一種鐵線蓮栽培品種多變海神的組織培養方法
【專利摘要】本發明是一種鐵線蓮栽培品種“多變海神”的組織培養方法，包括如下步驟：1）外植體消毒處理；2）芽誘導和芽增殖，包括：①取鐵線蓮“多變海神”當年生的幼嫩莖節和頂芽；②依次用自來水沖洗1h，無菌水沖洗4次；③用滅菌濾紙吸干外植體表面水分，切除葉柄和兩端受傷部位。優點：應用組織培養方法，能較好地保持母本的觀賞價值，有效地提高鐵線蓮“多變海神”的繁殖系數；與扦插繁殖相比，生長周期大幅縮短，組織培養法的繁殖系數為扦插繁殖的50~60倍；品種優質、產量可觀和便于實地推廣。
【專利說明】一種鐵線蓮栽培品種多變海神的組織培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及的是一種鐵線蓮栽培品種“多變海神”的組織培養方法(“多變海神”英文商品名為:Clematis ‘Proteus’),屬于植物組織培養【技術領域】。
【背景技術】
[0002]鐵線蓮屬(Clematis L.)隸屬于毛茛科(Ranunculaceae)毛茛亞科(Subfam.Ranunculoideae)銀蓮花族(Trib.Anemoneae)鐵線蓮亞族(Subtrib.Clematidinae),常為多年生木質藤本。世界約有355種，我國有147種，其中93種為我國特有種，特有率為63.3%。
[0003]其萼片花瓣狀，色彩豐富，形態多變，莖蔓生，利用葉柄攀援，生長適應性強，園藝用途廣泛，觀賞價值高，在垂直綠化中具有重要地位，享有“攀援植物皇后”之美稱。在日本和西方園林中，鐵線蓮已占有十分重要的地位，大部分植物園、公園和家庭花園都能見到它們絢麗多彩的身影。此外，該屬植物中的許多種如女萎{Clematis)、威靈仙(Cchinensis)等作為藥用植物使用已久。
[0004]其種子較難發芽，多用扦插繁殖。采取組織培養法進行鐵線蓮“多變海神”(英文商品名為:Clematis ‘Proteus’)的快速繁殖,建立叢生芽生根的無性繁殖體系，有利于增大繁殖系數，對于鐵線蓮“多變海神”走向園藝應用具有較強的生產應用價值。
【發明內容】
[0005]本發明提出的是一種鐵線蓮栽培品種“多變海神”的組織培養方法，其目的是克服鐵線蓮“多變海神”現有繁殖技 術所存在的缺陷，提高其繁殖系數以適應其引種推廣及園林應用的需求。
[0006]本發明的技術解決方案:一種鐵線蓮栽培品種“多變海神”的組織培養方法，包括如下步驟:
1)外植體消毒處理；
2)芽誘導和芽增殖。
[0007]所述的步驟I)外植體消毒處理，具體包括:
①取鐵線蓮“多變海神”當年生的幼嫩莖節和頂芽；
②依次用自來水沖洗Ih，毛筆來回刷洗20次，于超凈工作臺上用質量濃度為75%乙醇滅菌20 s,無菌水沖洗2次,之后用質量濃度為0.1%氯化萊滅菌7 min,立即用無菌水沖洗4次；
③用滅菌濾紙吸干外植體表面水分，切除葉柄和兩端受傷部位；實驗統計的污染率分別為54%、36%，褐化率為44%、35%。
[0008]所述的步驟2)芽誘導和芽增殖，具體包括:
①誘導培養
沖洗后將外植體置于培養皿中，用剪刀、鑷子切除葉柄、兩端受傷部位后，將芽接種于已滅菌的誘導培養基1/2 MS+生長調節物質NAA 0.5mg/L+生長調節物質TDZ 1.0 mg/L +質量濃度為3%的蔗糖2(T30 g/L +質量濃度為0.7%的瓊脂7g/L，pH值為5.8，培養4周，培養溫度25°C，光照16 h/d，照度2400 Ix ；
②不定芽增殖培養
將誘導的叢生芽分成單芽，繼而將單芽接入1/2 MS +生長調節物質6-BA 1.0 mg/L +生長調節物質KT 0.5mg/L +生長調節物質NAA 0.5 mg/L +質量濃度為3%的蔗糖20~30g/L +質量濃度為0.7%的瓊脂7g/L，的培養基，pH值為5.8，培養4周，溫度、光照條件同①叢生芽誘導；
③壯苗培養
將增殖培養基中葉色濃綠、長度為廣2 cm的不定芽逐個切下，接入MS基本培養基中培養4星期，光照條件同①叢生芽誘導；
④生根培養
將壯苗培養后長勢旺盛的芽接入生根培養基1/2 MS+生長調節物質IBA 0.3 mg/L中，培養40天。溫度、光照條件同①叢生芽誘導；
⑤煉苗和移栽
將生根的鐵線蓮“多變海神”植株的培養瓶瓶蓋打開，室溫下煉苗6 d后`，取出試管苗，洗凈，移栽到準備好的珍珠巖、蛭石、泥炭珍珠巖，其重量比為珍珠巖:蛭石:泥炭=1:1:1的營養缽中，保持濕度85%~95%，溫度、光照條件同②叢生芽誘導，成活率達95%。
[0009]本發明的優點:應用組織培`養方法，能較好地保持母本的觀賞價值，有效地提高鐵線蓮“多變海神”的繁殖系數。與`扦插繁殖相比，生長周期大幅縮短，組織培養法的繁殖系數為扦插繁殖的50-60倍。品種優質、產量可觀和便于實地推廣。
【具體實施方式】實施例
[0010]一種鐵線蓮栽培品種“多變海神”的組織培養方法，其培養步驟如下:
步驟一、外植體消毒處理
選取當年生幼嫩莖節和頂芽，依次沖洗1.5 h，于超凈工作臺上用質量濃度為75%乙醇滅菌20 S，用無菌水沖洗2次，之后用質量濃度為0.1%升汞滅菌7 min，立即用無菌水沖洗
3-4 次。
[0011]步驟二、芽誘導和芽增殖
①誘導培養
沖洗后將外植體置于培養皿中，用剪刀、鑷子切除葉柄、兩端受傷部位后，將芽接種于已滅菌的誘導培養基1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+TDZ 1.0 mg/L上5周，質量濃度為3%的蔗糖2(T30 g/L +質量濃度為0.7%的瓊脂7g/L，的培養基，pH 5.7，培養溫度25°C ;光照條件:光照/黑暗，其中光照16 h/d，光照度為2400 Ix0
[0012]②不定芽增殖培養
將誘導培養基中誘導出的叢生芽分成單芽，接入1/2 MS+生長調節物質6-BA 1.0 mg/L+生長調節物質KT 0.5 mg/L+生長調節物質NAA 0.5 mg/L增殖培養基中培養4周光照條件同①誘導培養。
[0013]③壯苗培養
將增殖培養基中葉色濃綠、長度為2 cm左右的不定芽逐個切下，接入MS基本培養基中培養25天，光照條件同①誘導培養。
[0014]④生根培養
將壯苗培養后長勢旺盛的芽切去莖基部褐色物質后接入生根培養基1/2 MS+生長調節物質IBA 0.3 mg/L,培養6周后生根,光照條件同①誘導培養。
[0015]⑤煉苗和移栽
將生根植株的培養瓶瓶蓋打開，室溫下煉苗6 d后，取出試管苗，洗凈，移栽到準備好的珍珠巖:蛭石:泥炭(1:1:1)苗床上，保持溫度2(T25°C，濕度85%~95%，適當遮蔭，成活率達 90%。
[0016]所述的MS基本培養基是由大量元素、微量元素、鐵鹽和有機成分所組成。
[0017]所述的大量元素為:硝酸鉀KNO3,1900 mg.?Λ硝酸銨NH4NO3,1650 mg--1,磷酸二氫鉀 KH2PO4,170 mg.-1，硫酸鎂 MgSO4.7 H2O, 370 mg.-1，氯化鈣 CaCl2.4 H20,440mg.L 1 ο
[0018]所述的微量元素為:碘化鉀KI, 0.83 mg.L-1,硼酸 H3BO3 , 6.2 mg七1,或硫酸猛MnS04.4 H2O, 22.3 mg.-1 或硫酸鋅 ZnSO4.7 H20,8.6 mg.-1 或鑰酸鈉 Na2MoO4.2 H2O,
0.25 mg.L' 硫酸銅 CuSO4.5 H2O, 0.025 mg.L' 氯化鈷 CoCl2.6 H2O, 0.025 mg.L'
[0019]所述的鐵鹽為:乙二胺二乙酸二鈉Na2.EDTA，37.3 mg.L—1，硫酸亞鐵FeSO4.7H2O, 27.8 mg.L 1O
[0020]所述的有機成分為:肌醇C6H12O6.2H20,100 mg.L-1，甘氨酸 NH2CH2COOH, 2mg.L—1，鹽酸硫胺素 C12H17C1qS.2Η(:1，0.1 mg.L—1，鹽酸吡哆醇 C8H11O3N.HCl ,0.5 mg.L—1，煙酸 NC5H4COOH, 0.5 mg.L'
[0021]所述的1/2 MS基本培養基的成分為:大量元素是MS基本培養基的一半，其余成分微量兀素、鐵鹽，有機成分與MS基本培養基有機成分相同。
[0022]所述的生長調節物質6-BA為6-芐基腺嘌呤；NAA為萘乙酸；KT為激動素；ΙΒΑ為吲哚丁酸，TDZ為噻二唑苯基脲。
【權利要求】
1.一種鐵線蓮栽培品種“多變海神”的組織培養方法，其特征是該方法包括如下步驟: 1)外植體消毒處理； 2)芽誘導和芽增殖。
2.根據權利要求1所述的一種鐵線蓮栽培品種“多變海神”的組織培養方法，其特征是所述的步驟I)外植體消毒處理，具體包括: ①取鐵線蓮“多變海神”當年生的幼嫩莖節和頂芽； ②依次用自來水沖洗Ih，毛筆來回刷洗20次，于超凈工作臺上用質量濃度為75%乙醇滅菌20 s,無菌水沖洗2次,之后用質量濃度為0.1%氯化萊滅菌7 min,立即用無菌水沖洗4次； ③用滅菌濾紙吸干外植體表面水分，切除葉柄和兩端受傷部位；實驗統計的污染率分別為54%、36%，褐化率為44%、35%。
3.根據權利要求1所述的鐵線蓮栽培品種“多變海神”的組織培養方法，其特征是所述的步驟2)芽誘導和芽增殖，具體包括: ①誘導培養 沖洗后將外植體置于培養皿中，用剪刀、鑷子切除葉柄、兩端受傷部位后，將芽接種于已滅菌的誘導培養基1/2 MS+生長調節物質NAA 0.5mg/L+生長調節物質TDZ 1.0 mg/L +質量濃度為3%的蔗糖2(T30 g/L +質量濃度為0.7%的瓊脂7 g/L，pH值為5.8，培養4周，培養溫度25°C，光照16 h/d，照度2400 Ix ； ②不定芽增殖培養 將誘導的叢生芽分成單芽，繼而將單芽接入1/2 MS +生長調節物質6-BA 1.0 mg/L +生長調節物質KT 0.5mg/L +生長調節物質NAA 0.5 mg/L +質量濃度為3%的蔗糖20~30g/L +質量濃度為0.7%的瓊脂7 g/L的培養基，pH值為5.8，培養4周，溫度、光照條件同①叢生芽誘導； ③壯苗培養 將增殖培養基中葉色濃綠、長度為廣2 cm的不定芽逐個切下，接入MS基本培養基中培養4星期，光照條件同①叢生芽誘導； ④生根培養 將壯苗培養后長勢旺盛的芽接入生根培養基1/2 MS+生長調節物質IBA 0.3 mg/L中，培養40天；溫度、光照條件同①叢生芽誘導； ⑤煉苗和移栽 將生根的鐵線蓮“多變海神”植株的培養瓶瓶蓋打開，室溫下煉苗6 d后，取出試管苗，洗凈，移栽到準備好的由珍珠巖、蛭石、泥炭組成的營養缽中，珍珠巖、蛭石和泥炭間的重量比為1:1:1，保持濕度85%~95%，溫度、光照條件同(2)叢生芽誘導，成活率達95%。
4.根據權利要求3所述的一種鐵線蓮栽培品種“多變海神”的組織培養方法，其特征是所述的MS基本培養基是由大量元素、微量元素、鐵鹽和有機成分所組成。
5.根據權利要求4所述的一種鐵線蓮栽培品種“多變海神”的組織培養方法，其特征是所述的大量元素為:硝酸鉀KNO3,1900 mg.L_\硝酸銨NH4NO3,1650 mg.L—1，磷酸二氫鉀KH2PO4,170 mg.I71，硫酸鎂 MgSO4.7 H2O, 370 mg.I71，氯化鈣 CaCl2.4 H20,440 mg.L-1 ； 所述的微量元素為:碘化鉀ΚΙ，0.83 mg.L-1,硼酸H3BO3，6.2 mg.L—1，或硫酸錳MnS04.4 H2O, 22.3 mg.L- 或硫酸鋅 ZnSO4.7 H20,8.6 mg.L-1 或鑰酸鈉 Na2MoO4.2 H2O,0.25 mg.L-1 硫酸銅 CuSO4.5 H2O, 0.025 mg.L-1 氯化鈷 CoCl2.6 H2O, 0.025 mg.L-1 ； 所述的鐵鹽為:乙二胺二乙酸二鈉Na2.EDTA, 37.3 mg.L—1，硫酸亞鐵FeSO4.7 H2O,27.8 mg.L -1 ; 所述的有機成分為:肌醇 C6H12O6.2H20,100 mg.L-1，甘氨酸 NH2CH2COOH, 2 mg.L-1，鹽酸硫胺素 C12H17C10S.2HC1，0.1 mg.L-1，鹽酸吡哆醇 C8H11O3N.HCl，0.5 mg.L-1，煙酸NC5H4COOH, 0.5 mg.L-1
6.根據權利要求3所述的一種鐵線蓮栽培品種“多變海神”的組織培養方法，其特征是所述的1/2 MS基本培養基的成分為:大量元素是MS基本培養基的一半，其余成分微量元素、鐵鹽，有機成分與MS基本培養基有機成分相同。
7.根據權利要求3所述的一種鐵線蓮栽培品種“多變海神”的組織培養方法，其特征是所述的生長調節物質6-BA為6-芐基腺嘌呤；NAA為萘乙酸；KT為激動素；ΙΒΑ為吲哚丁酸，TDZ為噻二唑苯基脲。
【文檔編號】A01H4/00GK103461130SQ201310428129
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月22日 優先權日:2013年9月22日
【發明者】王磊, 程瑩, 方炎明 申請人:江蘇農林職業技術學院