一種甜菜內生微桿菌及其用于甜菜病害生物防治中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種甜菜內生微桿菌MicrobacteriummaritypicumTNJK2011CGMCCNo.8193及其在在用于甜菜病害生物防治中的應用。通過通過對所獲菌株進行形態特征、生理生化特性及16SrDNA序列測定及系統發育分析，初步確定了其分類地位；同時對該細菌TNJK2011的發酵液的抑菌率、生防性、穩定性等特性進行了深入研究，從已經分離的甜菜內生菌中篩選甜菜根腐病、甜菜褐斑病、甜菜立枯病、甜菜蛇眼病內生拮抗細菌，以期獲得防治甜菜主要病害的新途徑，具有廣泛的應用價值。
【專利說明】一種甜菜內生微桿菌及其用于甜菜病害生物防治中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及農業微生物應用【技術領域】，具體說，本發明涉及一種甜菜內生菌及其用于甜菜病害生物防治中的應用的【技術領域】。
【背景技術】
[0002]植物體內的大量微生物，在與植物協同進化的過程中，由于長期生活在植物特定部位，因而與植物形成了一種特殊的關系，這些微生物在植物體內大量繁殖和擴散，有望成為生物防治中有潛力的微生物。內生細菌是植物體內種類和數量最多的微生物，具有在植株體內分布廣、定殖能力強、防病效果好及增殖和擴散快等優點，因而成為具有良好應用前景的植物病害生防菌。
[0003]內生菌普遍存在于植物體內，與宿主形成和諧的共生體，產生大量次生代謝活性物質。據報道，內生菌可增強宿主的抗病性、提高植物的生產力、抗逆抗蟲、具有除草劑活性等特性。因此，內生菌可作為生物促生中有潛力的因子，在生態農業和生物農藥研制方面具有重要的用途。植物內生細菌(Endophytic bactena )可通過不同途徑促進其宿主植物生長，其作用與植物根圍細菌相似(PGPR)，植物根圍細菌也就是常說植物根圍促生細菌(Plant growth -promo ting rAizoAacteria,簡稱PGPR),生存于植物根際、根表,能夠直接或間接地促進或調節植物 以及作物生長。植物內生細菌能固定大氣中的氮供給其宿主植物利用；合成鐵載體能夠溶解并吸收土壤中鐵供給其宿主植物利用；合成植物激素促進植物不同生長階段的生長，具有溶解礦物質如磷的機制，使其更有利于植物利用；作用于生長有關的酶使其調節植物的生長發育。
[0004]甜菜內生菌0?而—是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康甜菜各種組織和器官內部或細胞間隙的真菌、細菌和放線菌。作為植物微生態系統的天然組成成員，內生細菌可在植物體內長期定殖，某些內生細菌可通過產生抗生素、水解酶類等抗菌活性物質在植物體內長期發揮生防作用；相對于腐生細菌、PGPR (植物促生菌)等生防因子，內生細菌不易受環境條件的影響，可在植物體內定殖和傳導，更有利于發揮生防作用，已成為植物病害生物防治上一類極具應用潛能的新資源菌。已有研究者從棉花、水稻、煙草、辣椒、番茄、馬鈴薯等作物中分離到對宿主植物病害具有良好防治效果的內生細菌，但目前尚未見甜菜內生細菌用于病害生物防治的研究報道。
【發明內容】
[0005]針對現有技術未見有關甜菜內生細菌用于病害生物防治的研究報道的技術的現狀，本發明旨在提供一種甜菜內生微桿菌及其用于甜菜病害生物防治中的應用，本發明基于植物內生菌與植物和諧聯合的關系，在甜菜中分離出一批內生菌的菌株，從中篩選出一株編號為TNJK2011的菌株，并通過利用該編號為TNJK2011的內生菌有效地防治甜菜生育期的根腐病、褐斑病、立枯病、蛇眼病等病害，將病害對甜菜生產的不利影響降低到最低限度，有利于提高甜菜的產量和品質，獲得良好的技術效果，作為甜菜病害生物防治中具有廣泛而適用的價值。
[0006]本發明采用主要的技術方案:
通過甜菜內生菌的分離篩選，在甜菜中分離出一批甜菜內生的微生物菌株，經過進一步篩選、馴化選育，獲得一株編號為TNJK2011。通過對所獲菌株進行形態特征、生理生化特性及16S rDNA序列測定及系統發育分析，初步確定了其分類地位；同時對該細菌TNJK2011的發酵液的抑菌率、生防性、穩定性等特性進行了深入研究，從已經分離的甜菜內生菌中篩選甜菜根腐病、甜菜褐斑病、甜菜立枯病、甜菜蛇眼病內生拮抗細菌，以期獲得防治甜菜主要病害的新途徑。通過內生菌有效地防治甜菜生育期的各類病害，將病害對甜菜生產的不利影響降低到最低限度，證明了編號為TNJK2011是一種優良的內生生防菌，有利于提高甜菜的產量和品質，充分保障糖廠原料的充足供應，對于穩定甜菜生產，提高農民種植甜菜的積極性，實現農戶、糖廠的增產增收，增強新疆糖業的市場競爭力有著深遠的意義。通過將此內生菌在甜菜栽培上的應用獲得良好作用，具有突出的技術效果。
[0007]本發明具體提供的一種甜菜內生微桿菌Microbac terium mari typicum,通過在甜菜中分離、篩選和培養，獲得一批內生的微生物菌株，從中篩選出一株編號為TNJK2011的菌株，經微生物學分類與鑒定，屬于內生微桿菌#丨crobac teri um mari typi cum。
[0008]具體的，本發明提供的一種甜菜內生微桿菌Mi crobac teri um mari typi cum,菌株編號為TNJK2011。該菌株已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編:100101。保藏日期是2013年9月16日，保藏號是CGMCC N0.8193。該菌株最適生長條件為:溫度32°C，培養基采用胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養基，培養條件:pH7.2，時間48h;該菌株菌落較大且平滑，呈透明、黃色、表面濕潤、邊緣整齊，生長較快；通過革蘭氏染色，鏡檢觀察，發現該菌株為革蘭氏陽性菌，經微生迦學鑒定％ Microbacterium mari typicum菌。依照第九版《伯杰氏系統細菌學鑒定手冊》(JiBergey，s Manual of` Systematic和《常用細菌系統鑒定手冊》對TNJK2011菌株進行形態學測定，生理生化檢測確定TNJK2011Microbacterium屬中的成員。通過BLAST同源比對，菌株TNJK2011的16S rDNA序列在NCBI數據庫中進行BLAST分析后，構建系統進化樹，該菌株TNJK2011maritypicumDSM 12512處于最小分支，是其近似種；進而將該菌株TNJK2011確定mari typi cum。
[0009]本發明提供的內生促生菌#/^/"0如<^ teria? mari typicum TNJK2011培養時使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨酵母粉；使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、甘露糖、甘油、麥芽糖；使用的無機組分包括包括但不限于氯化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鈉、氫二鉀、磷酸三鈣、二水氯化鈣、七水合硫酸鎂、七水和硫酸亞鐵。本發明的根際促生菌發酵可在20-37 °C, pH5.5-9.1的環境下進行。并且該內生拮抗菌TNJK2011能有效抑制根腐病、褐斑病、立枯病、蛇眼病病原菌生長。
[0010]進一步，本發明提供一種甜菜內生微桿菌Microbacteriutn mari typicumTNJK2011 CGMCC N0.8193在用于甜菜病害生物防治中的應用。通過將該菌種TNJK2011菌株對于甜菜具有抑制根腐病、褐斑病、立枯病、蛇眼病病原菌作用，獲得良好的技術效果。
[0011]本發明進一步提供了甜菜內生微桿菌mari typicum TNJK2011CGMCC N0.8193的保存條件，采用TSA培養基成分:TSA胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，葡萄糖 2.5g，氯化鈉 5g K2HPO4 2.5g PH=7.2 定容至 1000ml ;培養條件:28°C, PH=7.0。
[0012]通過實施本發明具體的
【發明內容】
，可以達到以下有益效果:
本發明分離篩選提供的甜菜內生微桿菌crobac teri um mari typi cum TNJK2011CGMCC N0.8193是一種優良的內生拮抗菌，具有突出的生防特性，該內生促生菌TNJK2011甜菜根腐病、甜菜褐斑病、甜菜立枯病、甜菜蛇眼病內生拮抗細菌，以期獲得防治甜菜主要病害的新途徑。通過內生菌有效地防治甜菜生育期的根腐病、褐斑病、立枯病、蛇眼病等病害，將病害對甜菜生產的不利影響降低到最低限度，證明了編號為TNJK2011是一種優良的內生生防菌，獲得良好的技術效果，有利于提高甜菜的產量和品質，充分保障糖廠原料的充足供應，對于穩定甜菜生產，提高農民種植甜菜的積極性，實現農戶、糖廠的增產增收，增強新疆糖業的市場競爭力有著深遠的意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖！顯不為甜菜內生微桿菌佑^/^如^從/應趟/分沙化"? TNJK2011 CGMCC N0.8193的菌落形態圖。
[0014]圖2顯不為甜菜內生微桿菌#/^/'0如<^6?/'/?7?趟/分_7/^^"?TNJK2011 CGMCC N0.8193的生長曲線圖。
[0015]圖3顯不為甜菜內生微桿菌#/^/'0如<^6?/'/?7?趟/分_7/^^"?TNJK2011 CGMCC N0.8193的16S rDNA系統發育樹圖。
【具體實施方式】
[0016]下面，舉實施例說明本發明，但是，本發明并不限于下述的實施例。
[0017]本發明中涉及到的主要原輔材料、試劑和儀器設備:DFsalts minimal medium(IL): 4.0g KH2PO4, 6.0g Na2HPO4, 0.2gMgS04 ? 7H20, 2.0g glucose, 2.0g gluconic acid,2.0g citricacid;痕量兀素:Img FeSO4 ? 7H20, IOmgH3BO3, 11.1mg MnSO4 ? H2O, 124.6mgZnSO4 ? 7H20, 78.22mg CuSO4 ? 5H20, IOmg MoO3; pH7.2; and2.0g (NH4) 2S04 中加入 L-色氨酸 IOOu g ? mL' 0.7mmol ? L-1 磷酸緩沖液(pH6.9):用 0.2606g ? L-1 Na2HPO4 ? 12H20 調0.1092g ? L-1 NaH2PO4 ? 2H20 至 pH6.9。
[0018]主要儀器與試劑:TG328A型分析天平，AB204-N型電子天平，PHS-3TC (0.01級)精密數顯酸度計，101-2型干燥箱，UV-2100分光光度計，HYG-1I回轉式恒溫調速搖瓶柜，LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌器，超凈工作臺，3K15臺式冷凍離心機；甘油，牛肉膏，酵母膏，氯化鈉，氫氧化鈉，葡萄糖，硫酸鎂，硫酸鋅，硫酸亞鐵，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，瓊脂，鹿糖，次氯酸鈉，PCR預混液{TaKaRa Biotechnology),其余試劑均為分析純。
[0019]本發明中選用的所有原輔材料，以及選用的菌種培養方法都為本領域熟知選用的，本發明中涉及到的％都為重量百分比，除非特別指出除外。
[0020]實施例一:甜菜內生微桿菌#/croAacteria?TNJK2011 CGMCC N0.8193的分離、篩選及鑒定
(1)菌種的分離和篩選
從甜菜組織中通過梯度稀釋法分離出多株細菌，采用平板對峙法，根據有無抑菌圈判斷其是否具有拮抗作用，初步篩選出對甜菜根腐病、褐斑病、立枯病、蛇眼病等病原具有一定拮抗能力的菌株。對具有拮抗作用的菌株進行進一步實驗，篩選出拮抗能力較強的菌株以備后續實驗。
[0021 ] 通過在甜菜組織中分離、篩選和培養，獲得一批內生菌的微生物菌株,從中篩選出一株編號為TNJK2011的菌株,經微生物學分類與鑒定，屬于微桿菌屬的#/^/-0如<^6?/^'仰？mari typi cum。
[0022]具體的，本發明提供的一種甜菜內生微桿菌Mi crobac teri um mari typi cum,菌株編號為TNJK2011。該菌株已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編:100101。保藏日期是2013年9月16日，保藏號是CGMCC N0.8193。經微生物學鑒定為#/ crobac teri um mari typi cum。該菌株最適生長條件為:溫度32° C，培養基采用胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養基，培養條件:pH7.2，時間48h;該菌株菌落較大且平滑，呈透明、黃色、表面濕潤、邊緣整齊，生長較快；通過革蘭氏染色，鏡檢觀察，發現該菌株為革蘭氏陽性菌，菌株TNSC2011為革蘭氏陽性，菌體
0.3-0.5MmX0.8-1.7Mm，TSA平板上28°C培養48h菌落黃色，菌落2_4mm。經微生物學鑒定為Mi crobac teri um mari typi cum舊。依照第九版《伯杰氏系統細菌學鑒定手冊》(JiBergey，sManual of Systematic和《常用細菌系統鑒定手冊》對TNJK2011菌株進行形態學測定，生理生化檢測確定TNJK2011菌株為微桿菌屬(Microbacterium)中飽澈艮。通過BLAST同源比對，菌株TNJK2011的16S rDNA序列在NCBI數據庫中進行BLAST分析后，構建系統進化樹，該菌株TNJK2011與Microbacterium mari typicumDSM 12512處于最小分支，是其近似種；進而將該菌株TNJK2011觀定% Microbacterium mari typi cum。
[0023]本發明提供的內生促生菌TNJK2011培養時使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉；使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、甘露糖、甘油、麥芽糖；使用的無機組分包括包括但不限于氯化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鈉、氫二鉀、磷酸三鈣、二水氯化鈣、七水合硫酸鎂、七水和硫酸亞鐵。本發明的內生拮抗菌發酵可在20-37°C，pH5.5-9.1的環境下進行。并且該內生拮抗菌TNJK2011能有效抑制根腐病、褐斑病、立枯病、蛇眼病病原菌生長。
[0024]通過上述對TNJK2011菌株進行形態學測定，并對菌株TNJK2011的形狀、大小、生理生化反應進行檢測，本發明的TNJK2011菌株生物學特性如表1所示。
[0025]表1:菌株TNJK2011的生理生化特性
【權利要求】
1.一種甜菜內生微桿菌#/^(9如maritypicum TNJK2011，其特征在于，所述的甜菜內生微桿菌如cteri訓？ maritypicum TNJK2011的菌種保藏號為CGMCC N0.8193。
2.—種如權利要求1所述的甜菜內生微桿菌#/^(9/?況teri?艦TNJK2011在用于甜菜病害生物防治中的應用。
3.如權利要求2所述的甜菜內生微桿菌#/^(9/?況teri?maritypicum TNJK2011在用于甜菜病害生物防治中的應用，其特征在于，所述的甜菜內生微桿菌maritypicum TNJK2011應用于甜菜抑制根腐病、褐斑病、立枯病、蛇眼病病原菌中的應用。
【文檔編號】A01P3/00GK103642734SQ201310660484
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月10日 優先權日:2013年12月10日
【發明者】史應武, 楊紅梅, 高雁, 張濤, 林青, 常瑋, 李玉國, 歐提庫爾瑪合木提, 婁愷 申請人:新疆農業科學院微生物應用研究所