高效誘導烏拉爾甘草毛狀根產生及用其生產甘草次生代謝產物的方法
【專利摘要】本發明涉及一種采用發根農桿菌侵染烏拉爾甘草幼苗莖節誘導產生毛狀根的方法，并用此毛狀根生產藥用次生代謝產物，例如甘草苷和甘草酸等，尤其是高效誘導烏拉爾甘草毛狀根產生的方法及用毛狀根生產甘草次生代謝產物的方法。其特征在于，包括如下步驟：（1）無菌外植體的獲得：取烏拉爾甘草種子，滅菌后接種于幼苗培養基進行培養，獲得株齡12～15d的無菌幼苗，切除根部后作為外植體；（2）發根農桿菌工程菌液的制備；（3）針刺幼苗莖節誘導毛狀根產生。本發明提供了一種高效、穩定誘導烏拉爾甘草毛狀根產生的方法，并對獲得的甘草毛狀根選用適當的液體培養基進行懸浮培養并應用于生產藥用次生代謝產物（甘草苷和甘草酸等）。
【專利說明】高效誘導烏拉爾甘草毛狀根產生及用其生產甘草次生代謝產物的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種采用發根農桿菌侵染烏拉爾甘草幼苗莖節誘導產生毛狀根的方法，并用此毛狀根生產藥用次生代謝產物，例如甘草苷和甘草酸等，尤其是高效誘導烏拉爾甘草毛狀根產生的方法及用毛狀根生產甘草次生代謝產物的方法。
【背景技術】
[0002]烏拉爾甘草(Glycyrrihiza uralensisi Fisch.)是我國重要的傳統中藥,具有清熱解毒、潤肺祛痰、緩急止痛、補氣益脾胃等功效，被譽為“百草之王”，其藥用價值是其它資源不能替代的。甘草的主要藥效成分包括甘草酸和甘草苷，其中甘草酸是非常珍貴的解毒齊?，可防治病毒性肝炎、高血脂和癌癥等疾病；甘草黃酮具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗衰老和保肝等藥理作用，此外，甘草不僅是重要的藥材，還廣泛應用于日用化工品及食品領域，其中甘草酸還是一種天然甜味劑，甘草苷是一類天然抗菌劑和防腐劑。隨著甘草資源的不斷開發與利用，國內市場甘草的需求總量為9.0萬~10.0萬噸，但全國甘草總量只有2.5萬~3.0萬噸，資源短缺已趨白熱化，嚴重影響了醫藥企業的生產。2001年9月，我國為了保護日益匱乏的甘草資源，限制了對野生甘草的采挖，使甘草資源缺乏加劇，目前人工栽培仍是甘草生產的主要途徑，然而，人工栽培周期長，并且受地域限制，特別是在有效成分含量上，人工種植甘草與野生甘草還存在很大的差距，還不能滿足市場需求。人工栽培的甘草中的甘草酸含量基本在2%以下，較野生甘草的平均值低30~40%，達不到我國藥典2%的最低要求，甘草資源匱乏及其質量下降成為限制甘草資源深度開發利用的瓶頸。 [0003]隨著生物工程技術的不斷提高,利用發根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)誘導藥用植物產生毛狀根，并對毛狀根進行離體培養，迅速大量提取有效成分，是藥用植物資源可持續發展的有效途徑之一。
[0004]毛狀根培養技術是20世紀80年代后期在植物細胞領域發展起來的一項新技術，與一般的植物細胞培養相比，毛狀根可以生長在不含激素的培養基上。這一培養系統對傳統藥材來說很重要，因為約1/3的傳統中藥材是植物的根部，曾經被認為難以通過細胞培養來生產的許多源于植物根部的藥物，現在正被設法通過培養毛狀根來生產，發根農桿菌Ri質粒轉化的毛狀根生長快，易于培養，活性成分含量高，具有表達完整的代謝通路，為藥用植物次生代謝產物的工業化生產提供了廣闊前景；目前，關于烏拉爾甘草毛狀根培養的研究并不多，大部分報道的毛狀根誘導方法都是采用離體子葉節、子葉、下胚軸進行毛狀根誘導。但目前所公開的烏拉爾甘草毛狀根誘導培養都采用離體組織進行遺傳轉化，因此誘導率相對較低，并且獲得的毛狀根大量攜帶農桿菌，除菌比較困難，不利于繼續進行毛狀根懸浮培養，實際應用價值不大，無法滿足生產需求。
【發明內容】
[0005]本發明的目的之一是提供一種高效誘導烏拉爾甘草毛狀根產生的方法，能夠高效、穩定誘導烏拉爾甘草毛狀根的產生；
[0006]本發明的目的之二是提供一種用上述烏拉爾甘草毛狀根生產甘草次生代謝產物的方法，能夠得到生產甘草苷、甘草酸的原料，生產出甘草苷、甘草酸。
[0007]—種高效誘導烏拉爾甘草毛狀根產生的方法，其特別之處在于，包括如下步驟:
[0008](I)無菌外植體的獲得:
[0009]取烏拉爾甘草種子，滅菌后接種于幼苗培養基進行培養，獲得株齡12~15d的無菌幼苗，切除根部后作為外植體；
[0010](2)發根農桿菌工程菌液的制備:[0011]取含有Ri質粒的發根農桿菌，經活化培養，挑取單菌斑接種于YMB液體培養基培養至菌液OD6tltl值為0.6~0.8，離心后棄上清液，加入等體積Ms液體培養基稀釋至菌液OD6tltl值為0.6~0.8，添加乙酰丁香酮至終濃度為100~150 μ M，制成工程菌液待用；
[0012](3)針刺幼苗莖節誘導毛狀根產生:
[0013]按照步驟(1)中獲得的外植體，經步驟(2)中獲得的工程菌液進行農桿菌介導轉化，再將介導轉化過的外植體接種于共培養基中，培養24h~48h，然后將外植體接入抑菌培養基中，除菌培養10~15d，直至在外植體上子葉莖節處長出毛狀根。
[0014]步驟(3)中針刺幼苗莖節誘導毛狀根產生的具體步驟為:用注射器針頭蘸取制備好的發根農桿菌工程菌液，在處理好的外植體即無菌甘草幼苗的子葉節處穿刺1-2次，將穿刺過的外植體置無菌濾紙上吸去多余的菌液，然后移栽到不含激素和抗生素的Ms培養基中，置25土 1°C下共培養2~3天，然后轉移到含頭孢霉素300~500mg/L的Ms培養基中，培養10-15天即可在子葉節處出現白色凸起，3~5天后在凸起處長出簇狀絨毛根系。
[0015]步驟(1)中幼苗培養基采用Ms培養基；或者采用MS培養基，并且調整其中蔗糖至30g/L，瓊脂粉至5.5g/L，無激素；步驟(2)中的Ms液體培養基是在MS培養基的基礎上去掉了瓊脂。
[0016]步驟(2)中發根農桿菌為含有Ri質粒的發根農桿菌ATCC15834。
[0017]步驟(2 )中YMB液體培養基的成分為酵母抽提物1.0g/L, MgSO4.7H200.2g/L, K2HPO40.5g/L, NaCl0.1 g/L,甘露醇 10.0g/L。
[0018]步驟(3)中共培養基采用Ms培養基；或者采用MS培養基，并且調整其中瓊脂粉至
5.5g/L，蔗糖至30.0g/L,乙酰丁香酮至50~100 μ M ;步驟(3)中抑菌培養基采用l/2Ms培養基，即在MS培養基的基礎上其中的大量兀素和微量兀素添加量為Ms培養基的一半,鐵鹽和有機成分含量同Ms培養基，并且添加頭孢霉素300mg/L~500mg/L。
[0019]其中置25±1°C共培養2~3天的同時應處于弱散射光條件下。
[0020]一種利用烏拉爾甘草毛狀根生產甘草次生代謝產物的方法，其特別之處在于，包括如下步驟:剪取權利要求1或2中所述方法得到的毛狀根，長度約1.5~2.0cm，接種到含有頭孢霉素100~300mg/L的l/2Ms培養基進行除菌培養，每5~7天轉入新的l/2Ms培養基，直至除菌完畢，將得到的無菌毛狀根根尖剪成1.0-1.5cm的段，接種于無激素的l/2Ms液體培養基中，置25 ± I °C，轉速110~120rpm，暗培養條件下的恒溫振蕩器上振蕩培養15~20天，收集毛狀根，冷凍干燥后粉碎成100~200目粉末即可。
[0021]從得到的甘草毛狀根粉末中提取出甘草酸、甘草苷。
[0022]其中含有頭孢霉素100~300mg/L的l/2Ms培養基，即在MS培養基的基礎上其中的大量兀素和微量兀素添加量為Ms培養基的一半,鐵鹽和有機成分含量同Ms培養基,并且添加頭孢霉素100~300mg/L ;其中無激素的l/2Ms液體培養基，即在MS培養基的基礎上其中的大量兀素和微量兀素添加量為Ms培養基的一半,鐵鹽和有機成分含量同Ms培養基，并且去掉了瓊脂也無激素。
[0023]針對目前存在的烏拉爾甘草野生藥用資源的嚴重短缺，而人工栽培甘草品質難以達到藥用標準的困境，本發明提供了一種高效、穩定誘導烏拉爾甘草毛狀根產生的方法，并對獲得的甘草毛狀根選用適當的液體培養基進行懸浮培養并應用于生產藥用次生代謝產物(甘草苷和甘草酸等)。本發明首次以烏拉爾甘草活體幼苗為受體材料，采用“針刺幼苗莖節法”，即用蘸有發根農桿菌工程菌液的針尖穿刺侵染烏拉爾甘草幼苗莖節處，快速誘導烏拉爾甘草毛狀根產生，既縮短了甘草毛狀根產生時間，誘導培養7天就出現毛狀根，又提高了轉化率，達98%以上，同時減少了毛狀根除菌次數(經2次除菌培養即可)，并且，毛狀根中活性成分甘草苷含量高較高，含量達干重的，接近于3年生甘草有效成分含量，為利用甘草毛狀根來生產次生代謝產物奠定了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】 [0024]圖1為“針刺幼苗莖節法”誘導烏拉爾甘草毛狀根的產生及液體懸浮培養生產毛狀根，此時在Ms共培養基中用ATCC15834發根農桿菌工程菌液侵染幼苗的莖節位點；
[0025]圖2為“針刺幼苗莖節法”誘導烏拉爾甘草毛狀根的產生及液體懸浮培養生產毛狀根，此時受侵染的節間位點長出白色突起；
[0026]圖3為“針刺幼苗莖節法”誘導烏拉爾甘草毛狀根的產生及液體懸浮培養生產毛狀根，此時白色突起位點形成絨毛狀；
[0027]圖4為“針刺幼苗莖節法”誘導烏拉爾甘草毛狀根的產生及液體懸浮培養生產毛狀根，此時絨毛狀侵染點長出多條毛狀根；
[0028]圖5為“針刺幼苗莖節法”誘導烏拉爾甘草毛狀根的產生及液體懸浮培養生產毛狀根，此時將長出的毛狀根切下后轉入含頭孢霉素的l/2Ms培養基中除菌培養；
[0029]圖6為“針刺幼苗莖節法”誘導烏拉爾甘草毛狀根的產生及液體懸浮培養生產毛狀根，此時毛狀根擴大培養；
[0030]圖7為“針刺幼苗莖節法”誘導烏拉爾甘草毛狀根的產生及液體懸浮培養生產毛狀根，此時毛狀根液體懸浮培養；
[0031]圖8為本發明方法得到的烏拉爾甘草毛狀根PCR檢測結果，其中Mimarker ；N:陰性對照；P陽性對照甘草毛狀根，該圖是以烏拉爾甘草毛狀根基因組DNA為模板擴增ι.ο1Α基因的結果；可以看出發根農桿菌中的基因片段rolA已完全整合到了烏拉爾甘草毛狀根中；
[0032]圖9為本發明方法得到的烏拉爾甘草毛狀根PCR檢測結果，其中Mimarker ；N:陰性對照；P陽性對照甘草毛狀根，該圖是以烏拉爾甘草毛狀根基因組DNA為模板擴增IOlC基因的結果；可以看出發根農桿菌中的基因片段IOlC已完全整合到了烏拉爾甘草毛狀根中；
[0033]圖10為烏拉爾甘草毛狀根毛細管凝膠電泳檢測結果，其中M為marker ;泳道1，3分別為陰性對照；泳道2為甘草毛狀根rolC(490bp)DNA片段；泳道4為甘草毛狀根rolA(248bp)DNA片段；泳道5為甘草毛狀根中VirD2基因片段；泳道6，7，8分別為發根農桿菌陽性對照rolC、rolA和VirD2基因片段；毛細管電泳檢測圖可以證實，獲得的甘草毛狀根已除菌完畢，發根農桿菌中的rolA(248bp)片段和ioIC(490bp)片段已完全整合到了甘草毛狀根基因組中。
[0034]【具體實施方式】
[0035]實施例1:
[0036]1、烏拉爾甘草無菌苗的培養:
[0037]挑選飽滿、干凈的烏拉爾甘草種子，加入濃硫酸拌勻(以濃硫酸浸潤種子表面為宜),處理40min后用自來水沖洗干凈,用0.1%升汞消毒15分鐘，然后用無菌水沖洗4次，再加入70%的乙醇消毒30秒，用無菌水沖洗4次，然后接種于Ms (固體)培養基中，置25°C，每天16小時光照，8小時黑暗條件下培養14天，待幼苗長至3.0cm高度并展出2_3對葉時，取幼苗切除根后用作被侵染外植體。
[0038]上述Ms (固體)培養基即為MS培養基，即Murashige and Skoogl962培養基。
[0039]2、制備發根農桿菌工程菌液:
[0040]將發根農桿菌ATCC15834 (Rhizobium rhizogenes (Riker et al.) Young etal.(ATCC15834)CIP104786 ;通過美國ATCC公司在中國的代理公司-北京中原公司購買)從_70°C冰箱中取出，劃線接種于YMB固體培養基(添加瓊脂粉12.0g/L)上，于28°C下活化培養48小時，挑取單菌斑接種于50mLYMB液體培養基(不加瓊脂粉)中，28°C下120rpm暗培養條件下振蕩培養，發根農桿菌菌液OD6tltl值達到0.6~0.8時，取菌液置離心管中，8000rpm離心lOmin，棄去上清液，用Ms液體培養基稀釋至菌液0D_值達0.6~0.8，加入乙酰丁香酮至終濃度為100uM，28°C下180rpm振蕩培養2h后用于侵染。
[0041]上述YMB液體培養基的成分為酵母抽提物(Yeast extract) 1.0g/L, MgSO4.7Η200.2g/L, K2HPO40.5g/L, NaCl0.lg/L,甘露醇(Mannitol )10.0g/L。在該 YMB 液體培養基的基礎上添加瓊脂粉12.0g/L即可得到YMB固體培養基。
[0042]上述Ms液體培養基與Ms培養基的成分相同，但去掉了其中的瓊脂，使培養基成為液體，即Ms液體培養基采用無瓊脂的Ms培養基。
[0043]3、“針刺幼苗莖節法”誘導烏拉爾甘草毛狀根的產生:
[0044]用無菌注射器針頭吸取上述制備好的發根農桿菌工程菌液，用針尖穿刺幼苗子葉節處，共穿刺2次，然后將侵染的幼苗轉移至Ms (固體)培養基中于25°C，12小時光照12小時暗培養條件下共培養2天，然后移栽到含頭孢霉素500mg/L的l/2Ms (固體)培養基中培養10天，即可在被侵染部位出現白色凸起(圖1)，隨后在白色凸起處長出簇狀絨毛狀根系(圖2、3、4)。將誘導出的毛狀根剪下，用含頭孢霉素500mg/L的無菌水溶液清洗毛狀根，然后用無菌水沖洗2次，吸干水后接種于含有頭孢霉素300mg/L的l/2Ms培養基上進行除菌培養，每周轉接一次，直至除菌完畢后接種于不含抗生素和激素的l/2Ms (固體)培養基上培養(圖5、6)。
[0045]上述含頭孢霉素500mg/L的l/2Ms (固體)培養基采用l/2Ms培養基，即在MS培養基的基礎上，其中的大量兀素和微量兀素添加量為Ms培養基的一半,鐵鹽和有機成分含量同Ms培養基，并且添加頭孢霉素500mg/L。
[0046]上述l/2Ms培養基，即在MS培養基的基礎上,其中的大量兀素和微量兀素添加量為Ms培養基的一半,鐵鹽和有機成分含量同Ms培養基。
[0047]上述不含抗生素和激素的l/2Ms (固體)培養基，即在MS培養基的基礎上，其中的大量兀素和微量兀素添加量為Ms培養基的一半,鐵鹽和有機成分含量同Ms培養基,無激素也不含抗生素。
[0048]4、烏拉爾甘草毛狀根的懸浮培養:
[0049]將除菌徹底、分支多、生長快的毛狀根根尖剪取2.0cm左右，接種于無激素的l/2Ms液體培養基(蔗糖含量為40.0g/L)中，每瓶接種200mg，置25°C下120rpm，暗培養條件下的恒溫搖床上振蕩培養，15天后收集毛狀根，置濾紙上吸干水分后稱重，毛狀根增殖倍數達30倍，切取生長旺盛的毛狀根根尖，用于繼代及大量培養。(圖7)
[0050]上述無激素的l/2Ms液體培養基(蔗糖含量為40.0g/L),即在MS培養基的基礎上，其中的大量兀素和微量兀素添加量為Ms培養基的一半,鐵鹽和有機成分含量同Ms培養基，蔗糖含量調整為40.0g/L，無激素。
[0051]5、烏拉爾甘草毛狀根的分子鑒定:
[0052](I )、毛狀根基因組DNA和未轉化甘草根基因組DNA的微量提取(采用CTAB法):
[0053]取烏拉爾甘草毛狀根和未轉化的根200mg，加液氮研磨成粉末，迅速轉入1.5ml離心管中，加入700 μ I CTAB抽提液并迅速搖勻，于65°C水浴45min，中途輕微振蕩二次以混勻。冷卻后加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，輕柔顛倒混勻至乳化狀，再以8000rpm離心lOmin。取上清液于 1.5mL離心管,重新加入等體積的氯仿:異戍醇(24:1),輕柔顛倒混勻至乳化狀再以8000rpm離心lOmin，取上清液于1.5mL離心管中，加入2/3體積的異丙醇，顛倒混勻，于_20°C下放置30min,4°C下10000r/min離心5min,棄去上清液,沉淀用70%乙醇洗2-3次，3000rpm離心lmin，徹底揮發除去乙醇，加入40 μ I雙蒸水溶解沉淀，即為所需DNA樣品，-20°C保存。
[0054](2 )、發根農桿菌質粒DNA的提取:
[0055]取2mL發根農桿菌菌液于2mL離心管中，室溫下以8000r/min離心8min,棄上清液，收集菌體，加入預冷的溶液1300 μ 1，快速顛倒離心管10次以混合均勻，室溫下放置lOmin，再加入600 μ I溶液II，快速顛倒離心管10次，置冰浴中lOmin，加入冰溶液III溶液450 μ I,充分混勻，冰浴IOmin后以12000rpm離心5min,轉移上清液于另一 2mL離心管中，加ImL冰異丙醇，充分混勻，靜置IOmin后以1000Orpm離心lOmin，棄上清液，加70%冰乙醇漂洗沉淀，3000rpm離心Imin徹底揮去乙醇，加入40 μ I雙蒸水溶解DNA，_20°C保存備用。
[0056](3)、烏拉爾甘草毛狀根分子檢測:
[0057]取IOOng甘草毛狀根基因組DNA為模板，以甘草細胞基因組DNA陰性對照，以發根農桿菌質粒DNA為陽性對照，rolA基因的引物序列為:Forward Primer:5/ -CGTTGTCGGAATGGCCCAGACC-3 '，Reverse Primer:5 ' -CGTAGGTCTGAATATTCCGGTCC-3 ' ;rolC 基因的引物序列為:Forward Primer: 5 ' -TGTGACAAGCAGCGATGAGC-3 ' , Reverse Primer:5' -GATTGCAAACTTGCACTCGC-3'。
[0058]為了進一步確定獲得的甘草毛狀根已成功導入了發根農桿菌Ri質粒的rolA和rolC基因，轉化毛狀根未受到發根農桿菌污染，對發根農桿菌Ri質粒的病毒區特征基因VirD2 進行 PCR 檢測，引物序列為:Forward Primer: 5 ' -ATGCCCGATCGAGCTCAAGT-3 '，Reverse Primer:-CCTGACCCAAACATCTCGGCTGCCCA-3'。PCR 反應采用 25 μ L 體系，94°C變性3min，55°C退火0.5min, 72°C延伸3min，35個循環，最后于72°C延伸5min，擴增產物用
0.8%瓊脂糖凝膠電泳和QLAxcel全自動DNA/RNA分析系統檢測(見圖8、9、10)。
[0059]結果表明，甘草毛狀根的DNA經PCR擴增得到了 248bp的RolA片段和490bp的RolC片段，而對照沒有PCR擴增產物，同時，對甘草毛狀根毛細管凝膠電泳檢測中沒有發現發根農桿菌ATCC15834的特異性片段VirD2說明甘草毛狀根沒有攜帶農桿菌，除菌很徹底，RolA, RolC基因片段已成功插入到烏拉爾甘草基因組中，所得到的甘草毛狀根確實為發根農桿菌ATCC15834侵染后形成的。
[0060]登陸http//: www.ncb1.nlm.nih.gov,應用 BLAST 程序將測定的 RolA、RolC 序列與GenBank中的RolA、RolC (GenBank:X64255.1)、的DNA序列進行同源性比較，BLAST比對結果顯示，RolA、RolC序列相似度達97.5%。
[0061]6、甘草毛狀根懸浮培養生產培養基的篩選:
[0062]選取在無激素Ms (固體)培養基上生長旺盛且分枝較多的毛狀根，切取根尖1.0~
1.5cm部位0.1g轉入1/2MS液體培養基(蔗糖濃度為40.0g/L), (150mL三角瓶，50mL/瓶)，置25°C下轉速為IlOrpm的恒溫振蕩箱中暗培養，IOd后毛狀根開始進入對數生長期，生長至21d，毛狀根生物量達到最大，收集毛狀根，置濾紙上吸干水分后稱重測量，增殖倍數達到29.13倍(鮮重)，將收集到的毛狀根冷凍干燥，粉碎成100目干粉。
[0063]采用2010年版《中國藥典》中甘草酸、甘草苷提取方法進行提取，高效液相色譜法測定毛狀根中甘草苷、甘草酸 ，其中甘草苷含量為0.526%，甘草酸含量1.26%，接近于3年生甘草中的含量，因此，l/2Ms液體培養基(蔗糖濃度為40.0g/L)可作為毛狀根高效生產甘草酸、甘草苷等藥用次生代謝產物的生產培養基。
[0064]上述的無激素Ms (固體)培養基，即無激素的Ms培養基。
[0065]上述的1/2MS液體培養基(蔗糖濃度為40.0g/L),即在MS培養基的基礎上其中的大量兀素和微量兀素添加量為Ms培養基的一半,鐵鹽和有機成分含量同Ms培養基,并且去掉了瓊脂，調整蔗糖濃度為40.0g/L。
[0066]序列表
[0067]<110>寧夏農林科學院
[0068]〈120〉高效誘導烏拉爾甘草毛狀根產生及用其生產甘草次生代謝產物的方法
[0069]<160>8
[0070]<210>1
[0071]<211>282
[0072]<212>DNA
[0073]<213>RolA 片段 DNA 序列(GenBank = XM255.1)
[0074]〈400〉I
[0075]
【權利要求】
1.一種高效誘導烏拉爾甘草毛狀根產生的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)無菌外植體的獲得: 取烏拉爾甘草種子，滅菌后接種于幼苗培養基進行培養，獲得株齡12~15d的無菌幼苗，切除根部后作為外植體； (2)發根農桿菌工程菌液的制備: 取含有Ri質粒的發根農桿菌，經活化培養，挑取單菌斑接種于YMB液體培養基培養至菌液0D_值為0.6~0.8，離心后棄上清液，加入等體積Ms液體培養基稀釋至菌液0D_值為0.6~0.8，添加乙酰丁香酮至終濃度為100~150 μ M，制成工程菌液待用； (3)針刺幼苗莖節誘導毛狀根產生: 按照步驟(1)中獲得的外植體，經步驟(2)中獲得的工程菌液進行農桿菌介導轉化，再將介導轉化過的外植體接種于共培養基中，培養24h~48h，然后將外植體接入抑菌培養基中，除菌培養10~15d，直至在外植體上子葉莖節處長出毛狀根。
2.如權利要求1所述的高效誘導烏拉爾甘草毛狀根產生的方法，其特征在于:步驟(3)中針刺幼苗莖節誘導毛狀根產生的具體步驟為:用注射器針頭蘸取制備好的發根農桿菌工程菌液，在處理好的外植體即無菌甘草幼苗的子葉節處穿刺1-2次，將穿刺過的外植體置無菌濾紙上吸去多余的菌液，然后移栽到不含激素和抗生素的Ms培養基中，置25土1°C下共培養2~3天，然后轉移到含頭孢霉素300~500mg/L的Ms培養基中，培養10-15天即可在子葉節處出現白色凸起，3~5天后在凸起處長出簇狀絨毛根系。
3.如權利要求1所述的高效誘導烏拉爾甘草毛狀根產生的方法，其特征在于:步驟(1)中幼苗培養基采用Ms培養基；或者采用MS培養基，并且調整其中蔗糖至30g/L，瓊脂粉至5.5g/L，無激素；步驟(2)中的Ms液體培養基是在MS培養基的基礎上去掉了瓊脂。
4.如權利要求1所述的高效誘導烏拉爾甘草毛狀根產生的方法，其特征在于:步驟(2)中發根農桿菌為含有Ri質粒的發根農桿菌ATCC15834。
5.如權利要求1所述的高效誘導烏拉爾甘草毛狀根產生的方法，其特征在于:步驟(2)中YMB液體培養基的成分為酵母抽提物1.0g/L, MgSO4.7Η200.2g/L，K2HPO40.5g/L, NaCl0.1 g/L,甘露醇 10.0g/L。
6.如權利要求1所述的高效誘導烏拉爾甘草毛狀根產生的方法，其特征在于:步驟(3)中共培養基采用Ms培養基；或者采用MS培養基，并且調整其中瓊脂粉至5.5g/L，蔗糖至30.0g/L,乙酰丁香酮至50~100 μ M ; 步驟(3)中抑菌培養基采用l/2Ms培養基，即在MS培養基的基礎上其中的大量元素和微量元素添加量為Ms培養基的一半，鐵鹽和有機成分含量同Ms培養基，并且添加頭孢霉素300mg/L ~500mg/L。
7.如權利要求2所述的高效誘導烏拉爾甘草毛狀根產生的方法，其特征在于:其中置25± 1°C共培養2~3天的同時應處于弱散射光條件下。
8.一種利用烏拉爾甘草毛狀根生產甘草次生代謝產物的方法，其特征在于，包括如下步驟:剪取權利要求1或2中所述方法得到的毛狀根，長度約1.5~2.0cm，接種到含有頭孢霉素100~300mg/L的l/2Ms培養基進行除菌培養，每5~7天轉入新的l/2Ms培養基，直至除菌完畢，將得到的無菌毛狀根根尖剪成1.0-1.5cm的段，接種于無激素的l/2Ms液體培養基中， 置25± 1°C，轉速110~120rpm，暗培養條件下的恒溫振蕩器上振蕩培養15~20天，收集毛狀根，冷凍干燥后粉碎成100~200目粉末即可。
9.如權利要求8所述的利用烏拉爾甘草毛狀根生產甘草次生代謝產物的方法，其特征在于:從得到的甘草毛狀根粉末中提取出甘草酸、甘草苷。
10.如權利要求8所述的利用烏拉爾甘草毛狀根生產甘草次生代謝產物的方法，其特征在于:含有頭孢霉素100~300mg/L的l/2Ms培養基，即在MS培養基的基礎上其中的大量元素和微量元素添加量為Ms培養基的一半，鐵鹽和有機成分含量同Ms培養基，并且添加頭孢霉素100~300mg/L ;其中無激素的l/2Ms液體培養基，即在MS培養基的基礎上其中的大量兀素和微量兀素添加量為Ms培養基的一半,鐵鹽和有機成分含量同Ms培養基,并且去掉了瓊脂也無激素。`
【文檔編號】A01H5/06GK103695458SQ201310551834
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年11月8日 優先權日:2013年11月8日
【發明者】郭生虎, 王敬東, 馬洪愛, 石磊 申請人:寧夏農林科學院