一種白刺組培苗的培養方法
【專利摘要】本發明公開了一種白刺組培苗的培養方法，主要是對白刺種子發芽之后的實生苗，運用適宜的方法進行消毒和在簡易的培養基上進行單芽莖段直接生根生長快繁，從而建立起來的一套簡易、經濟、快速的白刺組培苗培養方法。該方法首先找到適宜幼嫩白刺實生苗消毒的藥劑和方法；其次是以單芽莖段直接生根成苗的方式增殖，在短時間內即可穩定獲得完整植株，植株葉綠根壯，生長健康；最后培養基用自來水代替蒸餾水配置，白糖代替蔗糖作為碳源加入，同時避免了太多額外植物生長調節劑的使用，這在成本和操作上得到了大大的節約和簡化，為白刺的快速繁殖提供了一條新的實用途徑，也為后期實現工廠化生產奠定了基礎。
【專利說明】一種白刺組培苗的培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及組培育種領域，具體涉及一種白刺組培苗的培養方法。
【背景技術】
[0002]白刺別名沙櫻桃，俗稱地棗，根系發達，具有抗鹽堿、耐干旱、固沙改土的優良特性，是典型的沙旱生植物，在防風固沙、穩定沙漠、保護沙區綠洲中發揮著重要作用。白刺根寄生的鎖陽，為傳統名貴的溫補藥材。近年來，從野生植物資源中尋找新的、潛在的藥食同源植物，已成為國內外學者研究的熱點，而沙旱生植物白刺則是經過長期的自然篩選而保留下來的優勝者之一，白刺因其頑強的生命力和優良的遺傳基因而受到沙區人民的喜愛。白刺果含多種營養成分和豐富的微量元素，有調節血糖、血脂、降血壓，顯著提高人體免疫力、抗疲勞、抗寒冷、增進睡眠等功效，具有極高的營養和藥用價值。以它為優勢種和建群種構成的草地還是我國風沙干旱地區家畜重要的天然牧場。然而據調查表明，白刺有雄性不育現象，種間雜交混亂，變異大，種子繁殖品質退化相當嚴重，同時白刺種子存在高度休眠問題，栽培化程度低，這為人工大面積栽培和良種選育帶來了很大的困難。
[0003]采用組織培養快速繁殖技術可能是獲得優質、整齊白刺苗木的一條有效途徑，這對于合理開發和持續利用白刺資源有積極意義。目前，較多學者何正倫、孫雪新、郭曉紅等都進行過白刺的組培研究，所形成的再生體系中消毒劑用的是升汞。升汞對外植體的傷害較大，時間稍有不當就會造成消毒失敗，或者對外植體致死現象嚴重，這給后期工作造成困難。
【發明內容】
[0004]本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了一種適宜白刺組培苗的經濟、簡便的培養方法。
[0005]為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為:一種白刺組培苗的培養方法，包括以下步驟:
1)外植體消毒:將白刺種子發芽得到的實生苗，剪取幼嫩莖段，消毒后用無菌水沖洗4-5次，得到消毒好的白刺莖段；
2)將步驟I)中消毒好的白刺莖段接種于MS培養基上，放于培養室培養，待其生根并拔節長高得到白刺無菌苗；
3)莖段快繁:將步驟2)得到的長高至4-5cm的白刺無菌苗切取帶芽莖段，接于生根培養基上，放于培養室培養，進行生根誘導；生根誘導過程為:將帶有頂芽的白刺無菌苗莖段直接接于MS培養基上進行生根培養，其余白刺無菌苗莖段接于1/2MS培養基+0.5mg/L吲哚乙酸上進行生根培養；培養室培養條件為溫度25±1°C，光照強度2000Lx，光照16h/d。
[0006]進一步的，上述的一種白刺組培苗的培養方法，所述步驟I)中，消毒過程為用75%酒精消毒30s，再用10%次氯酸鈉消毒15min-18min。
[0007]進一步的，上述的一種白刺組培苗的培養方法，所述步驟2)和步驟3)中，培養基MS和1/2MS，碳源使用的是白糖，配置培養基所用均為常用自來水。[0008]進一步的，上述的一種白刺組培苗的培養方法，所用白刺為野生白刺。
[0009]進一步的，上述的一種白刺組培苗的培養方法，所述MS培養基和1/2MS培養基的配置組成為:
MS培養基:MS母液成分+30g白糖+0.1g肌醇+4.5g瓊脂粉，自來水定容配置；
1/2MS培養基:MS母液成分劑量減半+30g白糖+0.1肌醇+4.5g瓊脂粉，自來水定容配置；
所述MS母液的組成成分以質量濃度計為:
大量元素:NH4N031650mg/L, KNO3 1900 mg/L，MgSO4.7H20 370 mg/L, KH2PO4 170 mg/
L ；
微量元素:KI 0.83 mg/L, H3BO3 6.2 mg/L, MnSO4.4Η20 22.3 mg/L, ZnSO4.7Η20 8.6mg/L, Na2MnO4.2H20 0.25 mg/L, CuSO4.5H20 0.025 mg/L, CoCl2.6H20 0.025 mg/L ；維生素:煙酸10 mg/L,鹽酸批P多醇I mg/L,鹽酸硫胺素I mg/L ；
鈣鹽=CaCl2.2H20 440 mg/L ；
鐵鹽:FeS04.7H20 27.8 mg/L, Na2-EDTA.2H20 37.3 mg/L。
[0010]外植體培養是再生的第一步，無菌苗的生長狀態直接關系到后期工作的開展。因此，本方法反復進行了不同消毒劑、不同消毒時間對外植體消毒的影響試驗，以期解決0.1%升汞消毒時，消毒時間短導致外植體消毒不徹底，或者消毒時間稍長，外植體就褐化死亡，抑或消毒率太低等問題。本方法最后確定采用的消毒劑10%次氯酸鈉，性質比較溫和，對外植體傷害力不大，同時消毒時間確定在15-18min，不但外植體依然能保持健康綠色和活力，消毒率也達到90%-100%，這大大節省了外植體取材工作，也為后期試驗提供充足無菌苗做了可靠保障。
[0011]本發明提供的白刺單芽莖段直接在培養基上生根成苗，逐節剪取作為增生的組培途徑，整個過程不經歷愈傷組織的誘導和分化階段，這一增殖途徑對保持白刺組培苗遺傳性狀穩定十分有利。同時提供的培養基用自來水配置和白糖代替蔗糖作為碳源加入這一方法，不但沒有影響到組培苗的正常生根生長，而且在成本上也有所降低。
[0012]本發明的有益效果為:本發明提供的一種白刺組培苗的培養方法，經濟、簡便，為白刺的快速繁殖提供了一條切實可行的新途徑。該方法首先研究出適宜于幼嫩白刺外植體消毒的方案，提出適宜的消毒劑以及消毒時間；其次試驗出在短時間內即可穩定獲得完整植株的一系列措施，整個過程以單芽莖段直接生根成苗的方式增殖；同時也提出了所用培養基是用自來水代替蒸餾水配置，白糖代替蔗糖作為碳源加入，克服了現有技術中太多植物生長調節劑的使用，獲得了一個適于白刺組培苗簡便培養的成熟方法，在成本和操作上得到了大大的節約和簡化，對白刺生物育種和工廠化生產具有實踐應用價值。
【具體實施方式】
[0013]實施例1:
(1)供試材料:野生白刺；
(2)外植體消毒:將種子發芽得到的實生苗，剪取幼嫩莖段，用75%酒精消毒30s，隨后分別用兩種消毒劑對莖段進行不同時間的處理比較，0.1%氯化汞處理4、6、8、IOmin ;10%的次氯酸鈉處理7、10、12、15、18min，無菌水沖洗4_5次，接于MS培養基(自來水配置)上，每處理10瓶，每瓶3株外植體，放于溫度25± 1°C，光照強度2000LX，光照16h/d的條件下培養，幾天后統計消毒情況；
(3)莖段誘導:待消毒好的白刺莖段在MS培養基(自來水配置)上生根并且拔節長高至4-5cm，即可切取單芽莖段，分兩種方式進行培養:一種是接于分化培養基上進行增殖誘導，分化培養基設置兩種:MS+0.5mg/LBA+l.0mg/LNAA+2.0mg/LGA 和 MS+2.0mg/LBA+0.5mg/LIBA ;一種是直接進行生根誘導，每處理10瓶，每瓶3株外植體，放于溫度25± 1°C，光照強度2000Lx，光照16h/d的條件下培養，統計各自結果；
(4)生根誘導:切取的單芽莖段，接于生根培養基上，放于培養室培養，進行生根誘導。生根誘導培養基設置兩種:MS培養基(自來水配置)和1/2MS+0.5mg/LIBA培養基。每處理10瓶，每瓶3株外植體，放于溫度25± 1°C，光照強度2000LX，光照16h/d的條件下培養，統計生根情況；
結果表明，0.1%升汞作為消毒劑，其殺傷力極大，在處理8min和IOmin時，外植體全部褐化死亡；在處理4min時，外植體受傷害雖輕，但是漸漸菌絲就會長出，消毒不徹底；在處理6min時，外植體的狀態表現不同，有褐化死亡的，有消毒不徹底的，也有消毒干凈的，消毒率僅13.33%，且發現莖段后期生長緩慢或停滯。10%次氯酸鈉作為消毒劑，其性質比較溫和，在各處理當中外植體均未發現褐化死亡現象。在處理7min時，雜菌會有很多，消毒不徹底；在處理IOmin和12min時，消毒率可達60%以上，在處理15min和18min時，消毒率可達90%到100%，且外植體均健康，且在適宜培養基上即能生根生長。
[0014]從莖段分化和生根誘導的處理結果表明，采用的單芽莖段增殖誘導途徑，在選用的已經公開的野生白刺分化增殖培養基上，未見芽點分化增殖，僅略微的膨大，隨后葉片黃化死亡。這可能是白刺基因型依賴的問題，這一途徑可以再進行激素調整繼續研究。采用的單芽莖段直接生根誘導途徑，在MS培養基(自來水配置)中僅有帶頂芽的莖段可以生根，在1/2MS+0.5mg/LIBA培養基中幼嫩帶芽莖段生根良好，老化的帶芽莖段生根較困難。后面將1/2MS+0.5mg/LIBA培養基也改用自來水配置，對生根誘導與之前比較沒有差別。
[0015]最后應說明的是:以上所述僅為本發`明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種白刺組培苗的培養方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)外植體消毒:將白刺種子發芽得到的實生苗，剪取幼嫩莖段，消毒后用無菌水沖洗4-5次，得到消毒好的白刺莖段； 2)將步驟I)中消毒好的白刺莖段接種于MS培養基上，放于培養室培養，待其生根并拔節長高得到白刺無菌無菌苗； 3)莖段快繁:將步驟2)得到的長高至4-5cm的白刺無菌苗切取帶芽莖段，接于生根培養基上，放于培養室培養，進行生根誘導；生根誘導過程為:將帶有頂芽的白刺無菌苗莖段直接接于MS培養基上進行生根培養，其余白刺無菌苗莖段接于1/2MS培養基+0.5mg/L吲哚乙酸上進行生根培養；培養室培養條件為溫度25±1°C，光照強度2000Lx，光照16h/d。
2.根據權利要求1所述的一種白刺組培苗的培養方法，其特征在于:所述步驟I)中，消毒過程為用75%酒精消毒30s，再用10%次氯酸鈉消毒15min-18min。
3.根據權利要求1所述的一種白刺組培苗的培養方法，其特征在于:所述步驟2)和步驟3)中，培養基MS和1/2MS，碳源使用的是白糖，配置培養基所用均為常用自來水。
4.根據權利要求1-3任一所述的一種白刺組培苗的培養方法，其特征在于:所用白刺為野生白刺。
5.根據權利要求4所述的一種白刺組培苗的培養方法，其特征在于:所述MS培養基和1/2MS培養基的配置組成為: MS培養基:MS母液 成分+30g白糖+0.1g肌醇+4.5g瓊脂粉，自來水定容配置； 1/2MS培養基:MS母液成分劑量減半+30g白糖+0.1肌醇+4.5g瓊脂粉，自來水定容配置； 所述MS母液的組成成分以質量濃度計為:
大量元素:NH4N031650mg/L, KNO3 1900 mg/L，MgSO4.7H20 370 mg/L, KH2PO4 170 mg/L ；
微量元素:KI 0.83 mg/L, H3BO3 6.2 mg/L, MnSO4.4Η20 22.3 mg/L, ZnSO4.7Η20 8.6mg/L, Na2MnO4.2H20 0.25 mg/L, CuSO4.5H20 0.025 mg/L, CoCl2.6H20 0.025 mg/L ； 維生素:煙酸10 mg/L,鹽酸批P多醇I mg/L,鹽酸硫胺素I mg/L ；
鈣鹽=CaCl2.2H20 440 mg/L ；
鐵鹽:FeS04.7H20 27.8 mg/L, Na2-EDTA.2H20 37.3 mg/L。
【文檔編號】A01H4/00GK103651143SQ201310697008
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月18日 優先權日:2013年12月18日
【發明者】張艷萍, 趙瑋, 羅俊杰, 陳玉梁, 羅萬銀, 董治寶 申請人:甘肅省農業科學院生物技術研究所