一種楊梅快速繁殖的方法
【專利摘要】本發明公開了一種楊梅快速繁殖的方法，包括以下步驟：1)外植體的選取；2）外植體消毒；3)初始誘導培養；4)愈傷組織誘導；5）分化和增殖培養；6)生根培養。按上述方法繁殖楊梅既有效解決楊梅組織培養中外植體污染率高的問題，又可實現楊梅組培苗的大量快速繁殖。
【專利說明】一種楊梅快速繁殖的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物快速繁殖【技術領域】，尤其是楊梅快速繁殖【技術領域】。
【背景技術】
[0002]目前，楊梅多采用嫁接繁育來進行生產栽培，這繁育技術提高品種的純度，保持了品種特性，但成活率較低及繁殖速度較慢，制約了楊梅產業的發展。而組織培養育苗技術既可以保持種的純度和特性， 也可以降低生產成本，提高繁殖速度和成活率。楊梅的組織培養目前很少有人報道，究其原因主要還是由于楊梅外植體培養時，滅菌不易，愈傷組織誘導容易褐化，特別是葉片、莖等部位均含有多種次生代謝產物，抑制其分化及愈傷組織誘導，因此，組織培養很難取得成功。
[0003]中國專利ZL201010603448.4涉及到一種以芽苗途徑獲得楊梅再生植株的方法:以楊梅莖為外植體，誘導產生芽，在此基礎上伸長后誘導生根，但這一方法誘導周期長，繁
殖量小。
[0004]現有技術中尚無經愈傷組織途徑獲得楊梅再生植株的報道。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是提供一種楊梅快速繁殖的方法，經愈傷組織途徑獲得楊梅叢生芽，誘導生根，既有效解決楊梅組織培養中外植體污染率高的問題，又可實現楊梅組培苗的大量快速繁殖。
[0006]為了解決上述技術問題，本發明提出下列技術方案:
[0007]一種楊梅快速繁殖的方法，其特征在于所述的方法包括以下步驟:
[0008]1)外植體的選取:取當年生直徑2_5mm的楊梅枝條為外植體，剪去葉片后剪成2-3cm的莖段；
[0009]2)外植體消毒:將上述莖段放入盛有自來水的20-25KHZ超聲波清洗中保持溫度30-35°C處理30-45min，然后以自來水沖洗10_20min ;隨后在超凈工作臺上以70-75%的酒精消毒25-35秒，0.1%升汞溶液中處理5-7分鐘，然后以無菌水沖洗4_5遍，置于無菌培養皿備用；
[0010]3)初始誘導培養:將滅菌后外植體莖段各剪去2-3mm，莖段按末端向下插入初始誘導培養基中培養，培養條件為光強2500-3500LX、光周期10-14h/d，溫度25°C ±2°C ;培養4-6d后將其中未污染的外植體莖段轉接到新的初始誘導培養基中，并繼續培養12-18d至新芽長出；所述的初始誘導培養基組成為:WPM+6-BA0.1-0.2mg/L+NAA0.01-0.02mg/L+PVP5-10mg/L ；
[0011]4)愈傷組織誘導:取初始誘導培養中的芽，放入愈傷組織誘導培養基中培養15-20d,條件為暗培養，溫度20°C ±2°C ;所述愈傷組織培養基為:MS+6-BA0.5-2.0mg/L+NAA0.02-0.5mg/L+PVP5-10mg/L ；
[0012]5)分化和增殖培養:將透明無色的愈傷組織塊放入分化培養基中培養20-25d，增殖產生大量叢生苗，培養條件為光強1800-2500LX、光周期10_14h/d，溫度25°C ±2°C ;所述分化和增殖培養用培養基為:WPM+6-BA0.1-0.5mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L ；
[0013]6)生根培養:將5)步驟中的叢生苗切割成單個，轉移至生根培養基中培養15-20d后生根，培養條件為光強1800-2500LX、光周期10_14h/d，溫度25°C ±2°C ;所述生根用培養基為:1/2MS+IBA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L ；
[0014]7)煉苗和移栽:將有生根的楊梅幼苗的培養基瓶蓋打開，室溫下煉苗3-5d后，取出幼苗，洗去根部培養基，移栽裝有河沙基質的苗床上，保持溫度20-25°C，濕度85%-95%，適當遮蔭即可；
[0015]所述的WPM培養基配方為:大量元素:硝酸銨NH4N03400mg/L，硫酸鉀K2S04900mg/L，磷酸二氫鉀 KH2P03170mg/L，硫酸鎂 MgS04.7H20370mg/L ;鈣鹽:氯化鈣 CaCl2.2H2096mg/L ；四水合硝酸鈣Ca(N03)2.4H20556mg/L ;微量元素:硼酸H3B036.2mg/L,硫酸錳MnS04.4Η2022.5mg/L,硫酸鋅 ZnS04.7Η208.6mg/L,鑰酸鈉 Na2Mo04.2Η200.25mg/L,硫酸銅CuS04.5H200.25mg/L ;鐵鹽:乙二胺四乙酸二鈉Na2_EDTA37.3mg/L,硫酸亞鐵FeS04.7H2027.8mg/L ;有機酸:肌醇100mg/L,甘氨酸2mg/L,鹽酸硫胺素lmg/L,鹽酸吡口多醇 0.5mg/L,煙酸 0.5mg/L ；
[0016]所述的MS培養基配方為:大量元素:硝酸鉀KN031900mg/L，硝酸銨NH4N031650mg/L，磷酸二氫鉀 KH2P03170mg/L，硫酸鎂 MgS04 *7H20370mg/L ;鈣鹽:氯化鈣 CaCl2 *2H20440mg/L ;微量元素:碘化鉀 KI0.83mg/L,硼酸 H3B036.2mg/L,硫酸錳 MnS04.4H2022.3mg/L,硫酸鋅 ZnS04.7Η208.6mg/L,鑰酸鈉 Na2Mo04.2Η200.25mg/L,硫酸銅 CuS04.5Η200.025mg/L,氯化鈷CoCl2.6H200.025mg/L ;鐵鹽:乙二胺四乙酸二鈉Na2_EDTA37.25mg/L,硫酸亞鐵FeS04.7H2027.85mg/L ;有機酸:肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，鹽酸硫胺素0.5mg/L，鹽酸吡哆醇 0.5mg/L,煙酸 0.5mg/L ;蔗糖 30g/L,瓊脂粉 7g/L，pH 為 5.7 ;
[0017]所述的1/2MS培養基配方為:大量元素:硝酸鉀KN039 50mg/L，硝酸銨NH4N038 2 5mg/L，磷酸二氫鉀 KH2P0385mg/L，硫酸鎂 MgS04.7H20185mg/L ;鈣鹽:氯化鈣 CaCl2.2H20220mg/L ；
[0018]所述的6-BA為6-芐氨基嘌呤；
[0019]所述的NAA為α -萘乙酸；
[0020]所述的ΙΒΑ為吲哚-3- 丁酸；
[0021]所述的PVP為聚乙烯吡咯烷酮。
[0022]步驟3)中初始誘導培養基為:WPM+6-BA0.15mg/L+NAA0.015mg/L+PVP8mg/L。
[0023]步驟4)中愈傷組織培養基為:MS+6-BAl.5mg/L+NAA0.2mg/L+PVP8mg/L。
[0024]步驟5)中分化和增殖培養用培養基為:WPM+6-BA0.3mg/L+NAA0.2mg/L+PVP8mg/L0
[0025]步驟6)中生根用培養基為:1/2MS+IBA0.2mg/L+PVP8mg/L。
[0026]采用本發明繁殖楊梅，既有效解決楊梅組織培養中外植體污染率高的問題，又可實現楊梅組培苗的大量快速繁殖，為楊梅生產栽培和品種改良奠定基礎。
[0027]試驗表明，采用愈傷組織途徑所得楊梅試管苗的移栽成活率明顯高于采用芽苗途徑者，其效果可以通過下列試驗證明。
[0028]試驗1不同途徑所得試管苗的移栽成活率比較[0029]一、材料和方法
[0030]1、材料:
[0031 ] 愈傷組織苗(簡稱SM)，按實施例3制備；
[0032]芽苗(簡稱YM)，按下列方法制備:
[0033]1)外植體的選取:取當年生直徑2_5mm的楊梅枝條為外植體，剪去葉片后剪成2-3cm的莖段；
[0034]2)外植體消毒:將上述莖段放入盛有自來水的20KHZ超聲波清洗中保持溫度30-35°C處理30-45min，然后以自來水沖洗10_20min ;隨后在超凈工作臺上以70-75%的酒精消毒25-35秒，0.1%升汞溶液中處理5-7分鐘，然后以無菌水沖洗4-5遍，置于無菌培養皿備用；
[0035]3)初始誘導培養:將滅菌后外植體莖段各剪去2_3mm，莖段按末端向下插入初始誘導培養基中培養，培養條件為光強2500-3500LX、光周期10_14h/d，溫度25°C ±2°C ;培養4-6d后將其中未污染的外植體莖段轉接到新的初始誘導培養基中，并繼續培養12-18d至新芽長出；所述的初始誘導培養基組成為:WPM+6-BA0.lmg/L+NAA0.01mg/L+PVP5mg/L ；
[0036]4)新芽伸長培養:將長出新芽的外植體莖段剪去發黑端部后轉插入新芽伸長和增殖培養基中，培養條件為光強2500-3000LX、光周期12h/d，溫度25°C ±2°C ;培養21d后，新芽伸長到≥0.5cm。新芽伸長和增殖培養基組成為:WPM+6-BA0.5mg/L+NAA0.4mg/L+GA30.4mg/L+PVP800mg/Lo
[0037]5)增殖培養:將步驟4)新芽剪下并轉接到新芽伸長和增殖培養基中，培養條件為光強2500-3000LX、光周期12h/d，溫度25°C ±2°C ;培養30d后，至新芽長出并伸長到1cm以上。培養基組成同步驟4)。
[0038]6)生根培養:將步驟5)的新芽剪下，轉接到生根培養基中，培養條件為光強2500-3000LX、光周期12h/d，溫度25°C ±2°C ;培養20d后，生出新根。生根培養基的配方為 1/2MS+IBA0.1-0.5mg/L+PVP5_10mg/L。
[0039]2、方法
[0040]將有生根的楊梅幼苗的培養基瓶蓋打開，室溫下煉苗3-5d后，取出幼苗，洗去根部培養基，移栽裝有河沙基質的苗床上，保持溫度20-25°C，濕度85%-95%，適當遮蔭即可，2周后考察試管苗在苗床上的成活率。
[0041]愈傷組織苗(SM)、芽苗(YM)平行試驗；
[0042]共試驗三次。
[0043]3、結果
[0044]試驗結果見表1，結果表明，SM的存活率明顯高于YM。表明采用愈傷組織培養而得的試管苗比采用新芽培·養而得的試管苗更易被馴化。現有技術中，并沒有類似的啟示，本發明取得了預料不到的技術效果。
[0045]表1不同途徑所得試管苗的移栽成活率比較
[0046]
【權利要求】
1.一種楊梅快速繁殖的方法，其特征在于所述的方法包括以下步驟:1)外植體的選取:取當年生直徑2-5mm的楊梅枝條為外植體，剪去葉片后剪成2_3cm的莖段；2)外植體消毒:將上述莖段放入盛有自來水的20-25KHZ超聲波清洗中保持溫度30-35°C處理30-45min，然后以自來水沖洗10_20min ;隨后在超凈工作臺上以70-75%的酒精消毒25-35秒，0.1 %升汞溶液中處理5-7分鐘，然后以無菌水沖洗4_5遍，置于無菌培養皿備用；3)初始誘導培養:將滅菌后外植體莖段各剪去2-3mm，莖段按末端向下插入初始誘導培養基中培養，培養條件為光強2500-3500LX、光周期10_14h/d，溫度25°C ±2°C ;培養4-6d后將其中未污染的外植體莖段轉接到新的初始誘導培養基中，并繼續培養12-18d至新芽長出；所述的初始誘導培養基組成為:WPM+6-BA0.1-0.2mg/L+NAA0.01-0.02mg/L+PVP5-10mg/L ；4)愈傷組織誘導:取初始誘導培養中的芽，放入愈傷組織誘導培養基中培養15-20d，條件為暗培養，溫度20°C ±2°C ;所述愈傷組織培養基為:MS+6-BA0.5-2.0mg/L+NAA0.02-0.5mg/L+PVP5-10mg/L ；5)分化和增殖培養:將透明無色的愈傷組織塊放入分化培養基中培養20-25d，增殖產生大量叢生苗，培養條件為光強1800-2500LX、光周期10_14h/d，溫度25°C ±2°C ;所述分化和增殖培養用培養基為:WPM+6-BA0.1-0.5mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L ；6)生根培養:將5)步驟中的叢生苗切割成單個，轉移至生根培養基中培養15-20d后生根，培養條件為光強 1800-2500LX、光周期10_14h/d，溫度25°C ±2°C ;所述生根用培養基為:1/2MS+IBA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L ；7)煉苗和移栽:將有生根的楊梅幼苗的培養基瓶蓋打開，室溫下煉苗3-5d后，取出幼苗，洗去根部培養基，移栽裝有河沙基質的苗床上，保持溫度20-25°C，濕度85%-95%，適當遮蔭即可；所述的WPM培養基配方為:大量元素:硝酸銨NH4N03400mg/L，硫酸鉀K2S04900mg/L，磷酸二氫鉀 KH2P03170mg/L，硫酸鎂 MgS04.7H20370mg/L ;鈣鹽:氯化鈣 CaCl2.2H2096mg/L ；四水合硝酸鈣Ca(N03)2.4H20556mg/L ;微量元素:硼酸H3B036.2mg/L,硫酸錳MnS04.4Η2022.5mg/L,硫酸鋅 ZnS04.7Η208.6mg/L,鑰酸鈉 Na2Mo04.2Η200.25mg/L,硫酸銅CuS04.5H200.25mg/L ;鐵鹽:乙二胺四乙酸二鈉Na2_EDTA37.3mg/L,硫酸亞鐵FeS04.7H2027.8mg/L ;有機酸:肌醇100mg/L,甘氨酸2mg/L,鹽酸硫胺素lmg/L,鹽酸吡口多醇 0.5mg/L,煙酸 0.5mg/L ；所述的MS培養基配方為:大量元素:硝酸鉀KN031900mg/L，硝酸銨NH4N031650mg/L，磷酸二氫鉀 KH2P03170mg/L，硫酸鎂 MgS04.7H20370mg/L ;鈣鹽:氯化鈣 CaCl2.2H20440mg/L ;微量元素:碘化鉀 KI0.83mg/L,硼酸 H3B036.2mg/L,硫酸錳 MnS04.4H2022.3mg/L,硫酸鋅 ZnS04.7Η208.6mg/L,鑰酸鈉 Na2Mo04.2Η200.25mg/L,硫酸銅 CuS04.5Η200.025mg/L,氯化鈷CoCl2.6H200.025mg/L ;鐵鹽:乙二胺四乙酸二鈉Na2_EDTA37.25mg/L,硫酸亞鐵FeS04.7H2027.85mg/L ;有機酸:肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，鹽酸硫胺素0.5mg/L，鹽酸吡哆醇 0.5mg/L,煙酸 0.5mg/L ;蔗糖 30g/L,瓊脂粉 7g/L，pH 為 5.7 ;所述的1/2MS培養基配方為:大量元素:硝酸鉀KN039 50mg/L，硝酸銨NH4N038 2 5mg/L，磷酸二氫鉀KH2P0385mg/L，硫酸鎂MgS04.7H20185mg/L ;余同上述MS培養基；所述的6-BA為6-芐氨基嘌呤；所述的NAA為α -萘乙酸；所述的ΙΒΑ為吲哚-3-丁酸；所述的PVP為聚乙烯吡咯烷酮。
2.根據權利要求1所述一種楊梅快速繁殖的方法，其特征在于所述步驟3)中初始誘導培養基組成為:WPM+6-BA0.15mg/L+NAA0.015mg/L+PVP8mg/L。
3.根據權利要求1所述一種楊梅快速繁殖的方法，其特征在于所述步驟4)中愈傷組織培養基為:M S+6-BAl.5mg/L+NAA0.2mg/L+PVP8mg/L。
4.根據權利要求1所述一種楊梅快速繁殖的方法，其特征在于所述步驟5)中分化和增殖培養用培養基為:WPM+6-BA0.3mg/L+NAA0.2mg/L+PVP8mg/L。
5.根據權利要求1所述一種楊梅快速繁殖的方法，其特征在于所述步驟6)中生根用培養基為:1/2MS+IBA0.2mg/L+PVP8mg/L0
【文檔編號】A01G17/00GK103651144SQ201310711176
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月20日 優先權日:2013年12月20日
【發明者】姜波, 沈宗根, 呂洪飛, 郁達 申請人:常熟理工學院