的疫苗，以預防嚴重的下呼吸道疾病和伴隨HPIV感染的中耳炎。
盡管對發展抗HPIV的有效疫苗療法進行了大量的研究，仍然沒有獲得任何HPIV株的被認可的疫苗制劑，以及改善HPIV相關疾病的被認可的疫苗制劑。目前，僅有兩個活的減毒PIV候選疫苗受到了特別關注。其中之一是一種牛PIV(BPIV3)株，其與HPIV3抗原相關，并顯示可保護動物免受HPIV3侵襲。BPIV3在人幼兒和兒童中減毒、遺傳穩定，并且具有免疫原性(Karron等，J.Inf.Dis.1711107-14，(1995a)；Karron等，J.Inf.Dis.1721445-1450，(1995b))。第二個PIV3候選疫苗(JS cp45)是HPIV3 JS野生型(wt)株的冷適應突變體(Karron等，1995b，同上；和Belshe等，J.Med.Virol.10235-242，(1982))。這種活的、減毒的、冷傳代(cp)的PIV3候選疫苗具有溫度敏感(ts)、冷適應(ca)和減毒(att)的表型，在體內實驗病毒復制后是穩定的。cp45病毒在實驗動物中可保護性抵抗人PIV3的侵襲，并且在血清反應陰性的幼兒和兒童中是減毒、遺傳上穩定并具有免疫原性的(Hall等，Virus Res.22173-184，1992；Karron等，1995b，同上)。
近來，重組DNA技術促進PIV3候選疫苗的發展，使從cDNA中得到感染性負鏈RNA病毒成為可能(綜述參見Conzelmann，J.Gen.Virol.77381-389，1996；Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9311354-11358，1996)。文中報道了在必需病毒蛋白存在時，從cDNA編碼的反基因組RNA中獲得的一些重組病毒，這些病毒包括感染性呼吸道合胞病毒(RSV)、狂犬病病毒(RaV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MeV)、牛瘟病毒、猿猴病毒5(SV5)、新城疫病毒(NDV)和仙臺病毒(SeV)(參見，如，Garcin等，EMBO J.146087-6094，1995；Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.924477-4481，1995；Radecke等，EMBO J.145773-5784，1995；Schnell等，EMBOJ.134195-4203，1994；Whelan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.928388-8392，1995；Hoffman等，J.Virol.714272-4277，1997；Kato等Genes toCells 1569-579，1996；Roberts等，Virology 247(1)1-6，1998；Baron等，J.Virol.711265-1271，1997；國際申請WO 97/06270；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9211563-11567，1995；1997年7月15日的US專利申請08/892,403(相應于公布的國際申請WO 98/02530和之前的US臨時申請1997年5月23日的60/047,634，1997年5月9日的60/046,141，1996年7月15日的60/021,773)；Juhasz等，J.Virol.71(8)5814-5819，1997；He等，Virology 237249-260，1997；Baron等，J.Virol.711265-1271，1997；Whitehead等，Virology 247(2)232-239，1998a；Whitehead等，J.Virol.72(5)4467-4471，1998b；Peeters等，J.Virol.735001-5009，1999；Jin等，Virology 251206-214，1998；Bucholz等，J.Virol.73251-259，1999；Whitehead等，J.Virol.73(4)3438-3442，1999；為各種目的在此分別全文引用作為參考)。
在特別地有關于目前的發明的方面，近來發展了一種獲得具有來自cDNA的wt表型的HPIV的方法，可回收感染性的重組PIV3 JS株(參見，如，Durbin等，Virology 235323-332，1997；1998年5月22目的美國專利申請09/083,793；1997年5月23日的美國臨時專利申請60/047,575(相應于國際申請WO 98/53078)和1997年9月19日的美國臨時專利申請60/059,385；在此分別引用作為參考)。此外，這些發現使可以進行cDNA克隆的遺傳操作，以確定生物學突變體表型變化的遺傳基礎，如，在HPIV3 cp45中那些特定導致產生ts、ca和att表型的突變，以及BPIV3中那些特定導致產生其減毒表型的基因。此外，這些發現使可以構建新PIV候選疫苗，并估計其減毒、免疫原性和表型穩定性水平。
因此，現在可從cDNA中獲得感染性野生型重組PIV3(r)PIV3，以及其多種ts衍生物，并使用反向遺傳系統產生具有確定的減毒突變的感染性病毒，以及研究現存疫苗病毒減毒的遺傳基礎。例如，發現在cp45 L基因中的三個氨基酸替代，單獨或組合，特定導致產生ts和減毒的表型。其它ts和減毒突變存在于PIV3 cp45的其它區域。此外，利用PIV3 cDNA拯救系統，在L區帶有這三個減毒突變的PIV3全長cDNA中，將PIV3 HN和F讀碼框(ORF)替換為PIV1的，產生一種嵌合PIV1候選疫苗。衍生自該cDNA的重組嵌合病毒定名為rPIV3-1.cp45L(Skiadopoulos等，J.Virol.721762-1768，1998；Tao等，J.Virol.722955-2961，1998；Tao等，Vaccine 171100-1108，1999，在此引用作為參考)。rPIV3-1.cp45L在倉鼠中是減毒的，并能誘導對PIV1攻擊的高水平抗性。獲得了一個定名為rPIV3-1.cp45的重組嵌合病毒，其具有cp45中15個突變的13個，即，不包括發生于HN和F的突變，并且在倉鼠上下呼吸道中高度減毒(Skiadopoulos等，Vaccine，在印，1999)。
盡管在發展抗PIV不同組的有效疫苗中有許多進展，本領域仍然需要另外的工具和方法，工程化安全和有效疫苗以減輕PIV導致的嚴重的健康問題，特別是HPIV3感染導致幼兒和兒童的疾病。目前遺留的問題包括需要其它工具以產生用于不同臨床背景的、適當減毒的、具免疫原性和遺傳穩定性的候選疫苗。為達到這一目標，現存的檢測并在重組疫苗毒株中引入減毒突變的方法需要擴展。本發明令人驚訝地滿足這些需要，并提供了以下所述的其它優點。
發明簡述本發明提供了在感染性PIV中引入已定義的、預先確定的結構和表型改變的新工具和方法。本發明的一個實施方案中，提供了一種分離的多核苷酸分子，其具有一個可操作連接的轉錄啟動子，一個編碼PIV基因組或反基因組的多核苷酸序列和一個轉錄終止子。該基因組或反基因組含有一個降低或消除C、D和/或V ORF中一個或多個的表達的剔除突變，或使一個或多個C、D和/或V ORF的全部或部分缺失的突變。
本發明優選的方面中，C、D和/或V ORF中一個或多個的表達的降低或消除，是通過修飾PIV基因組或反基因組，使其具有一個將C ORF起始密碼子從M改為T，或一個或多個終止密碼子的突變。或者，一個或多個C、D和/或V ORF被整體或部分的缺失，或通過如點突變被修飾，使相應的蛋白部分或完全無功能，或徹底破壞蛋白表達。或者，可以在編輯位點產生突變，阻止編輯并消除由RNA編輯產生的蛋白的表達(Kato等，EMBO 16578-587，1997和Schneider等，Virology227314-322，1997)。
本發明在C、D和/或V有突變的重組PIV具有發展疫苗所期望的表型特征。以上所述在重組基因組或反基因組中的突變，在產生的病毒或亞病毒顆粒中特定導致一種或多種期望的表型改變。由此產生的候選疫苗表現一種或多種特征，表現為(i)細胞培養時生長性質的改變，(ii)在哺乳動物宿主的上下呼吸道中減毒，(iii)病毒噬菌斑大小的改變，(iv)細胞病理學效果的改變，以及(v)免疫原性的改變。
此處所述模式PIV重組體中，期望的表型變化包括，與相應的野生型或突變親本PIV株相比，病毒在體外和/或哺乳動物宿主中生長的減弱。在更詳細的方面，病毒在細胞培養中的生長可能因剔除或基因(或基因組區段)缺失突變而減弱約5-10倍。病毒在哺乳動物宿主的上下呼吸道中減毒優選約為10-100倍，有時100-1000倍或更高，以利于疫苗的發展。同時，本發明的重組PIV具有免疫原特性，可以在哺乳動物宿主的上下呼吸道中刺激抗wt PIV攻擊的保護性免疫應答。
具有C、D和/或V剔除突變的PIV基因組或反基因組可以是人或非人PIV序列，或其被重組修飾的版本。一個實施方案中，該多核苷酸序列編碼一個嵌合的基因組或反基因組，其具有重組地組合了一個非人PIV序列(如來自牛PIV(BPIV)的基因或基因組區段)的一個人PIV序列(參見，如，1999年7月9日由Bailey等人申請的案卷號為15280-399000US的美國臨時專利申請，名為“減毒的人-牛嵌合副流感病毒疫苗”，在此引用作為參考)。其它實例中，該多核苷酸編碼來自一個非人PIV和至少一個其它人或非人來源PIV序列的嵌合體。
另一些實施方案中，本發明提供了一種分離的感染性PIV顆粒，具有包含C、D和/或V剔除突變的重組PIV(rPIV)基因組或反基因組。該分離的感染性PIV顆粒可以是病毒或亞病毒顆粒。此處所述亞病毒顆粒指任何缺少完整病毒中存在的(如包括完整基因組或反基因組、核殼和包膜的裝配了的毒粒)一個結構成分如一個基因組區段、基因、蛋白或蛋白功能結構域的感染性PIV顆粒。因此，本發明亞病毒顆粒的一個例子是具有一個基因組或反基因組、以及N、P和L基因產物的感染性核殼。其它亞病毒顆粒通過非必須基因、基因組區段和/或部分或完全的基因產物(如F，HN，M或C)及其它非必須基因組和結構成分的部分或完全的缺失或替代來產生。
除了具有C、D和/或V缺失或剔除突變的重組PIV產生的表型效果外，也期望通過引入額外的增加或降低該重組病毒的減毒、和/或調整免疫原活性的突變，以調整其減毒和免疫原表型。因此，候選疫苗株可以由引入的至少一個，優選兩個或多個不同的減毒突變進一步減毒，如生物學來源的PIV突變體中發現的突變，或利用重組微復制子、重組病毒或生物學來源病毒中經驗地發現的突變。文中優選突變PIV株包括冷傳代(cp)、冷適應(ca)、宿主范圍限制(hr)、小噬菌斑(sp)和/或溫度敏感(ts)突變體，例如JS HPIV3 cp45突變株。在模式實施方案中，一個或多個減毒突變發生于聚合酶L蛋白中，如在相應于JS cp45的Tyr 942、Leu 992、Thr 1558的位置上。或者，N蛋白的減毒突變可被選擇并引入C、D和/或V缺失或剔除突變體中，如其編碼在相應于JS cp45殘基Val 96或Ser 389處的氨基酸替代。其它或附加突變可能編碼C蛋白中的氨基酸替代，如在相應于JS cp45殘基Ile96處。調節本發明C、D和/或V缺失或剔除突變體減毒水平的其它突變也存在于F蛋白，如在相應于JS cp45殘基Ile 420或Ala 450處，在HN蛋白，如在相應于JS cp45殘基Val384處(Skiadopoulos等，J.Virol.731374-1381.1999；Skiadopoulos等，J.Virol.731374-1381，1999，分別在此引用作為參考)。
引入本發明C、D和/或V缺失或剔除突變體中的、來自生物學來源的PIV突變體的減毒突變也包括在PIV基因組或反基因組非編碼部分的突變，例如在3’前導序列。文中的突變范例可在重組病毒3’前導序列(相應于JS cp45核苷酸23、24、28或45)工程化(Skiadopoulos等，J.Virol.731374-1381，1999，在此引用作為參考)。其它的突變范例可在重組病毒N基因起始序列工程化，如通過改變N基因起始序列一個或多個核苷酸，如相應于JS cp45核苷酸62位置處。
從JS cp45和其它生物學來源的PIV突變體，得到了減毒突變的大“菜單”，其中每個突變都可以與其它突變組合，調節具有C、D和/或V缺失或剔除突變的重組PIV的減毒水平。例如，本發明重組PIV內的突變包括一個或多個，優選兩個或更多JS cp45突變。期望用于疫苗的本發明C、D和/或V缺失或剔除突變體經常有至少兩個，有時三個或更多減毒突變，以獲得滿意的可廣泛用于臨床的減毒。優選的，具有C、D和/或V缺失或剔除突變的重組PIV包含一個或多個突變，由特定于該突變的密碼子中的多個核苷酸替代使其穩定。
其它可以采用或轉入本發明C、D和/或V缺失或剔除突變體的突變可在非PIV非區段化負鏈RNA病毒中發現，并引入本發明PIV突變體。確定在異源負鏈RNA病毒中發現的的突變位于受體PIV基因組或反基因組的相應同源位點，使受體現存序列突變為該突變體基因型(通過相同或保守突變)，可以容易地獲得，在1999年4月13日Murphy等的美國臨時專利申請(案卷號17634-000600)名為“從克隆的核苷酸序列制備減毒的負鏈RNA病毒疫苗”中有說明，在此引用作為參考。
除了上述突變，感染性C、D和/或V缺失或剔除突變體被希望包含來自任何異源PIV或PIV類病毒(如HPIV1、HPIV2、HPIV3、牛PIV(BPIV)或鼠PIV(MPIV))的異源編碼或非編碼核苷酸序列，從而形成一個嵌合的基因組或反基因組。例如，本發明的重組PIV可能包括來自兩個或多個野生型或突變PIV株的序列，如HPIV1和HPIV3。或者，本發明C、D和/或V缺失或剔除突變體可能包括來自一個人和一個非人PIV的序列，如HPIV和BPIV。優選的，“受體”或“背景”基因組或反基因組中的一個或多個人PIV編碼或非編碼多核苷酸，被來自異源PIV或非PIV病毒的對應序列，單獨或與一個或多個選擇的點突變(如cp和/或ts突變)組合地替代，產生新的減毒疫苗株。分離的感染性PIV顆粒優選人PIV，更優選HPIV3(參見，如，1999年7月9日Bailey等的(案卷號15280-399000US)美國臨時專利申請，名為“減毒的人-牛嵌合副流感病毒疫苗”，在此引用作為參考)。
本發明的相關方面，提供了分離的感染性PIV顆粒，其包含來自HPIV3的核苷酸序列與至少一個來自異源PIV(如HPIV1、HPIV2、BPIV、MPIV)的序列的融合。例如，HPIV3的完全基因都可以被來自其它形式PIV的對應基因替代，如PIV1或PIV2的HN和/或F糖蛋白基因。或者，一個選擇的基因組區段(如HPIV1或HPIV2 HN或F中胞質尾區、跨膜區或胞外域)可以被對應HPIV3基因中的基因組區段替代，產生編碼嵌合蛋白的構建體，如具有PIV3的胞質尾區和/或跨膜區和PIV1或PIV2胞外域融合的融合蛋白。或者，來自一個PIV的基因或基因組區段可以被添加進(即，沒有替代)一個異源PIV背景中，在得到的克隆中創造出新免疫原特性。
除了具有C、D和/或V缺失或剔除突變的重組PIV，本發明還提供了相關的cDNA克隆、載體和粒子，均包含一個或多個此處所述的表型特異性突變。根據此處描述的方法，這些以選擇性組合引入是重組cDNA基因組或反基因組的分離的多核苷酸，產生表達時適當減毒的感染性病毒或亞病毒顆粒。這一過程，與常規表型評價一起，提供了具有期望特性(如減毒、溫度敏感、改變的免疫原性、冷適應、小噬菌斑、宿主范圍限制、遺傳穩定性等)的C、D和/或V缺失或剔除突變體。特別的，候選疫苗選擇那些減毒但仍然帶有足以在被免疫的哺乳動物宿主中誘導保護性免疫反應的免疫原性的。
本發明的另一些方面中，具有或沒有采用額外的減毒突變(如來自生物學來源的突變病毒)的C、D和/或V缺失或剔除突變體，被構建使其具有額外的核苷酸修飾，以產生期望的表型、結構或功能的變化。典型的，這種選擇的核苷酸修飾將特定導致表型變化，如生長特性、減毒、溫度敏感、冷適應、噬菌斑大小、宿主范圍限制或免疫原性的變化。文中的結構變化包括在PIV編碼cDNA中引入或消除限制性位點，以利于操作和鑒定。
在優選的實施方案中，C、D和/或V缺失或剔除突變體基因組或反基因組的核苷酸改變包括，通過部分或完全缺失一個額外病毒基因，或降低或消除(剔除)其表達來修飾額外的病毒基因。文中突變的靶基因包括核殼蛋白N、磷蛋白P、大聚合酶亞單位L、基質蛋白M、血凝素-神經氨酸酶蛋白HN、融合蛋白F。在重組病毒保持活性和感染性時，這些蛋白的任何一個可以被選擇性缺失、替代或重排，整體或部分，單獨或與其它期望的修飾組合，以獲得新的C、D和/或V缺失或剔除突變體。例如，這些基因的一個或多個可能整體或部分缺失，或其表達降低或消除(如，引入終止密碼子、RNA編輯位點突變、改變了起始密碼子決定的氨基酸的突變、或移碼突變)，以改變所產生的重組克隆的表型，改善了生長、減毒、免疫原性或其它期望表型特征。
本發明C、D和/或V缺失或剔除突變體的其它核苷酸修飾包括，重組基因組或反基因組中的一個被選擇基因的順式作用調節序列的缺失、插入、添加或重排。一個范例中，一個PIV基因的順式作用調節序列被改變為相應的異源調節序列，其可以是不同PIV相同基因的對應順式作用調節序列，或不同PIV基因的順式作用調節序列。例如，一個基因末端信號可以轉化或替代為相同PIV株的不同基因末端信號。其它一些實施方案中，核苷酸修飾可能包括重組基因組或反基因組內轉錄起始位點的插入、缺失、替代或重排，如消除一種蛋白質所選擇形式的轉錄起始位點。
此外，各種其它的遺傳改變可以在具有C、D和/或V缺失或剔除突變的PIV基因組或反基因組中產生，單獨或和一個或多個生物學來源的突變PIV的減毒突變組合。例如，非PIV來源的基因或基因組區段可以整體或部分插入。或者，可以改變基因排列順序，或一個PIV基因組啟動子用其反基因組的對應部分替代。在這種重組基因組或反基因組中的不同或額外的修飾有利于操作，如在各種基因間區域或其它位置插入唯一的限制性位點。不翻譯的基因序列可以被去除以增加插入外源序列的能力。
在另一些方面，編碼該重組PIV基因組或反基因組的多核苷酸或載體可以被修飾，使其編碼可在目的宿主中誘導保護性免疫的非PIV序列(如細胞因子、T輔助表位、限制性位點標記)或微生物病原(如病毒、細菌、或真菌)。在一種這類實施方案中，構建了含有呼吸道合胞病毒(RSV)基因或基因組區段的C、D和/或V缺失或剔除突變體，例如含有編碼RSV抗原蛋白(如F或G蛋白)、免疫原結構域或表位的基因。
本發明的相關方面，提供了產生具有C、D和/或V缺失或剔除突變的分離的感染性重組PIV的組合物(如具有PIV編碼cDNA的分離的多核苷酸或載體)和方法。本發明的這些方面中包括了新的分離的多核苷酸分子和載體，其包含具有經C、D和/或V(ORF)部分或完全缺失或使其表達降低或消除的一個或多個核苷酸改變而被修飾的PIV基因組或反基因組的分子。也提供了具有編碼N、P、L蛋白的一個或多個的分離的多核苷酸分子的相同或不同的表達載體。這些蛋白也可以直接由基因組或反基因組cDNA表達。載體優選在細胞或無細胞裂解液中表達或共表達，從而產生感染性C、D和/或V缺失或剔除突變PIV病毒顆粒或亞病毒顆粒。
以上產生C、D和/或V缺失或剔除突變PIV的方法和組合物產生感染性病毒顆粒或亞病毒顆粒，或其衍生物。重組感染性病毒與天然的PIV毒粒相當，并有同樣的感染性。可直接感染新鮮細胞。感染性亞病毒顆粒典型的是病毒顆粒的一個亞成分，在適當條件下可引發感染。例如，具有基因組或反基因組RNA和N、P、L蛋白的核殼是亞病毒顆粒的一個范例，當其進入細胞質中，可以引發感染。本發明提供的亞病毒顆粒包括缺少一個或多個蛋白質、蛋白質區段或其它病毒成分的病毒顆粒。
其它實施方案中，本發明提供了含有一個具有包含上述C、D和/或V缺失或剔除突變PIV基因組或反基因組的分離的多核苷酸分子的表達載體，和具有包含編碼PIV N、P、L蛋白的一個或多個分離的多核苷酸分子的(與前一個相同或不同的)表達載體的細胞或無細胞裂解液。這些蛋白質的一個或多個也可以從基因組或反基因組cDNA表達。表達后，基因組或反基因組和N、P、L組合產生感染性PIV病毒或亞病毒顆粒。
本發明其它實施方案中，提供了一種細胞或無細胞表達系統(如無細胞裂解液)，其含有一個具有包含上述C、D和/或V缺失或剔除突變PIV基因組或反基因組的分離的多核苷酸分子的表達載體，和具有包含編碼PIV N、P、L蛋白的一個或多個的分離的多核苷酸分子的表達載體。這些蛋白質的一個或多個也可以從基因組或反基因組cDNA表達。表達后，基因組或反基因組和N、P、L組合產生感染性PIV顆粒，如病毒或亞病毒顆粒。
本發明的重組PIV以各種組合物形式用于在對PIV敏感的宿主中產生期望的抗PIV免疫反應。本發明減毒的C、D和/或V缺失或剔除突變體能在感染的哺乳動物宿主中誘導保護性免疫應答，且足夠地減毒，不會在免疫化宿主中引發不可接受的嚴重呼吸疾病的癥狀。減毒的病毒或亞病毒顆粒可能存在于細胞培養物的上清中，從培養物中分離，或經部分或完全純化。病毒也可以冷凍干燥，根據需要與多種成分組合以儲藏或給藥宿主。
本發明進一步提供了新疫苗，其包含一種生理上可接受的載體和/或佐劑，以及經分離的減毒的C、D和/或V缺失或剔除突變PIV病毒顆粒或亞病毒顆粒。優選實施方案中，該疫苗包含具有至少一個，優選兩或多個額外的突變或以上所述的其它核苷酸修飾的C、D和/或V缺失或剔除突變PIV，使其減毒和免疫原性達到合適的平衡。疫苗配制為每劑103-107PFU的減毒病毒。病毒可能具有誘導抗單PIV株或抗多PIV株或組的減毒C、D和/或V缺失或剔除突變PIV。這方面，C、D和/或V缺失或剔除突變PIV在疫苗制劑中可與其它PIV疫苗株或其它病毒疫苗病毒如RSV組合。
在相關方面，本發明提供了在哺乳動物中刺激免疫系統以誘導抗PIV免疫應答的一種方法。該方法包含以足夠的免疫量，給藥存在于生理上可接受的載體和/或佐劑中的C、D和/或V缺失或剔除突變減毒PIV的制劑。一個實施方案中，免疫原組合物是包含具有至少一個，優選兩或多個額外的突變或以上所述決定所希望表型的其它核苷酸修飾的C、D和/或V缺失或剔除突變PIV疫苗。疫苗配制為每劑103-107PFU的減毒病毒。該疫苗可能具有減毒C、D和/或V缺失或剔除突變PIV病毒，其可誘導抗單PIV、抗多PIV(如HPIV1和HPIV3)或抗一個或多個PIV和非PIV病原如RSV的免疫反應。文中，C、D和/或V缺失或剔除突變PIV可誘導抗單PIV的單特異性免疫應答，或抗多PIV或抗一個或多個PIV和非PIV病原如RSV的多特異性免疫應答。或者，具有不同免疫原特性的C、D和/或V缺失或剔除突變PIV可組合于疫苗混合物中，或在協同治療方案中單獨給藥，以誘導抗單PIV、抗多PIV或抗一個或多個PIV和非PIV病原如RSV的更加有效的保護。優選的，免疫原組合物通過噴霧、滴入或氣霧劑給藥于上呼吸道。
圖2顯示放射免疫沉淀分析，表明C蛋白的表達在病毒rC-KO中被消除。(a)道35S-標記的細胞裂解液用多克隆C特異的兔抗血清免疫沉淀。在rJS中出現了相應于C蛋白的22kD條帶(空心箭頭)，但在rC-KO(a)道中沒有出現。(b)道細胞裂解液被特異于HPIV3HN蛋白的兩個單克隆抗體的混合物免疫沉淀。相應于HN蛋白的64kD條帶(實心箭頭)在二者細胞裂解液中都出現，確定它們確是HPIV3，且蛋白表達水平相似。
圖3顯示了模式的剔除突變rC-KO和rDV-KO與親本病毒rJS相比的多循環復制的結果。病毒效價以TCID50/ml表示，是兩次采樣的平均。
HPIV3是單負鏈病毒目副粘病毒科中新命名的呼吸道病毒屬的成員。其基因組為負義的單鏈RNA，長度為15462個核苷酸(Galinski等，Virology 165499-510，1988；Stokes等，Virus Res.2591-103，1992)。PIV3基因組至少編碼8個蛋白質核殼蛋白(N)、核殼磷蛋白(P)、非結構蛋白C、D蛋白、基質蛋白M、融合糖蛋白F、血凝素-神經氨酸酶糖蛋白HN和一個大聚合酶蛋白(L)(Collins等，p.1205-1243.于B.N.Fields(Kinpe等編輯)，Fields Virology，3rded，vol.1.Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996)。
M、HN、F蛋白是包膜相關的，后兩個是表面糖蛋白，和每個PIV蛋白一樣，是主要的中和和保護性抗原(Collins等，3rded.于“FieldsVirology”，B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley，R.M.Chanock，J.L.Melnick，T.P.Monath，B.Roizman，和S.E.Straus編輯，Vol.1，p1205-1243，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996)。在各種PIV中可比較的HN或F蛋白的顯著序列差異被認為是這種保護免疫特異性的基礎(Collins等，3rded.于“Fields Virology”，B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley，R.M.Chanock，J.L.Melnick，T.P.Monath，B.Roizman，和S.E.Straus編輯，Vol.1，p1205-1243，Lippincott-RavenPublishers，Philadelphia，1996；Cook等，Amer.Jour.Hyg.77150-159，1963；Ray等，J.Infect.Dis.162746-749，1990)。
除了包含4個ORF(即P、C、D、V)的P mRNA外(

圖1)，HPIV3基因分別以編碼單個蛋白的單mRNA轉錄(Galinski等，Virology186543-550，1992；和Spriggs等，J.Gen.Virol.672705-2719，1986)。在該mRNA中，P和C從獨立但重疊的ORF中翻譯(圖1)。盡管所有的副粘病毒都編碼P蛋白，只有呼吸道病毒和麻疹病毒屬編碼C蛋白。病毒個體在表達的C蛋白數量上和在體內和體外中該病毒的復制重要性上不同。仙臺病毒(SeV)從C ORF不同位點啟動，表達出四種蛋白C’、C、Y1、Y2，其翻譯起始點在mRNA上以此順序排列(Curran等，Enzyme 44244-249，1990；Lamb等，p.181-214，于D.Kingsbury(編輯)，The Paramyxoviruses，白金出版社，紐約，1991)，而HPIV3和麻疹病毒(MV)僅表達一個單獨的C蛋白(Bellini等，J.Virol.53908-919，1985；Sanchez等，Virology 147177-186，1985；和Spriggs等，J.Gen.Virol.672705-2719，1986)。
全部的四個C衍生蛋白被消除的一個活性重組SeV在體外不能有效復制(Kurotani等，Genes Cells.3111-124，1998)，而單個C蛋白的消除有復雜的效果(Cadd等，J.Virol.705067-74，1996；Curran等，Virology 189647-56，1992；Latorre等，J.Virol.725984-93，1998)。具有使C蛋白170位置處苯丙氨酸(F)改為絲氨酸(S)的單點突變的重組SeV在小鼠中減毒，但其在細胞培養中的復制沒有受到損害(Garcin等，Virology 238424-431，1997；Itoh等，J.Gen.Virol.783207-15，1997)。與SeV顯著相反，一個C-負型(C-minus)的麻疹病毒(MV)在Vero細胞中有效復制(Radecke等，Virology 217418-21，1996)，盡管其復制在人外周血細胞中受到限制，且在體內表現一定的減毒(Escoffier等，J.Virol.731695-8，1999；Valsamakis等，J.Virol.727754-61，1998)。
除了P和C ORF外，PIV3的P mRNA另有兩個ORF，即D和V。PIV3 D蛋白是P和D ORF的融合蛋白，通過轉錄編輯，或RNA編輯加工，從P基因中表達，其中在RNA編輯位點處將兩個非模板G殘基加入了P mRNA中(圖1)(Galinski等，Virology 186543-550，1992；和Pelet等，EMBO J.10443-448，1991)。BPIV3是其它副粘病毒中唯一表達D蛋白的，其表達機制相同。
呼吸道病毒、麻疹病毒和Rubulavirus屬的幾乎所有成員都表達V蛋白。唯一確定不表達的是HPIV1，因其缺少V ORF(Matsuoka等，J.Virol.653406-3410，1991，在此引用作為參考)。V ORF的特征是存在高度保守的半胱氨基酸豐富區(Cattaneo等，Cell 56759-764，1989；Park等，J.Virol.667033-7039，1992；Thomas等，Cell 54891-902，1988；和Vidal等，J.Virol.64239-246，1990；分別在此引用作為參考)。對存在于各HPIV3病毒的V ORF測序結果表明該ORF的表達是維持病毒功能所須的(Galinski等，Virology 15546-60，1986；Spriggs等，J.Gen.Virol.672705-2719，1986；Stokes等，Virus Res.2591-103，1992).
一個非模板G殘基加入RNA編輯位點后，BPIV3 V蛋白表達(Pelet等，EMBO J.10443-8，1991，在此引用作為參考)。但HPIV3中，2-4個翻譯終止子存在于編輯位點和V ORF之間，仍不清楚是否HPIV3是該ORF不表達的另一個例子，或是否其以另一種機制表達。一種可能性是HPIV3編輯還發生在P基因下游的第二處，盡管在細胞培養中沒有發現(Galinski等，Virology 186543-550，1992，在此引用作為參考)。或者，可能核糖體通過移碼接近V ORF。這類似MV P位點的情況。MV表達C、P、V蛋白，但也表達從P ORF到V ORF的移碼所合成的一個新的R蛋白(Liston等，J.Virol.696742-6750，1995，在此引用作為參考)。
盡管仍不清楚HPIV3表達V的方式，其V ORF在不同株之間的極度保守暗示其確實是表達的。V蛋白的功能不十分明確，但V-負型MV和SeV重組體在體外可以有效復制，但在體內復制降低(Delenda等，Virology 22855-62，1997；Delenda等，Virology 242327-337，1998；Kato等，EMBO J.16578-587，1997；Kato等，J.Virol.717266-7272，1997；和Valsamakis等，J.Virol.727754-7761，1998)。
PIV的病毒基因組也具有基因外前導序列和非轉錄尾序列，包含病毒復制和轉錄所必須的啟動子。因此，PIV遺傳圖以3’前導序列-N-P/C/D/V-M-F-HN-L-5’非轉錄尾序列表示。轉錄從3’起始，并通過基因邊緣處短的保守基元指導下的順序終止-起始機制進行。每個基因的上游末端具有一個基因起始信號(GS)，指導其各自mRNA的起始。每個基因的下游末端具有一個基因終止信號(GE)，指導多腺苷酸化和終止。對人PIV3 JS株(Genbank接入號Z11575，在此引用作為參考)和Washington株(Galinski M.S.，The Paremyxoviruses，Kingsbury，D.W.編輯，pp.537-568，白金出版社，紐約，1991；在此引用作為參考)，牛PIV3 910N株(Genbank接入號D80487，在此引用作為參考)的模式序列進行了描述。
此處所用術語“PIV基因”一般指PIV基因組編碼mRNA的部分，典型地，以基因起始信號(GS)開始于上游末端，以基因終止信號(GE)結束于下游末端。術語PIV基因也稱為“翻譯讀碼框”或ORF。除了基因外，PIV病毒基因組也包含非編碼基因間隔序列，以及具有病毒復制和轉錄所必須啟動子的基因外前導區和尾區。因此，PIV遺傳圖部分以3’-前導序列-N-P/C/D/V-M-F-HN-L-5’非轉錄尾序列表示。轉錄從3’起始，并通過基因邊緣處短的保守基元指導下的順序終止-起始機制進行。為構建本發明C、D、和/或V缺失突變體，必須對一個或多個PIV基因整體或部分缺失。這意味著可以在任何一個或多個PIV基因內的讀碼框和/或順式作用調節序列制造部分或全部的缺失。“基因組區段”是指PIV基因組上任意長度的連續核苷酸，可以是ORF、基因或基因外區域的一部分或其組合。
其它構建本發明C、D、和/或V突變體的方式包括構建“剔除”病毒，在不缺失大部分PIV基因組情況下降低或消除基因表達。特別的，C、D和/或V ORF表達的降低或消除，優選通過修飾PIV基因組或反基因組進行，通過引入一個終止密碼子、RNA編輯位點突變、改變起始密碼子所決定的氨基酸的突變，或在靶ORF內產生移碼突變。一個實施方案中，突變發生在編輯位點，阻止編輯并消除蛋白的表達，所述蛋白的mRNA由RNA編輯產生(Kato等，EMBO 16578-587，1997和Schneider等，Virology 227314-322，1997，在此引用作為參考)。
本發明的其它方面中，PIV基因組或反基因組經誘變在C、D和/或V ORF內產生一個或多個終止密碼子。一個實例中，C ORF中的一個甲硫氨酸起始密碼子轉為蘇氨酸。另一個實例中，在基因組或反基因組中突變(在核苷酸(nt)1795處(由T改為C)和nt 1813處(由C改為A))，引入兩個終止密碼子，終止密碼子相應于C ORF的7和26處。由此產生了一個C剔除突變病毒，命名為rC-KO。本發明的三個其它模式突變病毒中，D和V ORF單獨和組合地受到干擾。在單獨的D剔除突變體中，其命名為rD-KO，引入在全長反基因組nt 2692、2695和2698處由C改為A的突變干擾D ORF的表達。這些點突變在公認的D ORF處創造出三個連續的終止密碼子，導致D蛋白在372個氨基酸的嵌合D蛋白中在303密碼子后提前終止。在其它更詳細的方面，構建了一個單獨的V剔除突變體，rV-KO，在全長反基因組nt2845(A到T)和2854(C到T)處引入兩個點突變。這些點突變在可能的V ORF處創造提前的終止密碼子(氨基酸17和20處)。將rD-KO和rV-KO中的改變同時引入一個單克隆中，創造一個組合DV剔除突變體，rDV-KO。
如上所述，本發明在C、D和/或V ORF內具有一個或多個突變的重組PIV具有發展疫苗所非常期望的表型特征。此處所述C、D和/或V ORF整體或部分缺失，或降低或消除C、D和/或V ORF表達的修飾，在得到的病毒或亞病毒顆粒中特定導致多種期望的表型改變。在優選的實施方案中，C、D和/或V剔除或缺失突變體與相應的野生型或突變親本RSV株相比，表現減弱的病毒生長。與相應的野生型或突變親本RSV株相比，生長(如在細胞培養時)可能降低約2倍，更可能是約5倍，優選約10倍或更高(如在培養的7天時期內)。在更詳細的方面，本發明的重組RSV表現改變的病毒生長動力學。
具有C、D和/或V ORF缺失和剔除突變的重組疫苗病毒也優選的在體內表現減毒表型。例如在認可的人體內PIV復制的動物模型(如倉鼠和非洲綠猴(AGM))的下和/或上呼吸道中，復制與相應的野生型或突變親本PIV株的生長相比，降低約2倍，經常是約5、10、20倍，優選約100倍-1000倍，或更高(如，感染后連續3-8天中的一天或每天檢測)。除了上述減毒表型之外，或與之同時存在，具有C、D和/或V ORF缺失和剔除突變的重組PIV可能也表現在病毒噬菌斑大小、細胞病理學效果和/或免疫原性的改變。
本發明重組疫苗病毒的特別優選的特征在于，盡管如上所述其是減毒的，但仍然具有感染性，并可以在接種了的宿主中誘導所希望水平的抗PIV免疫應答。特別的，本發明候選疫苗重組體有足夠的免疫原性，可誘導對后來wt病毒攻擊的保護性免疫應答。如此處范例所示，從前感染C、D和/或V ORF剔除突變病毒，可在倉鼠和AGM中誘導抗HPIV3的顯著的HAI抗體，這表明，這些模式重組體是具有保護性的，并因此代表了有前途的候選疫苗。在本發明其它優選的疫苗重組體中，免疫原活性用來平衡減毒的水平，以獲得有用的候選疫苗，典型的標志為攻擊病毒(如rJS HPIV3)在模型宿主(如倉鼠和非人靈長類)下和/上呼吸道中復制的降低，降低倍數約50-100倍，100-500倍，優選約500-2000倍，多至3000倍或更高(如，攻擊后3-8天檢測)。因此，本發明的重組疫苗病毒保持免疫原活性的同時，也表現復制和生長的降低。這種令人驚訝的表型特征對疫苗的發展是非常有利的。
本發明提供了發展具有C、D和/或V ORF缺失或剔除突變的活的減毒RSV候選疫苗。這些重組病毒通過cDNA中間體和基于cDNA的回收系統構建。來自cDNA的重組病毒獨立復制，并以與生物學來源病毒相同的方式增殖。C、D和/或V ORF缺失和剔除突變體可以被進一步修飾，包含特定的減毒突變，以及多種其它突變和核苷酸修飾，產生期望的結構和表型效果。從cDNA獲得重組PIV的材料和方法的詳細描述，以及制造和檢測此處作為本發明附加方面所述的突變和核苷酸修飾，在以下文獻中有詳細說明Durbin等，Virology 235323-332，1997；1998年5月22日美國專利申請09/083,793；1997年5月23日美國臨時專利申請60/047,575(相應于國際申請WO98/53078)；1997年9月19日美國臨時專利申請60/059,385；分別在此引用作為參考。特別的，這些文件說明了誘變、分離和定性PIV以獲得減毒突變株(如溫度敏感(ts)、冷傳代(cp)、冷適應(ca)、小斑(sp)和宿主范圍限制(hr)突變株)和鑒定決定該減毒表型的遺傳變化的方法和步驟。與這些方法一致，上述文件詳細說明了，在認可的模型系統中(包括鼠和非人靈長類動物模型系統)，確定生物學來源的和重組產生的減毒人PIV的復制、免疫原性、遺傳穩定性和有效保護性的方法。此外，這些文件說明發展和檢測用于預防和治療PIV感染的免疫原組合物(包括單價和二價疫苗)的一般方法。以上引用的文件中也說明了產生感染重組PIV的方法，即，構建和表達編碼PIV基因組或反基因組的cDNA并與必須PIV蛋白基因共表達，還包括可用于產生感染PIV病毒克隆的以下模式質粒p3/7(131)(ATCC97990)，p3/7(131)2G(ATCC97889)，p218(131)(ATCC97991)，依據布達佩斯協議，分別保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC，10801，UniversityBoulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，USA)，以上提供了保藏號。
以上引用的文獻中也揭示了構建和評估經修飾的感染性重組PIV的方法，其引入了在生物學來源的PIV突變體(如冷傳代(cp)、冷適應(ca)、宿主范圍限制(hr)、小噬斑(sp)和溫度敏感(ts)突變株)(如JS HPIV3 cp45突變株)中發現的表型特異性突變。在這些突變株中發現的突變可以容易地用于具有C、D和/或V剔除突變的重組PIV中。在模式實施方案中，聚合酶L蛋白上有一個或多個減毒突變，如在相應于JS cp45的Tyr942、Leu992、Thr1558。優選的，這些突變通過生物突變體的相同或保守的氨基酸替代，引入本發明人-牛嵌合PIV中。因此，PIV重組體可能包括一個Tyr942被His替代、Leu992被Phe替代和/或Thr1558被Ile替代的突變。與這些被替代氨基酸保守的替代物可用于產生期望的突變表型。
來自生物學來源的PIV突變體的其它模式突變包括N蛋白的一個或多個突變，包括在相應于JS cp45殘基Val96、Ser389處的氨基酸替代。在詳細的方面，這些突變代表了Val96到Ala，或Ser389到Ala，或與之保守的替代。本發明重組PIV中有用的氨基酸替代還發生在C蛋白上，如在相應于JS cp45的Ile96上，優選與由Ile96到Thr的相同或保守的替代。來自生物學來源的PIV突變體的其它模式突變包括F蛋白的一個或多個突變，包括在JS cp45上相應于JS cp45殘基Ile420或Ala450處，優選由Ile420到Val、Ala450到Thr的替代或與之保守的替代。本發明其它PIV重組體采用HN蛋白的一個或多個氨基酸替代，以下為范例，重組PIV采用了相應于JS cp45殘基Val384處的一個突變，優選由Val384到Ala的替代。
本發明這方面的其它例子包括這種重組PIV，其在PIV基因組或反基因組非編碼部分(如3’端前導區)具有一個或多個突變。文中的突變范例可在重組病毒3’前導序列中(相應于JS cp45核苷酸23、24、28或45)的一個位置上工程化。其它的突變范例可在重組病毒N基因起始序列中工程化，如通過改變N基因起始序列一個或多個核苷酸，如在相應于JS cp45核苷酸62位置處。更詳細的方面，C、D和/或V剔除突變體在核苷酸23處由T變為C，在核苷酸24處由C變為T，在核苷酸28處由G變為T，和/或在核苷酸45處由T變為A。在基因外序列中的其它突變的例子是N基因起始序列相應于JS cp45核苷酸62位置處由A變為T。
可在C、D和/或V剔除突變中工程化的突變范例成功地被工程化，并在重組PIV中回收，如以下重組PIV克隆rcp45、rcp45 L、rcp45F、rcp45 M、rcp45 HN、rcp45 C、rcp45 F、rcp45 3’N、3’NL和rcp45 3’NCMFHN(Durbin等，Virology 235323-332，1997；Skiadopolos等，J.Virol.721762-8；1998年5月22日美國專利申請09/083,793；1997年5月23日美國臨時專利申請60/047,575(相應于國際申請WO98/53078)；1997年9月19日美國臨時專利申請60/059,385；分別在此引用作為參考)。
從JS cp45和其它生物學來源的PIV突變體，得到了減毒突變的大“菜單”，其中每個突變都可以與其它突變組合，調節帶有C、D和/或V缺失或剔除突變的重組體PIV的減毒、免疫原性和遺傳穩定性的水平。文中，本發明許多重組PIV包括一個或多個，優選兩個或更多來自生物學來源的PIV突變體的突變，如JS cp45中發現的突變之一或組合。優選的本發明重組體PIV具有多個并直至全部在JS cp45或其它生物學來源的PIV突變體中發現的突變。優選的，由于在決定每個突變的密碼子處有多個核苷酸替代，這些突變在具有C、D和/或V缺失或剔除突變的重組體PIV中穩定地抗回復突變。
其它可引入本發明C、D和/或V缺失或剔除突變PIV的突變是存在于異源PIV或更遠源的非區段化負鏈RNA病毒的突變，如減毒突變。特別的，負鏈RNA病毒中的減毒或其它期望的突變可被“轉移”，如被拷貝到C、D和/或V缺失或剔除突變體基因組或反基因組中的相應位置。簡要的說，異源負鏈RNA病毒中期望的突變被轉移到PIV受體。包括在異源病毒中定位該突變，經序列對比識別受體PIV中相應位點，將RSV受體的天然序列突變為該突變基因型(相同或保守突變)，在以下文獻中進行了表述1999年4月13日Murphy等(案卷號17634-000600)的美國臨時專利申請，名為“從克隆的核苷酸序列制備減毒的負鏈RNA病毒疫苗”，在此引用作為參考。如這些文獻所述，優選修飾受體基因組或反基因組以在突變位點編碼一個變化，其保守地相應于異源突變病毒中的變化。例如，如果突變病毒中相應于野生型序列的一個氨基酸替代標志突變的一個位點，則重組病毒相應殘基處可工程化產生一個相似的替代。優選，該替代應包括一個與突變病毒蛋白中替代殘基相似或保守的氨基酸。但對于突變蛋白中的替代殘基，也可能非保守地改變突變位點的天然氨基酸(如利用其它氨基酸破壞或消弱野生型殘基的功能)。在其中鑒別模式突變并轉移于本發明人-牛嵌合PIV中的負鏈RNA病毒包括其它PIV(如HPIV1、HPIV2、HPIV3、BPIV或MPIV)、RSV、仙臺病毒(SeV)、新城疫病毒(NDV)、猿猴病毒5(SV5)、麻疹病毒(MeV)、牛瘟病毒、犬瘟熱病毒(CDV)、狂犬病病毒(RaV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)等。本發明使用的多種突變范例在以上引用的文獻中做了說明，包括但不限于相應于的HPIV3 L蛋白456處苯丙氨酸(或保守性相關的氨基酸)并由此可轉移的RSV L的521處苯丙氨酸。在標志為缺失或插入的突變中，這些可以作為相應的缺失或插入被引入背景基因組或反基因組中，但缺失或插入蛋白片段的大小和氨基酸序列不一。
在前述引用的文獻中表述了多種其它類型的突變，它們可以容易地工程化引入本發明重組PIV中，調節生長、減毒、免疫原性、遺傳穩定性，或提供其它有利的結構和/或表型效果。例如，限制性標記可常規地引入C、D和/或V ORF缺失或剔除突變體反基因組或基因組中，以利于cDNA的構建和操作。
本發明中也可用的是使C、D和/或V ORF缺失和剔除突變PIV疫苗病毒作為嵌合人-牛PIV產生的方法和組合物。這些重組體可通過用人或牛PIV的異源基因、基因組區段或單個或多個核苷酸，替代或附加于部分或完整的牛或人PIV基因組或反基因組，產生一種人-牛嵌合PIV基因組或反基因組(參見，1999年7月9日案卷號為15280-399000US)Bailey等的美國臨時專利申請，名為“減毒的人-牛嵌合副流感病毒疫苗”，在此引用作為參考)。本發明的一個方面，人-牛嵌合PIV包含一個部分或完整的牛背景PIV基因組或反基因組，其組合了來自一個或多個人PIV的一個或多個異源基因或基因組區段。或者，人-牛嵌合PIV可包含部分或完整的人背景PIV基因組或反基因組，其組合了來自一個或多個牛PIV的一個或多個異源基因或基因組區段。選擇用于異源插入或添加到背景基因組或反基因組中的基因和基因組區段包括N、P、C、D、V、M、F、HN、或L的任何野生型或突變基因或基因組區段。在一個模式實施方案中，HPIV3受體或背景基因組的N基因的ORF被BPIV3 N基因的ORF所替代，產生了在非人靈長類宿主中表現與親本BPIV病毒類似的宿主范圍限制表型的感染性重組子。優選的，該異源人或牛基因編碼一個或多個PIV的保護性抗原，優選一個或多個HN和/或F糖蛋白或其免疫原結構域或表位，盡管其它蛋白可能也有助于保護性免疫應答，其因此也是優選的目標用于構建用于本發明的人-牛PIV嵌合病毒。
或者，具有C、D和/或V缺失或剔除突變的人-牛嵌合PIV可能包含編碼一個PIV抗原蛋白的胞質結構域、跨膜結構域、胞外域或免疫原性表位的一個或多個基因組區段。這些免疫原蛋白、結構域和表位在免疫化的宿主中產生新的免疫應答。例如，來自人PIV的一個或多個免疫原基因或基因組區段，對牛背景基因組或反基因組的添加或替代，產生一種重組的、嵌合的病毒或亞病毒顆粒，其能產生針對一種或多種特定人“供體”PIV株的免疫應答，而該牛骨架提供了減毒表型，使該嵌合體成為疫苗發展中有用的候選疫苗。
在C、D和/或V ORF中具有突變的人-牛嵌合PIV的構建，是通過將部分PIV背景基因組或反基因組中對應的基因或基因組區段替代為異源基因或基因組區段。或者，該異源基因或基因組區段可以被添加到例如一個基因的3’或5’非編碼區，作為一個額外的基因或基因組區段組合一個完整的PIV背景基因組或反基因組(或部分背景基因組或反基因組，當缺失其它基因或基因組區段時)。該異源基因或基因組區段可以被添加到部分或完整PIV背景基因組或反基因組的基因間隔區，從而不破壞該背景基因組或反基因組中的讀碼框。或者，該異源基因或基因組區段可以在相應于其相應基因或基因組區段的野生型基因位置上被加入或替代到部分或完整PIV背景基因組或反基因組中，其對應的基因或基因組區段由此被替代或移位(如到更加遠離啟動子的位置)。其它一些實施方案中，部分或完整PIV背景基因組或反基因組中，異源基因或基因組區段可以在比其對應的基因或基因組區段的野生型基因位置更加接近或遠離啟動子的位置加入或替代，分別可以增強或降低該異源基因或基因組區段的表達。這些和所引用參考文獻中所述的修飾可以引入本發明C、D和/或V ORF缺失和剔除突變體中。
產生嵌合PIV的異源免疫原蛋白、結構域或表位的引入尤其適用于在免疫化宿主中產生新的免疫應答。來自一個供體PIV的免疫原基因或基因組區段，對不同株的PIV受體基因組或反基因組的添加或替代所產生的免疫應答針對供體亞型或株、受體亞型或株、或針對二者。為達到這一目的，構建表達嵌合蛋白的C、D和/或V ORF缺失和剔除突變PIV，如表達免疫原蛋白，其特異于一種PIV的細胞質尾和/或跨膜區與特異于另一種PIV胞外域融合，產生人-牛融合蛋白，或具有兩種不同人PIV結構域的融合蛋白。優選實施方案中，C、D和/或V ORF缺失或剔除突變PIV基因組或反基因組在重組病毒顆粒或亞病毒顆粒中編碼同時具有人和牛二者的糖蛋白結構域或免疫原性表位的嵌合糖蛋白。例如，編碼人PIV HN或F糖蛋白的糖蛋白胞外域的異源基因組區段，可以與編碼相應牛PIV3 HN或F糖蛋白的胞質結構域和/或跨膜結構域的多核苷酸序列(即，基因組區段)相連，形成人-牛嵌合PIV基因組或反基因組。
其它一些實施方案中，用于疫苗制劑中的C、D和/或V ORF缺失和剔除突變體可容易地被修飾，以適應循環病毒的抗原漂移。典型的，修飾發生在HN和/或F蛋白中。一種PIV株的完整HN或F基因，或編碼其特定免疫原區的一個基因區段，通過替代不同PIV株或亞型受體克隆中的相應區段，或通過添加該基因的一個或多個拷貝，引入嵌合PIV基因組或反基因組cDNA，產生多種抗原形式。修飾后的PIV克隆的子代病毒可以用于抗一些PIV株的疫苗制劑。
人PIV的編碼和非編碼序列(如啟動子、基因末端、基因起始、基因間區或其它順式作用元件)經對應的異源部分如另一種人PIV或牛或鼠PIV的序列替代后，產生具有多種可能的減毒或其它表型效果的嵌合PIV。特別的，宿主范圍和其它期望表型來自用牛或鼠PIV基因引入人PIV背景中，其中牛或鼠基因在人細胞中不能有效作用(如，由于異源序列或蛋白與生物交互作用的人PIV序列或蛋白(即通常與被替代序列或蛋白協作，參與病毒轉運、翻譯、裝配等的序列或蛋白)不相容，或更典型的，與在許可和許可程度低的宿主之間存在宿主范圍限制差異的一種細胞蛋白或細胞環境的其它方面不相容)。在模式實施方案中，基于已知的牛和人PIV結構和功能方面，選擇牛PIV序列引入人PIV。
本發明其它方面中，產生了C、D和/或V ORF缺失和剔除突變PIV，其中嵌合基因組或反基因組進一步通過引入一個或多個在產生的嵌合病毒或亞病毒顆粒中特定導致產生減毒或其它期望表型的突變被修飾。這些突變可以重新產生，并根據合理設計的誘變方式檢測其減毒效果。或者，這些突變可以從現存的生物學來源突變PIV中鑒定，并引入本發明C、D和/或V ORF缺失和剔除突變PIV中。這些重組PIV提供了疫苗制劑所須的上述改善的減毒和免疫原特性。文中，以上引用的文獻說明了具有替代到部分HPIV3背景反基因組中的HPIV1HN和F基因的嵌合PIV重組體的構建，其進一步被修飾，以包含在HPIV3 JS cp45中發現的一個或多個減毒突變。一個這種嵌合重組體包含cp45 L基因中發現的所有減毒突變。也曾發現顯示異源(HPIV1)HN和F基因外的所有cp45突變都可以引入HPIV3-1重組體中，以產生一個減毒的嵌合候選疫苗。
引入C、D和/或V ORF缺失和剔除突變體的來自生物學來源PIV的減毒突變，可以天然存在或可以通過已知的誘變方法引入野生型PIV。例如，不完全減毒的親本PIV株可能通過病毒在細胞培養時添加化學誘變劑而產生，通過選擇亞適溫度時傳代的病毒以誘導生長限制突變，或通過選擇在細胞培養中產生小噬菌斑的被誘變病毒，方法在以上的引用文獻中有述。
“生物學來源的PIV”是指任何不通過重組方式產生的PIV。因此生物學來源的PIV包括所有天然存在的PIV，包括如具有野生型基因組序列的天然存在的PIV，和具有與參照野生型RSV序列相比有等位基因差異或突變基因組差異的PIV，例如具有特異導致產生減毒表型的突變的PIV。同樣，生物學來源的PIV包括親本PIV經人工誘變和選擇方法產生的PIV突變株。
如上所述，可以幾種方式產生足夠減毒的生物學來源的PIV。其中之一包括細胞培養中部分減毒的病毒在漸低的減毒溫度中傳代。例如，部分減毒的突變體在細胞培養中低于最適溫度下的傳代而產生。因此采用cp突變體或其它部分減毒PIV突變株，以使其在低溫培養時通過傳代而有效生長。與部分減毒的親本相比，選擇冷傳代突變PIV顯著降低了衍生株的任何殘存毒性。
另外，特定突變可以通過對部分減毒親本病毒進行化學誘變引入生物學來源的PIV中，如引入ts突變，或當該病毒已是ts突變時，引入額外的ts突變使足以產生比該減毒衍生物ts表型更加強的減毒和/或穩定性。ts突變引入PIV的方法包括，根據已知方法使病毒在誘變劑(如5-氟尿苷)存在時復制。也可以使用其它化學誘變劑。產生減毒的ts突變可產生在任何PIV基因內，盡管其特別可能的靶是聚合酶(L)基因。
在本發明使用的模式減毒PIV中，復制溫度敏感性的水平，是通過比較其在許可溫度和在幾種限制性溫度時的復制來確定。將與其在許可溫度時相比復制下降100倍或更多倍的最低溫度作為其截止溫度。在實驗動物和人中，PIV的復制和毒性都與該突變體截止溫度相關。
JS cp45 HPIV3被認為是相對遺傳穩定、高免疫原性和具有滿意的減毒性。對這種包含多種所述單個突變和組合突變的生物學來源和重組病毒的核苷酸序列分析顯示，減毒增加的每個水平都與特定核苷酸和氨基酸替代相關。上述引用文獻也公布了如何常規地區分沉默的偶發突變和以下突變，它們因感染性PIV克隆基因組或反基因組中引入的獨立或組合形式突變產生表型差異。該過程還包括對親本和衍生病毒的表型特征進行評估，檢測出導致如減毒、溫度敏感、冷適應、小噬菌斑和宿主范圍限制等這些期望性狀的突變。
這樣發現的突變被集結成一個“菜單”，可以按需要以單獨或組合形式引入，以調整C、D和/或V ORF缺失和剔除突變體的相關性狀，如減毒、免疫原性、對減毒表型回復突變的遺傳抗性等。與以上所述相符，從cDNA中得到感染性PIV的能力使可以在C、D和/或VORF缺失和剔除突變體中引入具體的工程化變化。特別的，用感染性重組PIV來檢測生物學來源減毒PIV株中具體的突變，如特定導致產生ts、ca、att和其它表型的突變。由此產生需要的突變，并引入重組的、C、D和/或V ORF缺失和剔除突變PIV疫苗株中。從cDNA中得到PIV的能力使能夠將突變單獨或以各種選擇的組合，常規地引入全長cDNA克隆中，隨后可以容易地確定具有這些所引入突變的被援救重組病毒的表型。
通過在感染性PIV克隆中鑒定并引入與期望表型(如cp或ts表型)有關的特定的生物學來源突變，本發明提供了在鑒定的突變處，或位于其緊鄰處的其它位點特異性修飾。多數生物學來源PIV中的減毒突變是單核苷酸位點改變，但也可利用重組技術將其它“位點特異性”突變引入生物學來源的或重組PIV中。此處所述位點特異性突變包括1-3直到約5-15或更多已變核苷酸(如變自野生型PIV序列，或選擇的突變PIV株序列，或經誘變的親本重組PIV克隆)的插入、替代、缺失或重排。這類位點特異性突變可被引入選擇的生物學來源的點突變處，或其區域內。或者，突變可以引入PIV克隆的其它區域，如順式作用調控區或編碼蛋白活性位點、結合位點、免疫原性表位等的核苷酸序列或其附近。位點特異性PIV突變體典型的具有一個期望的減毒突變，但可能還表現與減毒無關的其它表型變化，如增強或擴大的免疫原性和/或改善的生長。位點特異性突變的進一步范例包括在決定減毒點突變的密碼子處引入額外的穩定的核苷酸改變的重組PIV。如可行，在親本突變PIV或重組PIV克隆中決定減毒氨基酸變化的密碼子處，引入兩個或更多核苷酸替代，產生對減毒表型的回復具有遺傳抗性的生物學來源或重組PIV。其它一些實施方案中，位點特異性的核苷酸替代、插入、缺失或重排被引入靶核苷酸位置的上游(N末端方向)或下游(C末端方向)(如從1到3，5-10，直到15核苷酸或更靠近5’或3’端)，以例如構建或消除現有的順式作用元件。
除了單和多點突變和位點特異性突變，此處公布的C、D和/或VORF缺失和剔除突變PIV的變化包括除缺失或消除的C、D和/或V ORF或基因組區段以外的整個基因或基因組區段的缺失、插入、替代或重排。基于變化的特點(即，少量堿基可能被改變以插入或消除一個免疫原性表位或改變一個小基因組區段，而大量堿基參與基因或大的基因組區段的添加、替代、缺失或重排)，這些突變可以改動供體或受體基因組或反基因組中少量堿基(如，從15-30堿基，到35-50堿基或更多)，大量核苷酸(如，50-100，100-300，300-500，500-1000個堿基或更多)，或幾乎全部或全部基因(如，1000-1500，1500-2500，2500-5000個，500-65000個核苷酸或更多)。
在其它方面，本發明提供了來自生物學來源PIV的突變(如cp和ts突變)附加于重組PIV克隆中，在這進一步修飾的PIV克隆中伴隨有涉及相同或不同基因的其它突變類型。每個PIV基因的表達水平可被選擇性地改變，或整體或部分，單獨或組合，被添加、缺失、替代或重排，以獲得表現新的疫苗特征的C、D和/或V ORF缺失或剔除突變PIV。因此，除了來自生物學來源PIV突變體的減毒突變外，或與之組合，本發明也提供了基于對感染性PIV克隆遺傳工程化的多種使之減毒或改變C、D和/或V ORF缺失或剔除突變PIV表型的其它方法。編碼靶基因或基因組區段(包括嵌合PIV基因組或反基因組中用于引入感染性克隆的供體或受體基因或基因組區段)的分離的多核苷酸序列上可產生多種改變。更特定的，本發明為了在重組PIV中獲得期望的結構和表型改變，許可引入使一個或多個來自親本基因組或反基因組的核苷酸缺失、替代、引入或重排的突變，以及缺失、替代、引入或重排整個基因或基因組區段的突變，到C、D和/或V ORF缺失或剔除突變PIV克隆內。
因此提供了C、D和/或V ORF缺失和剔除突變PIV中的修飾方法，其中除了缺失或去除的C、D和/或V ORF或基因組區段外，僅改變或消除了選定基因的表達，例如，在選定PIV的編碼序列中引入終止子，改變與一個PIV基因與可操作連接啟動子的相對位置，引入上游起始密碼子以改變其表達速率，修飾(如，通過改變位置、變動現有序列或用一個異源序列替代現有序列)GS和/或GE轉錄信號以改變其表型(如生長和轉錄時的溫度限制等)，和其它決定病毒復制、選定基因的轉錄或選定RNA的翻譯的變化程度和性質的缺失、替代、添加和重排。文中，任何非生長所必須的PIV基因都可以在重組PIV中被消除或修飾，以在毒性、病原性、免疫原性和其它表型特征方面產生期望的效果。
此外，PIV基因組或反基因組中也可產生許多其它遺傳改變，以單獨或與生物學來源突變PIV來源的一個或多個減毒突變一起，引入人-牛嵌合PIV，例如用以調整其生長、減毒、免疫原性、遺傳穩定性或其它有利的結構和/或表性效果。前述的引用文獻中也公布了這些附加類型的突變，且其可容易地工程化引入本發明人-牛嵌合PIV。例如，可以在人-牛嵌合PIV反基因組或基因組中常規地引入限制性位點標記，以促進cDNA的構建和操作。
本發明也提供了在C、D和/或V ORF缺失或剔除突變PIV中的遺傳修飾，其改變或消除了靶C、D和/或V ORF外所選擇的基因或基因組區段的表達，且不從PIV克隆中去除該基因或基因組區段。例如，這可以通過引入改變一個起始密碼子編碼排列或在選擇的編碼序列中引入終止密碼子的突變，改變基因位置或引入上游起始密碼子以改變其表達，改變GS和/或GE轉錄信號以改變表型(如生長，轉錄中的溫度限制等)來實現。本發明更詳細的方面中，提供C、D和/或V ORF缺失和剔除突變PIV，其除靶C、D和/或V ORF外的基因的表達在翻譯水平被消除，該基因或其區段沒有缺失，例如通過如在翻譯讀碼框(ORF)中引入多個翻譯終止子。這產生了活的病毒，其一個選擇的基因在翻譯水平沉默，但該基因未缺失。其它實施方案中，多個終止子被引入靶ORF中。或者，一個突變被引入RNA編輯位點，或引入改變起始密碼子所決定的氨基酸的突變。這些剔除病毒形式在組織培養中常表現生長速率降低和小噬菌斑。因此，這些方法提供了其它的新型的減毒突變，其消除非主要病毒保護性抗原的病毒基因的表達。文中在未缺失基因或基因組區段產生的剔除病毒表型，也可以通過此處所述缺失誘變的方法獲得，以有效地排除可能恢復靶蛋白合成的糾正性突變。C、D和/或V ORF缺失和剔除突變體的幾種其它基因剔除可以利用本領域已知的其它設計和方法獲得(例如，Kretschmer等，Virology 216309-316，1996；Radicle等，Virology 217418-412，1996；Kato等，EMBOSS J.16178-587，1987；Schneider等，Virology 277314-322，1996；在此分別引用作為參考)引入本發明C、D和/或V ORF缺失或剔除突變PIV中的其它突變包括直接作用于順式作用信號的突變，這可以利用PIV微基因組突變分析檢測出。例如對前導序列、非轉錄尾序列和側翼序列的插入和缺失分析檢測出病毒的啟動子和轉錄信號，并提供了一系列與RNA復制或轉錄下降的各種水平相關的突變。這些順式作用信號的飽和誘變(每個位點輪流改為各種核苷酸)也檢測出許多降低(或一種情況是增加)RNA復制或轉錄的突變。此處所述任何突變都可插入C、D和/或V ORF缺失或剔除突變PIV基因組或反基因組中。以上引用文獻中描述的PIV微基因組可輔助完整的反基因組cDNA對反式作用蛋白和順式作用RNA序列的評價和操作。
C、D和/或V ORF缺失和剔除突變PIV中的其它突變包括基因組3’末端被其反基因組的對應部分替代，隨之改變了RNA復制和轉錄。一個模式實施方案中，特定PIV蛋白(如保護性HN和/或F抗原)的表達水平可因其天然序列被所合成并設計的符合有效翻譯的序列替代而增加。文中顯示，密碼子的使用是哺乳動物病毒蛋白翻譯水平的主要影響因素(Haas等，Current Biol.6315-324，1996，在此引用作為參考)。通過重組，使編碼PIV HN和/或F蛋白(二者是主要保護性抗原)的mRNA中使用的密碼子最適合，可使這些基因的表達增加。
另一個模式實施方案中，修飾了一個選定PIV基因的翻譯起始位點(優選包括-3位置處的核苷酸)周圍的序列(單獨或同時引入一上游起始密碼子)，因決定了翻譯的上/下游調節而改變了PIV基因的表達。另外，或與此處所述的其它修飾組合，改變病毒任何選定基因的轉錄GS或GE信號，可調節C、D和/或V ORF缺失和剔除突變PIV的基因表達。其它實施方案中，C、D和/或V ORF缺失和剔除突變PIV的基因表達的調節發生在轉錄水平。一個方面中，將PIV基因圖譜中選定基因的位置改為更為接近或遠離啟動子，從而該基因的表達將分別更高效或更低效。根據這方面，對特定基因表達進行調節，產生比野生型水平降低或增加2倍，更典型的是4倍，上至10倍或更高的基因表達，同時被交互地位置替代的基因的表達水平有相當量的下降。這些和其他轉位變化，產生具有減毒表型的新的C、D和/或V ORF缺失和剔除突變PIV，如具有參與RNA復制的選定病毒蛋白表達的下降，或具有如抗原表達增加之類的其它期望性狀。
本發明感染性C、D和/或V ORF缺失和剔除突變PIV也可根據這里公布的方法和組合物進行工程化，增強免疫原性并誘導比野生型PIV或親本PIV感染所導致的更強的保護。例如，來自PIV異源株或型的或如RSV的非PIV的免疫原性表位可通過在編碼基因組或反基因組的多核苷酸序列上適當的核苷酸變化，被加入重組克隆。另外，本發明突變PIV可被工程化地加入或消除(如通過氨基酸插入、替代或缺失)免疫原、蛋白結構域或與期望或不期望免疫反應相關的特殊蛋白。
本發明方法中，額外的基因或基因組區段可能被插入C、D和/或V ORF缺失和剔除突變PIV基因組或反基因組中，或其附近。這些基因可與受體基因受相同的調控，或受一套獨立轉錄信號的調控。目的基因包括以上說明的PIV基因和非PIV基因。目的非PIV基因包括編碼細胞因子(如IL-2到IL-18，尤其是IL-2、IL-6、IL-12、IL-18)、IL-γ和富含T輔助細胞表位的蛋白的基因。這些額外的蛋白可作為獨立蛋白或現存PIV蛋白(如HN或F)的多余拷貝表達。這能夠在數量和質量上改變和提高抗PIV的免疫應答。
C、D和/或V ORF缺失或剔除突變PIV中涉及全部病毒基因或基因組區段的缺失、插入、替代和其它突變產生非常穩定的候選疫苗，在免疫抑制的個體中尤其重要。這些改變多數導致疫苗株的減毒，其它則特定導致不同類型的期望表型改變。例如，附屬(即體外生長所不必須的)基因編碼特異地干擾宿主免疫的蛋白，是良好的候選疫苗(參見Kato等，EMBO J.16578-87，1997，在此引用作為參考)。疫苗病毒中消除這類基因將降低毒性和致病性，并/或提高免疫原性。
本發明更詳細的方面，C、D和/或V ORF缺失和剔除突變體被用作其它病原(特別是如RSV等呼吸道病原)保護性抗原的載體。例如，重組PIV可以被工程化包含編碼RSV保護性抗原的序列，以產生感染性減毒疫苗病毒。RSV cDNA的克隆和其它公布于一些文獻中1995年9月27日美國臨時專利申請60/007,083；1996年9月27日美國專利申請08/720,132；1996年7月15日美國臨時專利申請60/021,773；1997年5月9日美國臨時專利申請60/046,141；1997年5月23日美國臨時專利申請60/047,634；1997年7月15日美國臨時專利申請08/892,403(相應于國際申請WO98/02530)；1999年4月13日名為“從克隆的核苷酸序列制備減毒的嵌合呼吸道合胞病毒”的美國臨時專利申請(案卷號17634-000520)；1999年4月13日Murphy等名為“從克隆的核苷酸序列制備減毒的負鏈RNA病毒”的美國臨時專利申請(案卷號17634-000600)；Collins等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 9211563-11567，1995；Bukreyev等，J.Virol.706634-6641，1996；Juhasz等，J.Virol.71(8)5814-5819，1997；Durbin等，Virology235323-332，1997；He等，Virology 237249-260，1997；Baron等，J.Virol.711265-1271，1997；Whitehead等，Virology 247(2)232-9，1998a；Whitehead等，J.Virol.72(5)4467-4471，1998b；Jin等，Virology251206-214，1998；Whitehead等，J.Virol.73(4)3438-3442，1999；Burkreyev等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962367-2372，1999；為各種目的分別在此全文引用作為參考)。
根據本發明的這方面，提供了包括至少一個RSV序列的C、D和/或V ORF缺失和剔除突變PIV。例如，HPIV3的單個基因可被來自人RSV對應的基因替代。或者，一個被選定的異源基因或基因組區段(如編碼RSV糖蛋白細胞質尾、跨膜區或胞外域)替代了HPIV3中對應基因組區段，例如在HPIV3的相同基因或HPIV3中不同基因內的對應部分，或者加入HPIV3基因組或反基因組的非編碼區中，產生嵌合的PIV-RSV糖蛋白。一種實施方案中，人RSV F基因的一個基因組區段替代了對應的HPIV3基因組區段，產生編碼嵌合蛋白的構建體，如，其中PIV的胞質尾和/或跨膜區融合了RSV的胞外域，產生一種新的減毒病毒，和/或抗PIV/RSV二者的多價疫苗。
除了上述對C、D和/或V ORF缺失或剔除突變體的修飾外，也可在PIV克隆中制造不同或額外的修飾，以利于操作，如在各種基因間隔區或其它位置插入唯一的限制性位點(如G和F基因間插入唯一的StuI位點)。不翻譯的基因序列也可以被去除，以增加插入外源序列的能力。
本發明其它方面中，提供了產生分離的感染性PIV的組合物(如具有人-牛嵌合PIV編碼cDNA的多核苷酸和載體)。利用這些組合物和方法，可以從一個PIV基因組或反基因組、核殼蛋白(N)、核殼磷蛋白(P)和一個大的聚合酶蛋白(L)中產生感染性PIV。本發明的相關方面中，提供了在重組PIV中引入前述結構和表型改變以產生感染性減毒疫苗病毒的組合物和方法。
可利用多種已知方法，將之前定義的突變引入感染性C、D和/或V ORF缺失或剔除突變克隆中。關于DNA的“感染性克隆”，是指合成或其它來源的cDNA或其產物，可轉錄出作為產生感染性病毒或亞病毒顆粒基因組的模板的基因組或反基因組RNA。因此，可以利用傳統方式(如定點誘變)將定義的突變引入基因組或反基因組的cDNA拷貝。此處所述使用基因組或反基因組cDNA的亞片段裝配完整基因組或反基因組cDNA的優勢是，每個區域都可以分別操作(越小的cDNA越易裝配)，因此易于裝配出完整cDNA。因此，該完整基因組或反基因組cDNA或其任何亞片段可用作寡核苷酸定向誘變的模板。這可通過單鏈噬菌粒形式介導(如使用伯樂實驗室(Richmond，CA)的Muta-gene試劑盒)，或直接用雙鏈噬菌粒做模板(如使用Strategene(La Jolla，CA)的Chameleon誘變試劑盒)，或通過用包含目的突變的寡核苷酸引物或模板中任何的一個進行聚合酶鏈式反應來完成。然后可以將一個突變的亞片段裝配于該完整基因組或反基因組cDNA中。還有許多已知并可得的產生突變的技術，可用于在PIV基因組或反基因組cDNA中產生目的突變。突變范圍不一，可以從單核苷酸改變到包含一個或多個基因或基因組區段的大cDNA片段的替代。
因此，在一個作為范例的實施方案中，利用伯樂的Muta-gene噬菌粒體外誘變試劑盒引入突變。簡述如下，編碼PIV基因組或反基因組一部分的cDNA克隆到質粒pTZ18U中，并轉化CJ236細胞(LifeTechnologies)。按生產商的建議制備噬菌粒制劑。通過在該基因組或反基因組的需要位點引入一個改變的核苷酸，設計出用于誘發突變的寡核苷酸。擴增帶有遺傳改變的基因組或反基因組的質粒，突變片段被重新引入該全長基因組或反基因組克隆。
本發明也提供了從一個或多個分離的多核苷酸(如一個或多個cDNA)中產生感染性人-牛嵌合PIV的方法。根據本發明，構建編碼PIV基因組或反基因組的cDNA，使其與必須的病毒蛋白在細胞內或體外共表達以形成感染性PIV。“PIV反基因組”是指作為子代PIV基因組合成模板的經分離的正義多核苷酸分子。優選，構建的cDNA是相應于復制中間體RNA的正義PIV基因組或反基因組，以降低其與編碼產生轉錄復制核殼所必需蛋白的互補序列(如編碼N、P和L蛋白的序列)的正義轉錄本雜交的可能。
本發明的重組PIV基因組或反基因組僅需要包含該病毒或亞病毒顆粒的感染性所必須的基因或其部分。此外，該基因或其部分可以多于一種多核苷酸分子形式提供，即，一個基因可以通過互補或類似方法來源于單獨的核苷酸分子，或可直接由基因組或反基因組cDNA表達。
重組PIV是指一種PIV或PIV類的病毒或亞病毒顆粒，其直接或間接來自一個重組表達系統，或從重組表達系統所產生的病毒或亞病毒顆粒中增殖產生。該重組表達系統具有包含一個可操作地連接的轉錄單位的重組表達載體，該轉錄單位具有一個或幾個遺傳元件或對PIV基因表達有調控作用的元件，如啟動子、一個可轉錄為PIV RNA的結構或編碼序列，以及合適的轉錄起始和終止序列。
為了從cDNA所表達的基因組或反基因組中獲得感染性PIV，將該基因組或反基因組與那些在以下情況中必須的PIV蛋白共表達，這些情況包括(i)產生可進行RNA復制的核殼；(ii)使子代核殼可進行RNA復制和轉錄。這種基因組核殼的轉錄提供了其它PIV蛋白，并引發有效感染。另外，共表達也可提供有效感染所需的其它PIV蛋白。
本發明感染性PIV是通過在細胞內或無細胞系統中共表達編碼PIV基因組或反基因組RNA的一個或多個經分離的多核苷酸分子以及編碼在產生轉錄復制核殼中必須的病毒蛋白的一個或多個多核苷酸分子來產生的。用于共表達產生感染性PIV病毒的蛋白包括主要核殼蛋白(N)、核殼磷蛋白(P)、大的聚合酶蛋白(L)、融合蛋白(F)、血凝素-神經氨酸酶糖蛋白(HN)和基質蛋白(M)。PIV C、D、和VORF的產物也可用于該目的。
構建編碼PIV基因組或反基因組的cDNA，使其與必須的病毒蛋白在細胞內或體外共表達以形成感染性PIV。“PIV反基因組”是指作為子代PIV基因組合成模板的分離的正義多核苷酸分子。優選，構建的cDNA是相應于復制中間體RNA的正義PIV基因組或反基因組，以降低其與編碼對轉錄復制核殼必需的蛋白的互補序列的正義轉錄本雜交的可能。
本發明的一些實施方案中，重組PIV(rPIV)基因組或反基因組僅需要包含對該病毒或病毒顆粒的感染性所必需的基因或其部分。此外，該基因或其部分可以多于一種多核苷酸分子形式提供，即，一個基因可以通過互補或類似方法來源于單獨的核苷酸分子。其它實施方案中，PIV基因組或反基因組編碼病毒生長、復制和感染所必需的所有功能結構，而無須輔助病毒或質粒或輔助細胞系提供的病毒功能結構的參與。
“重組PIV”是指一種PIV或PIV類的病毒或亞病毒顆粒，其直接或間接來自一個重組表達系統，或從重組表達系統中產生的病毒或亞病毒顆粒中增殖產生。該重組表達系統具有包含一個可操作地連接的轉錄單位的重組表達載體，該轉錄單位具有一個或幾個遺傳元件或對PIV基因表達有調控作用的元件，如啟動子、一個可轉錄為PIV RNA的結構或編碼序列，以及合適的轉錄起始和終止序列。
為了從cDNA所表達的PIV基因組或反基因組中獲得感染性PIV，將該基因組或反基因組與那些在以下情況中必須的PIV N、P和L蛋白共表達，這些情況包括(i)產生可進行RNA復制的核殼；(ii)使子代核殼可進行RNA復制和轉錄。這種基因組核殼的轉錄提供了其它PIV蛋白，并引發有效感染。另外，共表達也可提供有效感染所需的其它PIV蛋白。
PIV基因組或反基因組與上述病毒蛋白的共同合成也可在體外實現(無細胞系統)，如利用組合的轉錄-翻譯反應，再轉染細胞。另外，RNA基因組或反基因組也可在體外合成，并轉染表達PIV蛋白的細胞。
本發明的某些實施方案中，編碼生產可轉錄和翻譯的核殼中所必需蛋白的互補序列由一個或多個輔助病毒提供。輔助病毒可以是野生型或突變型。優選，該輔助病毒與PIV cDNA編碼的病毒在表型上可區分。例如，希望提供與該輔助病毒發生免疫反應，而不與PIV cDNA編碼的病毒反應的單克隆抗體。這些抗體可以是中和抗體。一些實施方案中，可使用抗體親和層析，將輔助病毒與重組病毒分開。可將突變引入PIV cDNA(如在HN或F糖蛋白基因中)，提供來自輔助病毒的抗原多樣性，有助于這類抗體的獲得。
本發明另外的實施方案中，N、P、L或其它期望的PIV蛋白由一個或多個非病毒表達載體編碼，其可以與編碼基因組或反基因組的表達載體相同或不同。也可根據需要包括其它蛋白，各由自己的載體編碼，或由編碼N、P、L或其它期望的PIV蛋白中的一個或多個或完整基因組或反基因組的載體編碼。來自轉染質粒的基因組或反基因組和蛋白的表達由T7 RNA聚合酶啟動子控制下的各個cDNA產生，而該T7 RNA聚合酶啟動子是由T7 RNA聚合酶表達系統(如表達T7RNA聚合酶的痘苗病毒MVA株重組子)的感染、轉染、轉導提供的(Wyatt等，Virology 210202-205，1995，在此全文引用作為參考)。可通過轉化哺乳動物細胞或成熟RNA或蛋白轉染，獲得該病毒蛋白和/或T7 RNA聚合酶。
構建用于本發明的PIV反基因組，通過排列克隆的cDNA區段(其集合代表了完整的反基因組)，通過PIV mRNA或基因組RNA反轉錄拷貝的聚合酶鏈式反應等實現(PCR述于美國專利4,683,195和4,683,202中和PCR方案方法和應用指導(PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications)，Innis等，學術出版社，San Diego，1990，分別在此全文引用作為參考)。例如，得到的第一構建體包含具有從合適的啟動子(T7 RNA聚合酶啟動子)開始延伸的反基因組左臂末端的cDNA，該構建體裝配在適當的表達載體中，如質粒、裝配型質粒、噬菌體或DNA病毒載體。載體可通過誘變和/或合成多連接體的插入而修飾，這種多連接體帶有便于裝配的唯一的限制性位點。N、P、L或其它期望的PIV蛋白可裝配于一個或多個載體上以便于制備。反基因組質粒右手末端可包含需要的其它序列，如側翼的核酶和串聯的T7轉錄終止子。核酶可以是錘頭型(產生具有單個非病毒核苷酸的3’末端)(如Grosfeld等，1995，同上)，也可以是任何其它適合的核酶(如δ肝炎病毒的核酶，產生沒有非PIV核苷酸的3’末端)(Perrotts等，Nature 350434-436，1991，在此全文引用作為參考)。然后左和右手末端利用共同的限制性位點連接。
cDNA構建過程中或構建完成后，可在PIV基因組或反基因組中進行多種核苷酸的插入、缺失和重排。例如，可以合成特定需要的核苷酸序列，利用方便的限制性酶位點插入cDNA的合適區域。或者可使用如位點特異性誘變、丙氨酸掃描、PCR誘變或其它本領域現有技術將突變引入cDNA。
構建編碼基因組或反基因組cDNA的其它方法，包括用改進的PCR條件進行反轉錄-PCR，以使亞單位cDNA成分降低至一或兩個(如，在Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 915695-5699，1994中所述的，在此引用作為參考)。其它實施方案中使用不同的啟動子(如T3，SP6)或不同的核酶(如δ肝炎病毒的核酶)。增殖可使用不同的DNA載體(如裝配型質粒)，以更能容納大的基因組或反基因組。
編碼基因組或反基因組的分離的多核苷酸(如cDNA)通過轉染、電穿孔、機械插入、轉導等方式插入合適的宿主，轉染細胞是能夠支持有效PIV感染的，如HEp-2、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細胞。分離的多核苷酸序列的轉染可通過磷酸鈣介導的轉染(Wigler等，Cell 14725，1978；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics7603，1981；Graham和Van der Eb，Virology 52456，1973)、電穿孔(Neumann等，EMBO J.1841-852，1982)、DEAE-葡聚糖介導的轉染(Ausubel等編輯，Current Protocols in Molecular Biology，John Wileyand Sons，Inc.，New York，1987)、陽離子脂質介導的轉染(Hawley-Nelson等，Focus 1573-79，1993)或商業化轉染試劑如LipofectACE(Life Technologies，Gaithersburg，MD)或其它同類物，引入培養細胞中(上述文獻在此全文引用作為參考)。
如上所述，本發明一些實施方案中，N、P、L或其它期望的PIV蛋白由一個或多個輔助病毒編碼，這種輔助病毒在表型上與編碼基因組或反基因組的那些無顯著差異。N、P、L或其它期望的PIV蛋白或其各種組合也可以由一個或多個表達載體編碼，這種表達載體與編碼基因組或反基因組的載體相同或不同。也可根據需要包括其它蛋白，其各由自己的載體編碼，或由編碼N、P、L和其它期望的PIV蛋白中的一個或多個或完整基因組或反基因組的載體編碼。
通過提供感染性PIV克隆，本發明允許在PIV基因組(或反基因組)中重組產生廣泛的改變，使得到特定導致期望表型改變的確定的突變。“感染性克隆”是指合成的或其它方式產生的可以直接進入感染性毒粒的cDNA或其產物RNA，而該感染性毒粒可以轉錄成作為感染性病毒或亞病毒顆粒模板的基因組或反基因組RNA。如上所述，許多常規方法(如定點誘變)可將特定的突變引入基因組或反基因組的cDNA拷貝中。此處所述用基因組或反基因組cDNA亞片段裝配完整基因組或反基因組cDNA的優點在于，每個區域都可以分別操作，小的cDNA比大的cDNA容易操作，并容易裝配出全長的cDNA。因此，完整基因組或反基因組cDNA或其選擇的亞片段可用作寡核苷酸指導的誘變的模板。這可通過單鏈噬菌粒形式介導(如使用伯樂實驗室(Richmond，CA)的MUTA-gen試劑盒)，或直接用雙鏈噬菌粒做模板(如使用Strategene(La Jolla，CA)的Chameleon誘變試劑盒)，或通過用包含目的突變的寡核苷酸引物或模板中任何一個進行聚合酶鏈式反應來完成。然后可以將一個突變的亞片段裝配于該完整基因組或反基因組cDNA中。還有許多已知并可得的產生突變的技術，可用于在本發明PIV基因組或反基因組cDNA中產生目的突變。
因此，在一個作為范例的實施方案中，突變利用伯樂的MUTA-gene噬菌粒體外誘變試劑盒引入。簡述如下，編碼PIV基因組或反基因組的cDNA克隆到質粒pTZ18U中，并轉化CJ236細胞(LifeTechnologies)。按生產商的建議制備噬菌粒制劑。通過在該基因組或反基因組的需要位點引入一個改變的核苷酸，設計出用于誘發突變的寡核苷酸。擴增帶有遺傳改變的基因組或反基因組的質粒。
突變范圍可以從單核苷酸改變到具有一個或多個基因或基因組區段的大cDNA片段的引入、缺失或替代。基因組區段可能相應于結構和/或功能域(如蛋白的胞質內、跨膜或胞外域)，活性位點(如介導與其它蛋白結合或其它相互作用的位點)，表位(如刺激抗體結合和/或體液或細胞免疫的位點)等。這方面有用的基因組區段范圍從當基因組區段編碼小的蛋白功能域(如表位)時的約15-35個核苷酸，至約50、75、100、200-500和500-1500或更多個核苷酸。
在感染性PIV中引入特定突變的能力有許多應用，包括PIV病原和免疫原機構的操作。例如PIV蛋白(包括N、P、M、F、HN和L蛋白，和C、D、V ORF產物)的功能可通過引入可以消除或降低蛋白表達水平或產生突變蛋白的突變來得以調節。各種基因組RNA的結構特征，如啟動子、基因間隔區和轉錄信號，也可用本發明的方法和組合物常規操作。反式作用蛋白和順式作用RNA序列的效果也可容易地確定，例如用完整反基因組cDNA，在平行分析中利用PIV小基因組(Dimock等，J.Virol.672772-2778，1993，在此全文引用作為參考)，其依賴拯救的狀態可用于表征那些在非復制依賴性的感染性病毒中過強抑制從而難以回收的突變體。
本發明重組PIV內基因或基因組區段的某些替代、插入、缺失和重排(如編碼選定蛋白或蛋白區域的基因組區段替代，如編碼胞質尾、跨膜區或胞外域，表位位點或區域、結合位點或區域、活性位點或具有活性位點的區域等)在結構和功能上與來自相同或不同PIV或其它來源的現有“對應”基因或基因組區段相關。與野生性或親本PIV或其它病毒株相比，修飾產生了具有期望表型變化的新重組子。例如，這類重組子可能表達一個PIV的胞質尾和/或跨膜區與另一個PIV的胞外域融合的嵌合蛋白。這類重組子的其它范例表達重復蛋白區域，如表達重復免疫原區域。
此處所述“對應”基因、基因組區段、蛋白或蛋白區域，典型的是異源來源(如來自不同的PIV基因)，或代表不同PIV型或株中的相同(即，同源或等位)基因或基因組區段。文中選擇的典型的對應物具有總的結構特點，如每個對應物可能編碼一個相當的蛋白或蛋白區，如胞質結構域、跨膜結構域、胞外域、結合位點或區域、表位位點或區域等。對應結構域和其編碼基因組區段包含許多種的集合，其具有由在該結構域或基因組區段變異體之間相同的生物活性所定義的大小和序列變化。
用于產生本發明重組PIV的對應基因和基因組區段，以及這里公布的其它多核苷酸，常與被選擇的多核苷酸“參照”序列(如其它選擇的相當序列)具有基本同一性。此處所述“參照序列”是指用作序列比較的已定義的序列，例如全長cDNA的一個區段或基因，或一個完整的cDNA或基因序列。一般參照序列為至少20個核苷酸，經常是至少25個核苷酸，更多為至少50個核苷酸。因為兩個多核苷酸可能(1)各具有一個彼此相同的序列(即，完整多核苷酸序列的一部分)，和(2)進一步各包含二者間存在差異的序列，典型的兩個(或更多)多核苷酸的序列比較是通過在“對比窗”上對比兩個多核苷酸的序列，以發現并比較序列相似的局部區域。此處所述“對比窗”是指至少20個連續核苷酸位置的概念性區段，其中一個多核苷酸序列可以與至少20個連續核苷酸的一個參照序列相比較，并且與參照序列(不含有添加或缺失)相比較，其中該多核苷酸序列在對比窗的部分，可能包括兩序列最優對比時20％或更少的添加或缺失(即間隙)。用于對對比窗進行序列對比的序列最優排列可通過以下方法進行Smith和Waterman的局部同源算法(Adv.Appl.Math.2482，1981；在此引用作為參考)，和Needleman&Lipman的同源對比算法(J.Mol.Biol.48443，1970；在此引用作為參考)，Pearson&Lipman的相似性搜索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444，1988；在此引用作為參考)，以及這些算法的計算機應用(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，于Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，WI，在此引用作為參考)，或通過檢查，并選擇出這多種方法產生的最佳排列(即，對比窗上序列相似性最高)。術語“序列同一性”指對比窗上兩個多核苷酸序列相同(核苷酸逐個比較)。術語“序列同一性百分比”是比較對比窗上兩個最優對比的序列，確定存在于兩序列中的一致核酸堿基(如A、T、C、G、U或I)以產生相符位點的數量，用相符位點的數量除以對比窗中位點的總數(即窗的大小)，結果乘以100得到序列同一性百分比。此處所述術語“基本同一性”指一個多核苷酸序列的特征，其中該多核苷酸序列與參照序列在至少20個核苷酸的對比窗，經常是在至少25-50個核苷酸的對比窗中比較，具有至少85％的序列同一性，優選至少90％-95％的序列同一性，更多的是至少99％的序列同一性，序列同一性百分比的計算是通過在對比窗上，比較參照序列和可能包括總共20％或更少的該參照序列的缺失或添加的多核苷酸序列而計算得出的。該參照序列可能是一個大序列的一個子集。
除了這些多核苷酸序列關系，本發明重組PIV編碼的蛋白和蛋白區域也典型的選擇具有保守性關系，即，與選擇的參照多肽具有基本的序列同一性或序列相似性。當用于多肽，術語“序列同一性”指肽在相應位置上具有相同氨基酸。術語“序列相似性”指肽在相應位置上具有相同或相似氨基酸。術語“基本同一性”指兩個肽序列，當最優排列時(如用程序GAP或BESTFIT)，具有至少80％的序列同一性，優選至少90％的序列同一性，更優選的是至少95％的序列同一性或更高(如99％的序列同一性)。術語“基本相似性”指兩個肽序列的序列相似百分比相當。優選的，不一致的殘基位點因保守氨基酸替代而差異。保守氨基酸替代是指具有相似側鏈的殘基可互換。例如，具有脂肪族側鏈的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸；具有脂肪族羥基側鏈的氨基酸是絲氨酸、蘇氨酸；具有含酰胺側鏈的氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺；具有芳香族側鏈的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸；具有堿性側鏈的氨基酸是賴氨酸、精氨酸、組氨酸；具有含硫側鏈的氨基酸是半胱氨酸、甲硫氨酸。優選的保守氨基酸替代組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸，天冬酰胺-谷氨酰胺。此處對氨基酸的簡寫依據傳統用法(Immunology-A Synthesis，第2版，E.S.Golub&D.R.Gren.編輯，Sinauer Associates，Sunderland，MA，1991，在此引用作為參考)。這20種常規氨基酸的立體異構體(如D-氨基酸)、非天然氨基酸(如α，α-二取代氨基酸)、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常規氨基酸也是本發明多肽的合適成分。非常規氨基酸包括4-羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基賴氨酸、ε-N-乙酰賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、ω-N-甲基精氨酸，以及其它相似氨基酸和亞氨基酸(如4-羥脯氨酸)。此外，氨基酸還可以經糖基化和磷酸化等修飾。
根據本發明選擇候選疫苗病毒時，用已知的方法決定活性、減毒性和免疫原性的標準。最希望用于本發明疫苗的病毒必須有活性，穩定的減毒表型，在免疫宿主體內有復制(即使水平低)，并在受接種者中有效地誘導免疫應答的產生，足以賦予對抗之后野生型病毒感染所導致的嚴重疾病的保護性。本發明重組PIV不僅是有活性，比先前的候選疫苗更適合地減毒的，而且在體內遺傳上更穩定—仍具有刺激保護性免疫應答的能力，同時，因多處修飾的存在可將這種保護擴展，如，誘導抗不同病毒株系或亞型的保護，或一種不同的免疫基礎賦予其這種擴展的保護，如分泌型與血清型免疫球蛋白，或細胞免疫等。
本發明重組PIV可以在多種被熟知并通常認可的體內和體外模型中檢測，以確認疫苗使用中的足夠減毒、對表型回復的抗性和免疫原性。體外分析中，修飾了的病毒(如多次減毒的、生物學來源的或重組PIV)被測試如病毒復制的溫度敏感性(即ts表型)、小噬菌斑或其它期望的表型。修飾了的病毒進一步在PIV感染的動物模型中測試。在此引用的各種文獻中描述了多種動物模型。評價PIV候選疫苗的減毒和免疫原性的PIV模式系統，(包括嚙齒類動物和非人靈長類)，在本領域被廣泛接受，從中獲得的數據與人中PIV感染、減毒和免疫原性非常一致。
與以上所述一致，本發明還提供用于疫苗的分離的感染性重組PIV病毒組合物。作為疫苗一個成分的減毒病毒典型的是經分離和純化的形式。分離的是指處于非野生型病毒所處的天然環境的PIV，如處于被感染人的鼻咽處。更常見的，分離的是指包括該減毒病毒細胞培養或其它人工培養基的一個成分，其中病毒可繁殖，并在控制的背景下定性。例如，本發明的減毒PIV可在感染的細胞培養物中產生，從細胞培養物中分離獲得，并被加入穩定劑。
本發明重組PIV可直接用于疫苗制劑中，或根據需要，利用本領域技術人員所熟知的冷凍干燥方法進行冷凍干燥。凍干的病毒典型的保存在約4℃。使用前，凍干的病毒重溶于穩定性溶液中(如鹽溶液、SPG、Mg++和HEPES)，其中也可能存在或不存在佐劑，以下將進一步說明。
本發明PIV疫苗包含按此處所述方法產生的、有效致免疫量的PIV作為活性成分。修飾的病毒可與一種生理上可接受的載體和/或佐劑共同引入宿主。本領域已知的載體有水、緩沖的水、0.4％鹽、0.3％甘氨酸，透明質酸等。得到的溶液可包裝使用，或冷凍干燥，凍干的制劑在給藥之前與無菌溶液混合，方法如上所述。根據要求，組合物可能包含藥學上可接受的輔助物質，使其接近生理狀態，如pH調節和緩沖劑、滲漲度調節劑、濕潤劑等，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。可接受的佐劑包括不完全弗氏佐劑、MPLTM(3-O-去乙酰單磷酸脂質A；RIBI ImmunoChem Research，Inc，Hamilton，MT)和IL-2(遺傳研究所，劍橋，MA)，以及其它本領域熟知的合適佐劑。
用如上所述的PIV組合物經噴霧、滴劑、口服、局部或其它途徑免疫后，宿主的免疫系統產生特異于PIV病毒蛋白(如F和HN糖蛋白)的抗體作為應答。用如上所述的有效致免疫量的PIV接種，宿主至少部分或完全地對PIV的感染免疫，或對輕微或嚴重PIV感染有抗性，尤其在下呼吸道中。
疫苗接種的宿主可以是任何對PIV或其它近源病毒感染敏感，且對接種株的抗原產生保護性免疫應答的動物。相應的，本發明提供了制作多種用于人和動物的疫苗的方法。
包含本發明PIV的疫苗組合物給藥對PIV敏感或易受PIV感染攻擊的宿主，以增強該宿主的自身免疫力。這種量是“有效免疫原劑量”。使用中，在有效劑量內給藥的PIV精確量依賴于宿主健康狀態和體重、給藥方式、制劑性質等，但一般范圍是從每個宿主約103-約107或更多噬菌斑形成單位(PFU)的病毒，常見的是每個宿主約104-約106噬菌斑形成單位(PFU)的病毒。任何情況時，疫苗制劑應提供足量的本發明經修飾的PIV，以有效保護宿主對抗嚴重的或威脅生命的PIV感染。
根據本發明產生的PIV可以和其它PIV血清型或株病毒組合，達到抗多種PIV血清型或株的保護效果。此外，抗多種PIV血清型或株的保護效果也可通過組合多種血清型或株的保護性表位于一個病毒中。典型的，當給藥多種病毒時混合同時給藥，但也可以分別給藥。一種毒株的免疫可以產生抗同種或不同血清型不同株的保護。
一些情況下，可能希望將本發明PIV疫苗與誘導對其它藥物(特別是兒童期病毒)保護性應答的疫苗組合使用。本發明另一些方面中，PIV可用作其它病原(如呼吸道合胞病毒RSV或麻疹病毒)保護性抗原的載體，將編碼這些保護性抗原的序列引入用來制造感染性PIV的PIV基因組或反基因組中。
對于所有個體，重組PIV疫苗的精確給藥量以及給藥時間和重復性依賴于宿主健康狀態和體重、給藥方式、制劑性質等，但劑量范圍一般是從每個患者約103-約107或更多噬菌斑形成單位(PFU)的病毒，更常用的是每個患者約104-約106PFU的病毒。任何情況時，疫苗制劑應提供足量的減毒PIV，以有效刺激或誘導抗PIV的免疫應答，如可通過補體活化、噬菌斑中和和/或酶聯免疫分析，及其它方法進行確定。這方面，也需要監視個體是否有上呼吸道疾病出現的跡象和癥狀。對給藥獼猴，該疫苗的減毒病毒在受接種者鼻咽中的復制水平，比野生性病毒低約10倍或更低，比不完全減毒PIV低約10倍或更低。
新生兒和幼兒中，需要多次給藥以誘導足夠水平的免疫。給藥開始于出生后第一個月，兒童期按需要間隔給藥，如隔2個月，6個月，1年，2年，以維持對天然(野生型)PIV感染的足夠抗性。相似的，對重復性或嚴重PIV感染特別敏感的成人可能需要多次免疫以建立和/或維持保護性免疫應答，包括醫務工作者、護理工作者、家庭中有兒童的成員、老人、心肺功能損壞的個體。誘導的免疫水平可通過檢測中和分泌和血清抗體確定，并需要調整劑量或重復接種以維持合適的保護水平。進一步，不同的疫苗病毒給藥不同的受體組。例如，表達細胞因子或其它富含T細胞表位的蛋白的工程化PIV株可能特別適宜成人，而非幼兒。
根據本發明產生的PIV疫苗可以組合表達PIV其它亞型或株蛋白的病毒，以產生抗多種PIV亞型或株的保護。或者，該疫苗病毒可以包含工程化引入一個PIV克隆的多種PIV亞型或株的保護性表位。
本發明的PIV疫苗誘導抗因后來感染野生型PIV時產生的嚴重下呼吸道疾病(如肺炎和細氣管炎)的免疫應答。盡管這種自然循環的病毒仍有感染性，特別在上呼吸道，其接種導致鼻炎發病幾率的降低以及對后來的野生型感染增強的抗性。接種后，出現可檢測水平的宿主造成的血清抗體，和可在體外和體內中和同源(同一亞型)野生型病毒的分泌性抗體。許多情況下宿主抗體也能中和不同的非疫苗亞型的野生型病毒。
本發明優選的PIV候選疫苗顯示比在人體內自然循環的野生型病毒顯著降低的毒性。該病毒足夠減毒使感染癥狀在大多數免疫個體中不發生。一些情況時，該減毒病毒仍然可能分布到未經免疫的個體中。但由于其毒性基本去除，在免疫和偶然宿主中不會發生嚴重的下呼吸道感染。
確定PIV候選疫苗的減毒水平可通過例如量化被免疫宿主呼吸道中的病毒量，并將其與野生型PIV或其它被認為是候選疫苗株的減毒PIV的相應量比較。例如，在高度敏感的宿主(如猩猩)上呼吸道中，本發明的減毒病毒復制與野生型病毒復制水平相比，被很大程度地限制，如降低10-1000倍。為了進一步降低鼻液溢的發展(其與病毒在上呼吸道中的復制相關)，一個理想的候選疫苗病毒應表現在上下呼吸道復制水平都降低的性質。但為了賦予免疫個體保護，本發明的減毒病毒應在人中有足夠的感染性和免疫原性。確定PIV在感染宿主鼻咽中水平的方法是本領域所熟知的。
本發明疫苗誘導的免疫水平可通過測定中和分泌性和血清型抗體的量來監測。基于檢測結果，按需要調整疫苗劑量或重復接種，以維持理想水平的保護。進一步，不同的疫苗病毒可能適宜不同的受體組。例如，表達富含T細胞表位的其它蛋白的工程化PIV株可能特別適宜成人，而非幼兒。
本發明另外的方面中，PIV被用作呼吸道瞬時基因治療的載體。根據這一實施方案，重組PIV基因組或反基因組包含能編碼目的基因產物的序列。該基因產物受與控制PIV表達相同或不同的啟動子控制。通過共表達N、P、L或其它需要的PIV蛋白和重組PIV基因組或反基因組來產生，并編碼目的基因產物的序列，將這樣的感染性PIV給藥患者。給藥一般通過氣溶膠、噴霧器或其它局部施用，給藥接受治療患者的呼吸道。重組PIV的給藥量應足以產生治療或預防水平的期望的基因產物表達。這種方法中可給藥的代表性基因產物優選適合瞬時表達的，如白介素-2、白介素-4、γ-干擾素、GM-CSF、G-CSF、紅細胞生成素以及其它細胞因子、葡糖腦苷脂酶、苯丙氨酸羥化酶、囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶、細胞毒素、腫瘤抑制基因、反義RNA和疫苗抗原。
以下為說明目的提供了一些實施例，并非是對其的限制。這些實施例記錄了使用重組cDNA系統在C ORF中引入一個代表性突變，所述C ORF在表達上完全沉默。作為本發明的另一代表，構建并檢測了參與在D和V ORF中引入終止密碼子以使相應蛋白表達沉默的突變。記錄了這些突變對病毒復制和致病性的效果，由此確立了這些突變在發展抗PIV的活減毒疫苗中的作用。
在以下所述的一種名為rC-KO的突變病毒中，C蛋白的表達因C起始密碼子由甲硫氨酸改為蘇氨酸并在C ORF的氨基酸7和26處引入兩個終止密碼子而消除。用鼠和靈長類動物模型都證明，rC-KO突變體在體內和體外都高度減毒。rC-KO也能賦予對抗野生性HPIV3攻擊的顯著的保護。
盡管對D和V ORF單獨進行干擾不會顯著影響病毒在體內或體外的復制，對二者的同時干擾會使在體內的復制減弱。這些結果顯示HPIV3 C、D、V蛋白各自參與病毒復制，這些模式突變提供了發展重組PIV候選疫苗的有用工具。
p3/7(131)2G(PIV反基因組的核苷酸1215-3903)從PmlI到BamHI的片段被亞克隆到質粒pUC119中(pUC119(PmlI-BamHI))，其經過改造在多克隆區包括了一個PmlI位點。用Kunkel的方法對pUC 119(PmlI-BamHI)進行定點誘變(Kunkel等，Methods Enzymol.154367-382，1987)，以引入C、D和V讀碼框(ORF)中如下所述的突變。構建編碼C剔除突變(rC-KO)的反基因組cDNA使用兩個引物，引入可使C ORF表達沉默的突變(見表1，圖1C)。第一個突變引物通過改變全長反基因組上核苷酸1795(從T到C)將C ORF起始密碼子由ATG改為ACG(甲硫氨酸到蘇氨酸)，并通過改變核苷酸1813(從C到A)將C ORF氨基酸位置7處的絲氨酸改為一個終止密碼子。第二個突變引物通過改變核苷酸1869(從C到A)將C ORF氨基酸位置26處的絲氨酸替換一個終止密碼子。這些引入C ORF中的突變在P ORF中是沉默的。構建編碼D、V和DV剔除突變(rD-KO，rV-KO，rDV-KO)的反基因組cDNA突變的引入分別干擾D和V ORF的表達。D剔除引物在全長反基因組核苷酸2692，2695，2698處引入C到A的改變(表1，圖1)。這些點突變在可能的D ORF上創造了三個連續的終止密碼子，導致D蛋白在圖1C所示的372氨基酸的嵌合D蛋白303密碼子處提前終止。在D ORF上更早地引入這些終止密碼子而不引起P ORF上并發的編碼改變是不可行的。因此，該突變ORF的表達并非完全消除，而是產生一個具有P區域N末端241個氨基酸與D區域62個氨基酸(而非131個氨基酸)融合的截短的D蛋白。V剔除突變引物在全長反基因組核苷酸2845(從A到T)和2854(從C到T)處引入點突變(表1)。這些突變在可能的V ORF中創造提前的終止子(氨基酸位置17和20處)。這些突變在P ORF中是沉默的，但在D蛋白中引入兩個氨基酸替代，即，Q354L，A357V。兩個引物可以同時用于單突變反應以創造組合的DV剔除突變。
每個全長克隆的PmlI到BamHI片段被完整測序以確定引入突變的存在并確定其它突變沒有被偶然的引入。然后分別將這些片段克隆回如上所述全長克隆p3/7(131)2G(Durbin等，Virology 235323-332，1997)，以創造四種不同的反基因組cDNA克隆。
第一次傳代收獲物上清中D、V和DV剔除突變病毒在LLC-MK2細胞中按前述方法進行三次噬菌斑純化(Hall等，Virus Res.22173-184，1992，在此引用作為參考)。C剔除病毒因不能形成容易辨認的噬菌斑，所以不能由噬菌斑純化從生物學來源的克隆中獲得。因此，它在96孔板(每個稀釋度12孔)的LLC-MK2細胞中用兩倍的稀釋度進行最終稀釋。從第三輪噬菌斑純化或最終稀釋度獲得的生物學來源的克隆重組病毒在LLC-MK2細胞32℃擴增兩次，以獲得用于進一步表征的病毒。回收的重組病毒的序列分析從感染細胞單層培養物清澈的培養基中濃縮病毒，使用前述聚乙二醇沉淀法(Durbin等，Virology 235323-332，1997)。依照生產商的建議的步驟用TRIzol試劑(Life Technologies)純化RNA。依推薦的方案用Advantage RT-for-PCR試劑盒(Clontech，Palo Alto，CA)進行RT-PCR。對照反應除了反應中不含反轉錄酶以外都相似，以確定該PCR產物完全來自病毒RNA而非可能的污染cDNA。使用引物獲得全長反基因組跨越核苷酸1595-3104的PCR片段。該片段包括重組病毒全部的C、D和V ORF。得到的PCR產物用環式雙脫氧核苷酸序列分析(New England Biolabs，Beverly，MA)進行測序。免疫沉淀分析蛋白抗兩種不同的C肽多抗原肽(MAP)技術(Research Genetics，Huntsville，AL)在兔中培養出兩個PIV3 C特異性抗血清。這兩個肽在C蛋白上分別跨越了氨基酸區域30-44和60-74。各C肽的8個拷貝被放在一個分支的載體核上，與弗氏佐劑一起分別注射兔(每個肽兩只兔)。兔在2和4周被指定的MAP進行增強，并在4，8和10周取血。每個抗血清都以高效價識別用作免疫原的C肽，并在放射性免疫沉淀分析(RIPA)中都能從HPIV3感染細胞中沉淀出C蛋白。同樣的，我們企圖獲得抗D和V蛋白的抗血清，但未能成功；產生的抗血清對其本身肽的效價極低，在野生型病毒感染的細胞中不能發現D或V蛋白的產生。
LLC-MK2的T25細胞單層被在感染復數為5(MOI＝5)的rC-KO，重組JS wt病毒(rJS)感染，或僅模擬感染，在32℃培養。感染后24小時，用無甲硫氨酸的DEME(Life Technologies)洗滌，然后在含10uCi/u35S甲硫氨酸的負型DMEM(Met(-))中再培養6個小時。收獲細胞，洗滌3次，在1ml RIPA緩沖液(1％(w/v)脫氧膽酸鈉，1％(v/v)Triton X-100，0.2％(w/v)SDS，150mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH7.4)中重懸，凍溶，6500xg離心。細胞抽提物轉移到一個新的eppendorf管中，兩種C抗血清的混合物(每個5μl)加入到各樣品中，不斷混合下在4℃培養2小時。mAb 454/11和101/1的混合物(識別HPIV3 HN糖蛋白(van Wyke Coelingh等，J.Virol.611473-1477，1987))10ul加入各樣品以確定回收的病毒確實是HPIV3。各樣品中加入200ul 10％蛋白A葡聚糖珠(Sigma，St.Louis，MO)，不斷混合下4℃培養過夜，沉淀免疫復合物。每個樣品都被變性，還原，并依據生產商建議在4-12％聚丙烯酰氨凝膠(NuPAGE，Novex，San Diego，CA)中分析。干燥凝膠進行放射自顯影分析。rPIV3s的多循環復制T25培養瓶中單層LLC-MK2細胞以感染復數(MOI)為0.01被rCKO，rDV-KO，或rJS雙份感染，在5％CO232℃培養。以間隔每24小時連續7天從各培養瓶中取250ul樣品，并瞬時冷凍。每時間點上用等體積的新鮮培養基替換。各樣品在96孔板的單層LLC-MK2細胞中32℃培養7天后測定效價。病毒通過血細胞吸附檢測并以log10TCID50/ml表示。動物實驗每組21只4-6周大的金色敘利亞倉鼠，每只倉鼠鼻內接種0.1mlEMEM(Life Technologies)，其中含有105PFU的rC-KO，rDV-KO，rJS，cp45(JS wt病毒生物學來源的活減毒衍生物)，或呼吸道合胞病毒(RSV)。接種后第3、4和5天，每組中除了接種RSV以外的5只倉鼠被處死，取出肺和鼻甲。鼻甲和肺在L-15(Quality Biological，Gaithersburg，MD)中被勻漿，分別制備10％或20％的懸液，樣品快速冷凍。樣品中的病毒在96孔板的單層LLC-MK2細胞中32℃培養7天后測定效價。病毒通過血細胞吸附檢測，并計算每組5只倉鼠每天的平均log10TCID50/g。在接種后0和28天采集每組剩余6只倉鼠的血清。利用前述的血凝素抑制(HAI)分析(van Wyke Coelingh等，Virology143569-582，1985)評價血清抗體對各病毒的反應。第28天每組剩余的倉鼠，包括那些用RSV免疫的倉鼠，用106PFU的生物學來源PIV3 JSwt病毒鼻內攻擊。攻擊后4天處死動物，收集肺和鼻甲，并按上述方法處理。對攻擊后樣品病毒含量的測定如上法。另進行了一項獨立的研究，rD-KO和rV-KO如上法給藥倉鼠，除了動物不被攻擊。
每組四只非洲綠猴(AGM)被鼻內和氣管內接種106PFU的rC-KO，rDV-KO，JSwt，或cp45，方法如前述對于獼猴的早期研究(Durbin等，Vaccine 161324-30，1998)。鼻咽管樣品在接種后連續12天每天采取，氣管樣品在接種后2，4，6，8，10天采取。樣品被快速冷凍并儲存在-70℃，直到所有的樣品都采齊。樣品中的病毒在96孔板的單層LLC-MK2細胞中32℃培養7天后測定效價。病毒通過血細胞吸附檢測，并計算每天的平均log10TCID50/ml。在接種后0和28天采集每只猴的血清，測定PIV3 HAI抗體對各種突變體和PIV3野生型(JS)實驗性感染的應答。接種后28天，AGM被106PFU生物學來源PIV3野生型病毒以1ml接種量鼻內和氣管內攻擊。鼻咽管樣品在攻擊后0，1，2，4，6，8，10，12天每天采樣，氣管樣品在接種后2，4，6，8，10天采樣。樣品被快速冷凍并儲存，依照前述方法測定病毒效價。重組突變體rC-KO、rD-KO、rV-KO和rDV-KO的回收制備編碼以下四種突變病毒的HPIV3反基因組cDNAs(參見表1，圖1)(i)rC-KO，其中C ORF的起始密碼子由M變為T，并在密碼子7和26處引入翻譯終止子；(ii)rD-KO，其中在372氨基酸的嵌合D蛋白的密碼子304、305和306處引入了翻譯終止子；(iii)rV-KO，在V ORF位置17和20處引入了終止密碼子；以及(iv)rDV-KO，其中組合了ii和iii中的突變。除了引入V ORF(iii)中的兩個終止密碼子外(其不能避免地導致D區域兩個氨基酸替代，即Q354L和A357V)，各突變在重疊的ORF是翻譯沉默的。此外，D中的終止密碼子沒有更早地引入該ORF中，是因為它們能改變P。每個突變都和一個翻譯沉默限制位點標記共同引入(表1)。表1引入rPIV3的核苷酸變化以產生rC-KO、rD-KO、rV-KO和rDV-KO3病毒rPIV3名稱 氨基酸替代 野生型/突變序列的核苷酸序列1引入的限制性酶切位點rC-KO，突變#1 Met-1至Thr 1794-ATG CTA AAA ACT ATC AAA TCA TGG(SEQ ID NO.1)PIIM ISer-7至終止信號 ACG CTA AAA ACT ACC AAATAATGG(SEQ ID NO.2)rC-KO，突變#2 Ser-26至終止信號 1859-CCT CGG CCC TCA ACA TCA TTG(SEQ ID NO.3)BssH IICCA GCG CGCTAAACA TCA TTG(SEQ ID NO.4)rD-KO Ser-304至終止信號 22676-CCT CAT CAT GGA ATC TCA TCA TCG ACA AC(SEQ ID NO.5) Sac ISer 305至終止信號 CGA GCT CAT GGA ATCTAATAATAGACA AC(SEQ ID NO.6)Ser-306至終止信號rV-KO Arg-355至終止信號2830-GGA AAG GAA GGA TAC AGA AGA GAG CAA TCG SEQ ID NO 7BsrB IGln-358至終止信號 GGA GCG GAA GGA TACTGAAGA GAGTAATCG(SEQ ID NO.8)1.顯示了每個突變區域的核苷酸序列，并與野生型(wt)對比。每個序列中第一個核苷酸的定位是根據其在完整反基因組RNA中的位置而定。黑體的序列表示引入的突變，斜體序列表示引入的限制性酶切位點，下劃線序列表示引入的終止密碼子。
2.根據D融合蛋白(PN末端241個氨基酸與DC末端131個氨基酸融合)的序列(圖1B)編號。
3.rD-KO和rV-KO中所述的突變組合產生rDV-KO病毒。
反基因組cDNA與三種PIV3支持質粒(pTM(N)，pTM(P無C)和pTM(L))共同轉染HEp-2細胞，這些細胞同時感染表達T7 RNA聚合酶的MVA。具有C、D和V ORF突變的rPIV3的回收效率與p3/7(131)2G(表達先前從中回收了重組JS wt PIV3(rJS)的全長PIV3反基因組質粒(Durbin等，Virology 235323-332，1997))相似感染-轉染的HEp-2細胞培養物相比。32℃培養3天后收獲感染細胞，每個上清傳代到T25培養瓶中新鮮單層的LLC-MK2細胞上，32℃培養5天(第一次傳代)。32℃培養5天后，rJS、rD-KO、rV-KO和rDV-KO的LLC-MK2細胞單層表現出3-4+細胞病理效果(CPE)。相應的rC-KO第一次傳代顯示(如果有)最少的CPE。由于不清楚rC-KO樣品缺乏CPE是否是因為該突變病毒高水平的生長限制或是簡單地由于病毒的起始回收較低，收獲第一次傳代物，上清傳代到T75培養瓶中新鮮單層的LLC-MK2細胞，32℃培養7天(第二次傳代)。T75培養瓶中單層的LLC-MK2細胞在培養7天后僅表現1-2+CPE，但血細胞吸附證實了HPIV3的存在。通過噬菌斑分離或最終稀釋進行三輪生物克隆后，各重組突變體在LLC-MK2細胞中擴增了2次，得到用于進一步確定特性的病毒懸液。
為了證實回收的病毒的確是期盼的rC-KO，rD-KO，rV-KO，和rDV-KO突變體，采用擴增HPIV3反基因組跨越核苷酸1595-3104的DNA片段(包括包括具有C、D和V ORF的P基因部分)的引物對對各克隆的病毒通過RT-PCR進行分析。各PCR產物的產生都依賴反轉錄酶的加入，表明都來源于RNA而非污染的cDNA。rC-KO、rD-KO、rV-KO和rDV-KO的PCR產物用引入作為標記的限制性內切酶消化(表1)，證實了限制性酶切位點的存在。對RT-PCR產物也進行了核苷酸測序分析，確認了引入突變的存在。從各個克隆重組體中擴增的跨越核苷酸1595-3104的RT-PCR片段確認了所有引入的突變都存在，而在該片段中未發現其它偶發突變。
進行放射性免疫沉淀分析(RIPA)比較rC-KO突變病毒與野生型rJS wt病毒，以確定C ORF確實被沉默了。細胞被感染，并在感染后24-30小時在35S甲硫氨酸存在下培養，制備細胞裂解液。等量的總蛋白與抗C和抗HN抗體孵育，然后抗體結合于蛋白A葡聚糖珠上。rJS wt編碼HN和C蛋白，而rC-KO不表達C蛋白(圖3)。rC-KO和rDV-KO在細胞培養中的復制兩等份的LLC-MK2單層細胞被感染復數為0.01的rC-KO，rDV-KO，或rJS感染，32℃培養7天。每間隔24小時對各培養物的培養基取樣，隨后測定效價以評價各病毒在細胞培養中的復制。rDV-KO的復制與其親本rJS wt在病毒生長速率和最高效價(圖3)以在溫度提高時的復制能力(數據未顯示)等方面基本上沒有區別。相反，rC-KO病毒復制更加緩慢并在第6天達到最高效價，這個值比rJS低100-1000倍。因此，C蛋白表達的缺乏對細胞培養中的病毒復制有重要影響。rC-KO，rD-KO，rV-KO，和rDV-KO在倉鼠中的復制接著我們對比了突變病毒和rJS wt親本在倉鼠上下呼吸道中復制的能力。一個初步研究表明rD-KO和rV-KO與rJS病毒在該分析中無顯著區別(數據未顯示)，因此對其不做進一步評價。第二個研究中，各組倉鼠被分別在鼻內每只倉鼠接種了rC-KO，rDV-KO，rJS或cp45(生物學來源的候選疫苗)105PFU。與rJS相比，檢測的每一天rC-KO在上、下呼吸道中的復制都降低1000倍或更高(表2)，并且和cp45候選疫苗病毒同樣減毒。盡管rDV-KO的復制在倉鼠上呼吸道沒有降低，但在檢測的三天中的任何一天其在下呼吸道降低至少20倍(表2)。感染rC-KO，rDV-KO，cp45或rJS的倉鼠對HPIV3有顯著的抗體反應，并表現PIV3攻擊病毒高水平的復制限制(表3)。rC-KO在上呼吸道賦予的保護是不完全的，但仍然顯著。表2rC-KO在倉鼠上下呼吸道減毒，而rDV-KO病毒在倉鼠下呼吸道減毒感染后所示日的平均病毒效價(log10TCID50/g)±S.E.2最高病毒效價(log10TCID50/g)±S.E.病毒1第3天 第4天 第5天鼻甲 肺 鼻甲 肺 鼻甲肺 鼻甲 肺cp454.7±0.22.7±0.25.0±0.52.8±0.55.4±0.31.6±0.25.4±03(D)32.8±0.5(C)3rC-KO 3.4±0.22.9±0.13.6±0.12.1±0.32.9±0.41.6±0.23.6±0.1(C)2.9±0.2(C)rDV-KO 7.2±0.25.5±0.36.9±0.24.6±0.15.4±0.15.9±0.27.2±0.2(A)5.9±0.2(B)rJS 6.7±03 6.8±0.57.4±0.26.6±0.46.6±0.27.2±0.27.4±0.2(A)72±0.2(A)1. 5只倉鼠的各組鼻內接種105PFU的所示病毒。cp45是生物學來源的病毒，其它是重組病毒。
2.標準誤差。
3.根據鄧肯多差距測驗，不同字母的右欄的平均值顯著不同(a＝0.05)，相同字母的沒有顯著不同。
表3 rC-KO和rDV-KO病毒在倉鼠中有免疫原性和對抗PIV3 wt病毒攻擊的保護性對攻擊的應答免疫病毒1血清HAI抗體效價(倒 平均PIV3效價2數平均值log2±S.E.) (log10TCID50/g)±S.E.
鼻甲 肺rC-KO 7.3±0.43.3±0.5 ＜1.2±0.0rDV-KO 11.3±0.2 ＜1.5±0.0 ＜1.2±0.0cp45 11.8±0.3 ＜1.5±0.0 ＜1.2±0.0rJS 12.1±0.2 ＜1.5±0.0 ＜1.2±0.0RSV ＜2.0±0.0 7.0±0.2 4.7±0.31.顯示在0天用于免疫6只倉鼠組的病毒。
2.在28天，對所有的倉鼠取血以確定血清HAI抗體效價并接受106pFU生物學來源JS wt HPIV3的攻擊。攻擊后4天采集肺部和鼻甲的樣品。rC-KO和rDV-KO在靈長類中的復制將這些突變體各給藥一組4只的AGM，并與cp45和JS wt對比其在上下呼吸道中的復制，以進一步評價rC-KO和rDV-KO的減毒表型和保護效率。rC-KO在AGM上呼吸道中的復制降低100倍或更多，而在此rDV-KO僅降低10倍。觀察到的這兩種病毒在上呼吸道中的減毒與cp45的相當(表4)。盡管rC-KO在AGM下呼吸道中是高度減毒的(超過105倍)，rDV-KO在此僅略有限制(小于10倍)。這兩種病毒都誘導對HPIV3的HAI抗體應答，但AGM中對rC-KO的HAI應答，和在倉鼠中一樣，顯著地低于對其它病毒(表4)的應答。免疫的AGM在28天以IN和IT途徑給藥的106pFU生物學來源JS wt病毒攻擊。曾接受rJS、rDV-KO或cp4候選疫苗病毒的動物在AGM上下呼吸道中對攻擊病毒的復制有完全的保護抗性。rC-KO賦予對攻擊病毒復制的保護作用是顯著的但不完全的。攻擊病毒的最高效價在該組動物上下呼吸道中有顯著的降低，病毒從上下呼吸道中釋放的時間分別從10天縮短到4天和從8天縮短到6天。
表4rC-KO和rDV-KO在非洲綠猴中減毒并誘導血清HAI抗體應答平均最高效價在28天血清 攻擊病毒4的平均最高效價病毒1(log10TCID50/ml)±S.E.2HAI抗體效價(log10TCID50/ML)±S.E.
動物數鼻咽擦拭 氣管灌洗 (倒數平均值鼻咽擦拭 氣管灌洗log2±S.E.)3RC-KO 3.6±0.3(C)51.5±0.1(D)54 9.2±1.1 4.2±0.473.6±1.07Cp455.1±0.4(B) 5.3±0.1(C) 4 12.0±0.6 ＜0.5±0.0＜0.5±0.0RDV-KO5.3±0.2(B) 6.0±0.4(B) 4 12.0±0.6 ＜0.5±0.0＜0.5±0.0JSwt6.3±0.2(A) 6.6±0.1(A) 6613.2±0.2 ＜0.5±0.0＜0.5±0.01.AGM在0天用106PFU的所示病毒在鼻內和氣管內接種。
2.標準誤差。
3.在0天的平均血清HAI抗體效價(倒數平均Log2)≤2.0。
4.動物在第28天用病毒106PFU HPIV3 JS wt經鼻內和氣管內接種攻擊。
5.根據鄧肯多差距測驗，不同字母的每列的平均值顯著不同(α＝0.05)，相同字母的沒有顯著不同。
6.組內2只動物接受重組JS wt病毒rJS，4只接受生物學來源的JS wt病毒。兩個病毒的最高平均效價沒有不同(上呼吸道中6.46.3；下呼吸道中6.66.7)。由于兩個病毒的最高效價沒有不同，合并這些組進行進一步分析。
7.在2和3列中比較JS wt病毒平均最高效價。
總結以上的發明內容，此處的結果顯示從cDNA中成功地回收了感染性HPIV3，以構建其中C、D或V ORF的表達被包含突變的模式消除技術單獨破壞的新型重組病毒，這些突變改變了起始密碼子所決定的氨基酸，和/或引入翻譯終止密碼子。在其它模式的病毒克隆中，D和V ORF被同時干擾。這些例子表明HPIV3的附屬C、D和V ORF對病毒在體內體外復制的重要性，并提供了對預防和治療PIV有用的候選疫苗。特別的，rC-KO在AGM上下呼吸道中復制水平比cp45略低，是最有前途的PIV3候選疫苗株。盡管其在體內復制降低，rC-KO可誘導足夠的免疫應答，限制HPIV3攻擊病毒的復制，盡管為了在人體達到對wt病毒復制的高水平限制，需要以高劑量(如107TCID)或多劑量給藥，仍認為該重組體是有用的候選疫苗。
利用重組DNA技術，在HPIV3突變體cp45中發現的突變可以單獨或組合形式引入JS wt序列(Skiadopoulos等，J.Virol.731374-1381，1999；1998年5月22日的美國專利申請09/083,793；1997年5月23的美國臨時申請60/047,575(相應于國際申請WO 98/53078)；1997年9月19的美國臨時申請60/059,385，分別在此引用作為參考)。這使鑒定賦予候選疫苗減毒、溫度敏感(ts)和/或冷適應表型的突變成為可能。這些突變，以及其它此處公布的重組PIV中的修飾，可用作附加突變，來調節具有C、D和/或V ORF剔除突變的本發明重組PIV的減毒水平、以及免疫原性和其它期望的表型特征。
在P座位中潛在編碼的兩個其它蛋白是V和D蛋白。除了HPIV-1以外，所有的呼吸道病毒、麻疹病毒和Rubulaviruses都具有完整的VORF。V ORF富含半胱氨酸的C末端部分是副粘病毒P基因中最保守的ORF，似乎除HPIV1和HPIV3以外的這類病毒都表達該部分。盡管HPIV3具有V ORF，仍不清楚它是如何獲得的，但它保持完整的事實證明它是有作用的。不像副粘病毒的V順反子，D蛋白在人和牛PIV3中是特有的。D蛋白的接觸是通過兩個非模板G殘基在P mRNA編輯位點的插入，產生一個融合蛋白，其中P N末端的241個氨基酸融合了D ORF C末端的131個氨基酸。對D蛋白的功能一無所知，而且盡管發現了可編碼D的編輯后的mRNA，在HPIV3感染的細胞或毒粒中未發現該蛋白。(Galinski等，Virology 186543-550，1992)。我們獲得一個在D ORF中具有三個連續終止密碼子的重組HPIV3突變體，其可以表達由D ORF編碼的包含61個氨基酸的截短形式的融合蛋白，企圖解決這個問題。具有單個D或V ORF剔除突變的重組子在體內和體外的復制都沒有顯著的限制。但這些突變在PIV候選疫苗的發展中卻非常有用。一個組合的V和D剔除突變體的成功回收說明了這一點，其組合了兩套突變，同時在V和D ORF中創造了多個終止密碼子。這種定名為rDV-KO的突變體在倉鼠的上下呼吸道中復制被限制，在AGM的上下呼吸道中也如此。由于P ORF不受引入突變的影響，可以合理的推測觀察到的表型反映了V和D活性的喪失。盡管rDV-KO在體內復制是減毒的，其在細胞培養中的復制基本沒有變化。這些結果提供了有力的證據，說明野生型HPIV3 D和V蛋白是表達的，并且二者同時的功能喪失對rDV-KO在體內的減毒表型負責。可能這些蛋白在分子水平互相作用，影響體內復制。
盡管為清晰理解目的，上述發明通過實施例進行了詳細描述，但是業內人士而言很清楚，某些變化和修飾可在附加的權利要求書范圍內進行，這些已通過圖表方式說明，但不限于此范圍。
微生物保藏信息以下材料已保藏于美國典型培養物保藏中心(ATCC，10801University Boulevard，Manassas，Virginia 201 10-2209)，遵循布達佩斯條約，并命名如下質粒 保存號 保存日期p3/7(131)(ATCC97990) 1997年4月18日p3/7(131)2G (ATCC97989) 1997年4月18日D218(131)(ATCC97991) 1997年4月18日序列表<110>美國政府健康及人類服務部(The Government of the United Statea of America，as representedby theSecretary of the Department of Health and Human Serviees)<120>通過缺失或消除非必需基因而減毒的重組副流感病毒疫苗(Recombinant Parainfluenzavirus Vaccines Attenuated by Deletion or Ablation of a Non-essential Gene)<130>15280-394000PC<140><141><150>09/350,821<151>1999-07-09<160>11<170>Patent In Ver.2.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述含有rD-KO突變的重組序列<400>1atgctaaaaa ctatcaaatc atgg<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述含有rD-KO突變的重組序列<400>2acgctaaaaa ctaccaaata atgg<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述含有rD-KO突變的重組序列<400>3cctcggccct caacatcatt g<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述含有rD-KO突變的重組序列<400>4ccagcgcgct aaacatcatt g<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述含有rD-KO突變的重組序列<400>5cctcatcatg gaatctcatc atcgacaac<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述含有rD-KO突變的重組序列<400>6cgagctcatg gaatctaata atagacaac<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述臨近位點rV-KO突變的野生型序列<400>7ggaaaggaag gatacagaag agagcaatcg<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述含有rV-KO突變的重組序列<400>8ggagcggaag gatactgaag agagtaatcg<210>9<211>11<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述含有RNA編輯位點基元的序列<400>9aaaaaagggg g<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述含有P和C讀碼框的翻譯起始位點的序列<400>10gttgatggaa agcgatgcta<210>11<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述在編輯位點具有2個G插入的P mRNA的部分序列<400>11aaaaaagggg ggg
權利要求
1.一種分離的感染性重組副流感病毒(PIV)，包含一個PIV基因組或反基因組、一個核殼蛋白(N)、一個磷蛋白(P)和一個大聚合酶蛋白(L)，其中在所述基因組和反基因組中引入了一種改變，這種改變包含一個或多個C、D或V ORF的部分或完全缺失，或使一個或多個C、D或V ORF的表達降低或消除的一個或多個核苷酸變化。
2.權利要求1的重組PIV，其中所述一個或多個C、D或V ORF的表達因引入的一個或多個終止密碼子而降低或消除。
3.權利要求1的重組PIV，其中所述一個或多個C、D或V ORF的表達因RNA編輯位點的突變或改變起始密碼子特定氨基酸的突變而降低或消除。
4.權利要求1的重組PIV，其中所述一個或多個C、D或V ORF的表達因引入的移碼突變而降低或消除。
5.權利要求1的重組PIV，其中所述一個或多個C、D或V ORF被整體或部分地缺失。
6.權利要求1的重組PIV，其中在基因組或反基因組中引入的改變包括C ORF部分或全部的缺失或使C ORF表達降低或消除的一個或多個核苷酸改變。
7.權利要求6的重組PIV，其中C ORF的表達因引入的一個或多個終止密碼子而降低或消除。
8.權利要求7的重組PIV，其中因所述基因組或反基因組在第1795處的一個核苷酸變化，C ORF起始密碼子被改為蘇氨酸密碼子，并且通過改變在1813和1869處的核苷酸而引入了兩個終止密碼子。
9.權利要求6的重組PIV，其是rC-KO。
10.權利要求1的重組PIV，其中在基因組或反基因組中引入的改變包括D ORF部分或全部的缺失或使D ORF表達降低或消除的一個或多個核苷酸改變。
11.權利要求9的重組PIV，其中D ORF的表達因引入的一個或多個終止密碼子而降低或消除。
12.權利要求10的重組PIV，其中通過改變在所述反基因組的第2692、2695、2698處的核苷酸而引入了三個終止密碼子。
13.權利要求9的重組PIV，其是rD-KO。
14.權利要求1的重組PIV，其中在基因組或反基因組中引入的改變包括V ORF部分或全部的缺失或使V ORF表達降低或消除的一個或多個核苷酸改變。
15.權利要求12的重組PIV，其中V ORF的表達因引入的一個或多個終止密碼子而降低或消除。
16.權利要求13的重組PIV，其中通過改變在所述反基因組第2845和2854處的核苷酸而引入了兩個終止密碼子。
17.權利要求13的重組PIV，其是rV-KO。
18.權利要求1的重組PIV，其中在基因組或反基因組中引入的改變包括所述C、D和V ORF中至少兩個的部分或全部的缺失，或使所述C、D和V ORF中的至少兩個的表達降低或消除的一個或多個核苷酸改變。
19.權利要求18的重組PIV，其中D和V ORF都被部分或全部地缺失，或發生了使二者表達降低或消除的一個或多個核苷酸改變的修飾。
20.權利要求18的重組PIV，其是rDV-KO。
21.權利要求1的重組PIV，其中在基因組或反基因組中的改變導致了重組PIV中一個或多個所需的表型變化，其選自(i)在細胞培養中減毒，(ii)在哺乳動物宿主上和/或下呼吸道中減毒，(iii)病毒噬菌斑大小的改變，(iv)細胞病理學效果改變，以及(v)免疫原性改變。
22.權利要求21的重組PIV，其中病毒在細胞培養中的生長比相應野生型或突變親本PIV株的生長降低約5-10倍或更多。
23.權利要求21的重組PIV，其中病毒在上、下呼吸道中的生長比相應野生型或突變親本PIV株的生長降低約10-100倍或更多。
24.權利要求23的重組PIV，其中病毒在上、下呼吸道中的生長比相應野生型或突變親本PIV株的生長降低約100-1000倍或更多。
25.權利要求1的重組PIV，其中所述基因組或反基因組被引入的在生物學來源的突變人PIV中發現的一個或多個減毒突變所進一步改變。
26.權利要求25的重組PIV，其中所述基因組或反基因組包含PIV3 JS cp45中的至少一個到全部減毒突變。
27.權利要求25的重組PIV，其中所述基因組或反基因組包含至少一個到全部的導致PIV3 L基因中的Tyr 942、Leu 992和/或Thr1558；N中的Val 96和Ser 389；C中的Ile 96；F中的Ile 420和/或Ala550；HN中的Val 384處的氨基酸替代的減毒突變，和/或在3’前導區第23、24、28和/或45位和/或N基因起始序列62處的核苷酸替代。
28.權利要求25的重組PIV，其中所述基因組或反基因組包含至少兩個減毒突變。
29.權利要求25的重組PIV，其中所述基因組或反基因組包含至少一個減毒突變，該減毒突變由特定于該突變的密碼子內多個核苷酸的改變而穩定。
30.權利要求1的重組PIV，其中所述基因組或反基因組包含額外的導致以下表型變化的核苷酸改變，選自生長特性、減毒、溫度敏感、冷適應、噬菌斑大小、宿主范圍限制或免疫原性的改變。
31.一種刺激個體免疫系統以誘導抵抗PIV的方法，包括以足夠的免疫量給所述個體給藥權利要求1的重組PIV并組合生理上可接受的載體。
32.權利要求31的方法，其中所述重組PIV以每劑103-107PFU給藥。
33.權利要求31的方法，其中所述重組PIV給藥于上呼吸道。
34.權利要求31的方法，其中所述重組PIV通過噴霧、滴加或氣溶膠給藥。
35.權利要求31的方法，其中所述重組PIV與第二種減毒PIV以混合物同時給藥。
36.一種誘導抗PIV的免疫反應的免疫組合物，包含足夠免疫量的與一種生理上可接受的載體結合的權利要求1的重組PIV。
37.權利要求36的免疫組合物，以每劑103-107PFU配制。
38.權利要求36的免疫組合物，被配制成以噴霧、滴加或氣溶膠給藥于上呼吸道的制劑形式。
39.權利要求36的免疫組合物，其中所述重組PIV誘導抗HPIV1，HPIV2和HPIV3中一種或多種病毒的免疫應答。
40.權利要求39的免疫組合物，其中所述重組PIV誘導抗HPIV3和其它選自HPIV1、HPIV2和HPIV3病毒的免疫應答。
41.一種分離的多核苷酸分子，包含一種重組PIV基因組或反基因組，其具有包括一個或多個C、D或V ORF的部分或完全缺失的核苷酸改變或使所述C、D或V ORF中一個或多個表達降低或消除的一個或多個核苷酸變化。
42.權利要求41的分離的多核苷酸分子，其中所述一個或多個C、D或V ORF的表達因引入的一個或多個終止密碼子或因RNA編輯位點的突變或改變起始密碼子特定氨基酸的突變而降低或消除。
43.權利要求41的分離的多核苷酸分子，其中所述一個或多個C、D或V ORF被整體或部分缺失。
44.權利要求41的分離的多核苷酸分子，其中引入所述基因組或反基因組的改變包括部分或完全缺失C ORF，或使C ORF表達降低或消除的一個或多個核苷酸變化。
45.權利要求41的分離的多核苷酸分子，其中引入所述基因組或反基因組的改變包括部分或完全缺失D ORF，或使D ORF表達降低或消除的一個或多個核苷酸變化。
46.權利要求41的分離的多核苷酸分子，其中引入所述基因組或反基因組的改變包括部分或完全缺失V ORF，或使D ORF表達降低或消除的一個或多個核苷酸變化。
47.權利要求41的分離的多核苷酸分子，其中引入所述基因組或反基因組的改變包括所述C、D或V ORF中的至少兩個的部分或完全缺失，或使所述C、D或V ORF中至少兩個的表達降低或消除的一個或多個核苷酸變化。
48.權利要求41的分離的多核苷酸分子，其中D和V ORF都被部分或完全缺失，或這二者的表達被一個或多個核苷酸的改變所降低或消除。
49.權利要求41的分離的多核苷酸分子，其中所述重組基因組或反基因組被一個或多個減毒突變進一步修飾。
50.權利要求41的分離的多核苷酸分子，進一步含有導致以下表型變化的核苷酸改變，其選自生長特性、減毒、溫度敏感、冷適應、噬菌斑大小、宿主范圍限制或免疫原性的改變。
51.一種從一個或多個編碼所述PIV的多核苷酸分子中產生感染性減毒重組PIV顆粒的方法，包括在細胞或無細胞裂解液中表達表達載體，該載體包含具有重組PIV基因組或反基因組的分離的多核苷酸和PIV N、P和L蛋白，所述重組PIV基因組或反基因組具有的核苷酸改變包括一個或多個C、D或V ORF的部分或完全缺失，或使所述C、D或V ORF中一個或多個的表達降低或消除的一個或多個核苷酸改變。
52.權利要求51的方法，其中所述嵌合PIV基因組或反基因組和N、P和L蛋自由兩個或多個不同表達載體所表達。
53.一種表達載體，包含可操作地連接的轉錄啟動子、一個編碼PIV基因組或反基因組的多核苷酸序列和轉錄終止子，所述多核苷酸序列具有的核苷酸改變包括一個或多個C、D或V ORF的部分或完全缺失，或使所述C、D或V ORF中一個或多個的表達降低或消除的一個或多個核苷酸改變。
全文摘要
提供了重組副流感病毒(PIV),其C、D和/或V的翻譯讀碼框(ORF)的表達降低或去除所產生的新的PIV候選疫苗。通過改變一個重組PIV基因組或反基因組而降低或消除C、D和/或V ORF的表達,例如通過引入一個終止密碼子,RNA編輯位點的突變,改變由起始密碼子定義的氨基酸的突變,或在靶ORF中的移碼突變。或者,C、D和/或V ORF整體或部分缺失,使其編碼的蛋白部分或完全地無功能,或同時完全破壞蛋白表達。C、D和/或V ORF缺失或剔除突變體具有在疫苗發展中非常好的表型特征。這些缺失或剔除突變在產生的病毒或亞病毒顆粒中特定地導致產生一種或多種所需的表型。產生的候選疫苗在病毒生長特性、減毒、噬菌斑大小、和/或細胞病理學變化,以及其它新的表型上有所改變。還提供了存在于本發明C、D和/或V ORF缺失或去除突變PIV中的各種突變和核苷酸修飾,以獲得良好的表型和結構效果。
文檔編號A61K39/00GK1370237SQ00810118
公開日2002年9月18日 申請日期2000年7月6日 優先權日1999年7月9日
發明者安娜·P·德賓, 彼得·L·柯林斯, 布賴恩·墨菲 申請人:美國政府健康及人類服務部