地喹氯銨作為鼠類的生育控制藥物的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種地喹氯銨作為鼠類的生育控制藥物的應用，經研究發現CTBS是嚙齒類動物精子上特有的精卵結合受體，其抑制劑地喹氯銨可以有效地抑制小鼠的體外受精，其半抑制常數＜100nM，對人體的毒性作用甚微；經研究還發現CTBS在嚙齒類動物的精子上表達，且CTBS抗體可以抑制小鼠的體外授精，而在人的精子上并不表達這一蛋白。本發明采用地喹氯銨作為鼠類的生育控制藥物進行使用，能有效的控制嚙齒類動物的精卵結合，達到控制鼠類的種群數量，實現無需農藥即可控制鼠害目的，且其天敵食用該藥物卻不會產生危害。
【專利說明】地喹氯銨作為鼠類的生育控制藥物的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種嚙齒類的生育控制藥物，特別涉及一種地喹氯銨作為鼠類的生育控制藥物的應用。
【背景技術】
[0002]地喹氯銨(Dequaliniumchloride, CAS#522_51_0)，作為一種 PKC 抑制劑作為抗癌藥物進行使用，其IC50為7-18 μ M，同時它也是一種選擇性蜂毒明肽敏感型鉀離子通道阻斷劑，其IC50為1.1μΜ[1’2’3’4]。最近，發現地喹氯銨還可在納摩爾水平上抑制微生物來源的幾丁質水解酶的活性[5]。地喹氯銨對人體的毒性甚微，不影響人類的生殖，對眼和皮膚有刺激作用。對小鼠的致死量為:口服150-1000mg / kg體重，皮下注射70mg / kg體重，靜脈注射1.9mg / kg體重；對兔子和狗的口服致死量為500mg / kg體重(MSDS)。
[0003]而二 -N-乙酰殼二糖酶，即D1-N-acetylchitobiase (簡稱CTBS)是幾丁質水解酶的一種，在哺乳動物中，只在嚙齒類和人類體內的肝臟有表達[6’7’8]。
[0004]物種的生殖隔離是一種普遍的自然現象，卵子透明帶上的碳水化合物與精子上蛋白質的相互作用是其中的機制之一。有報道表明，路易斯寡糖X(即Lewis X)能結合到小鼠精子，并可特異地抑制小鼠的體外受精，提示其精子上識別Lewis X的蛋白可能參與了小鼠的生育隔離[9]，但僅是一種猜測。
[0005]鼠害是指鼠類對農 業等生產造成的危害。鼠類屬哺乳綱(Mam-malia)嚙齒目(Rodentia)動物，共有1600多種。鼠類繁殖次數多，孕期短，產仔率高，性成熟快，數量能在短期內急劇增加；它的適應性很強，除南極大陸外，在世界各地的地面、地下、樹上、水中都能生存，不論平原、高山、森林、草原以至沙漠地區都有其蹤跡，常對農業等生產釀成巨大災害。
[0006]因此急需提供一種能控制鼠類生育的藥物，尤其是抑制鼠類的精卵結合的藥物，并且該藥物能在野外抑制鼠害且其天敵食用無害，無需采用農藥對鼠害進行抑制。
[0007]本發明參考文獻如下:
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【發明內容】
[0019]本發明的目的在于提供一種能控制鼠類生育的藥物的應用，尤其是提供一種能抑制鼠類的精卵結合的藥物地喹氯銨的應用，該藥物可用于控制鼠類的種群數量，從而達到無需采用農藥即可控制鼠害的效果，并且鼠類的天敵食用該藥物無害。
[0020]為了實現上述目的，本發明采用如下的技術方案:
[0021]地喹氯銨作為鼠類的生育控制藥物的應用，用于控制鼠類的種群數量，從而達到控制鼠害的目的。
[0022]進一步的，所述鼠類的生育控制為采用抑制劑地喹氯銨抑制鼠類的精卵結合。
[0023]進一步的，所述鼠類的精卵結合中精子上特異性表達的受體蛋白為二 -N-乙酰殼二糖酶，即D1-N-acetylchitobiase,簡稱為CTBS ;經研究發現,所述地喹氯銨是所述鼠類的精卵結合中精子上特異性表達的受體蛋白CTBS抑制劑，CTBS是鼠類的精卵結合中必不可少的蛋白，因此將地喹氯銨做為鼠類特異的生育控制藥物應用。
[0024]我們經研究發現CTBS是嚙齒類動物精子上特有的精卵結合受體，其抑制劑地喹氯銨可以有效地抑制小鼠的體外受精，對人體的毒性作用甚微。
[0025]我們經研究發現CTBS僅在嚙齒類動物的精子上表達，并且CTBS抗體可以抑制小鼠的體外授精，而在人的精子上并不表達這一蛋白。
[0026]本發明所述抑制劑地喹氯銨與CTBS結合的親和力強，抑制鼠類的精卵結合的活性高，實驗表明其抑制 精卵結合的半抑制常數< IOOnM ;進一步的，其半抑制常數是50nM，因此，可以將地喹氯銨作為鼠類的生育控制藥物進行使用，并且地喹氯銨可以抑制小鼠的體外受精，所以地喹氯銨可用于控制鼠類的種群數量，從而達到控制鼠害的目的。
[0027]本發明采用地喹氯銨作為鼠類的生育控制藥物進行使用，能有效的控制嚙齒類動物的精卵結合，達到控制鼠類的種群數量，實現無需農藥即可控制鼠害目的，且其天敵食用該藥物卻不會產生危害。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1為地喹氯銨對小鼠體外受精的抑制圖。
[0029]圖2A為Lewis X受體的鑒定思路圖。
[0030]圖2B為利用Lewis X探針找到的小鼠精子蛋白圖。
[0031]圖2C為蛋白的質譜分析圖譜。
[0032]圖3為CTBS的抗體抑制Lewis X結合到小鼠精子的圖片。
[0033]圖4為Lewis X在小鼠精子上的結合位置與CTBS在小鼠精子的定位結果圖片。
[0034]圖5A為重組的人源CTBS與小鼠卵子透明帶發生相互作用的示意圖。
[0035]圖5B為重組的人源CTBS與小鼠卵子透明帶發生相互作用的明場和熒光照片。
[0036]圖5C為CTBS抗體的乳膠顆粒富集到的RFP或RFP-CTBS蛋白免疫印跡分析。
[0037]圖6為CTBS抗體對小鼠精子頂體反應的誘導效應圖。
[0038]圖7為不同濃度的CTBS抗體抑制小鼠的體外受精圖。
[0039]圖8為小鼠、大鼠和人精子裂解液的蛋白印記分析圖。【具體實施方式】
[0040]以下由特定的具體實施例說明本發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點及功效。
[0041]實施例1:地喹氯銨作為鼠類的生育控制藥物的應用
[0042]CTBS不同濃度的每個劑量實驗用小鼠卵>50個，重復3次，每個劑量總計用卵>150個，其實驗結果如圖1所示，其半抑制常數在50nM，表明地喹氯銨可以很好的抑制小鼠的體外受精。
[0043]實施例2:
[0044]我們經實驗發現CTBS在嚙齒類動物的精子上表達，并且CTBS抗體可以抑制小鼠的體外授精，而在人的精子上并不表達這一蛋白。其實驗方法如下:
[0045](一)小鼠精子上CTBS的發現:
[0046]利用路易斯寡糖X(即Lewis X，簡寫為LeX)探針鑒定到了小鼠精子上的CTBS，并證明CTBS能結合到小鼠的卵子透明帶。
[0047](I)首先對Lewis X受體進行鑒定,其鑒定流程如圖2A所示,包括能識別LewisX的類凝集素蛋白的鑒定流程和內源性的含有Lewis X修飾的蛋白鑒定流程。其原理是將牛血清白蛋白(BSA)表面修飾Lewis X制成擬糖蛋白LeX-BSA，并將該擬糖蛋白進一步修飾上紫 外交聯試劑[6-(生物素酰氨基)-2-(p-疊氮苯甲酰氨基)己酰氨基]乙基-1, 3 ' - 二硫代丙酸磺基琥拍酰亞胺酯(Sulfo-NHS-2-(6-[biotinamido]-2-(p_azido benzamido)-hexanoamido) ethyl-1, 3 1 -dithiopropionate,簡稱 Sulfo-SBED)作為LewisX探針。該探針經紫外交聯到小鼠精子后形成Lewi s X探針-受體復合物，利用能識別Lewis X的四棱蓮凝集素(Lotus tetragonolobus agglutinin,簡稱LTA)樹脂來分離純化精子細胞裂解液中的Lewis X探針-受體復合物。由于小鼠精子內可能含有內源性LewisX修飾的蚩白，設置了內源性的含有Lewis X修飾的蛋白鑒定流程作為對照來區分這類蚩白(對照組)。一般來說，兩個流程鑒定到的差異蛋白即有可能是Lewis X的受體蛋白。
[0048](2)利用Lewis X探針找到的小鼠精子上的蛋白:
[0049]利用Lewis X探針找到小鼠精子蛋白，如圖2B所示。將圖2B中的差異條帶1、2、
3、4取下，用于蛋白的質譜鑒定，如圖2C所示的質譜分析圖，經分析，有可能與碳水化合物作用的蛋白身份如表1所示。
[0050]表1
[0051]
【權利要求】
1.地喹氯銨作為鼠類的生育控制藥物的應用。
2.如權利要求1所述的地喹氯銨作為鼠類的生育控制藥物的應用，其特征在于，所述鼠類的生育控制為采用抑制劑地喹氯銨抑制鼠類的精卵結合。
3.如權利要求2所述的地喹氯銨作為鼠類的生育控制藥物的應用，其特征在于，所述鼠類的精卵結合中精子上特異性表達的受體蛋白為CTBS ;所述地喹氯銨是所述鼠類的精卵結合中精子上特異性表達的受體蛋白CTBS的抑制劑。
4.如權利要求3所述的地喹氯銨作為鼠類的生育控制藥物的應用，其特征在于，所述抑制劑地喹氯銨抑制鼠類精卵結合的半抑制常數< ΙΟΟηΜ。
【文檔編號】A01N43/42GK103749457SQ201310739915
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月27日 優先權日:2013年12月27日
【發明者】顧一驊, 徐文平, 施惠娟, 楊軍 申請人:上海市計劃生育科學研究所, 華東理工大學