一種綠色微生態復合肥的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種綠色微生態復合肥，綠色微生態復合肥組成為：黑曲霉培養物，膠質芽抱桿菌菌劑，解磷巨大芽抱桿菌菌劑，枯草芽孢桿菌培養物，泡盛曲霉培養物，植物乳桿菌劑。本發明的肥料營養豐富，有機質含量高。能夠滿足有機食品的生產需要。本發明的肥料由復合微生物發酵而成，能夠改善土壤的微生態環境，為農作物的生長提供有益條件。
【專利說明】—種綠色微生態復合肥
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種綠色微生態復合肥，屬于農用肥料【技術領域】。
【背景技術】 [0002]微生物肥是一種以微生物生命活動及其產物導致農作物得到特定肥料效應的微生物活體制品，它在培肥地力、提高化肥利用率、抑制農作物對重金屬及農藥等有害物質的吸收、凈化和修復土壤、促進農作物秸桿和城市垃圾的腐熟利用、提高農產品品質等方面有著不可替代的作用。微生物肥料的功效發揮主要是通過對傳統化肥、有機肥的增效作用，對土壤的改良活化作用，以及微生物的生理作用等方式來實現的。因此，微生物肥料就有了化肥、有機肥、有益生物菌的多種肥力和功效，是活化肥料養分、提高肥料效果、改良作物品質、促進農業增產增效的理想肥料。微生物肥料是活體肥料，它的作用主要靠它含有的大量有益微生物的生命活動來完成。只有當這些有益微生物的生命活動來完成。只有當這些有益微生物處于旺盛的繁殖和新陳代謝的情況下，物質轉化和有益代謝產物才能不斷形成。因此，微生物肥料中有益微生物的種類、生命活動是否旺盛是其有效性的基礎，而不像其它肥料是以氮、磷、鉀等主要元素的形式和多少為基礎。正因為微生物肥料是活制劑，所以其肥效與活菌數量、強度及周圍環境條件密切相關，包括溫度、水分、酸堿度、營養條件及原生活在土壤中土著微生物排斥作用都有一定影響。
[0003]由于我國長期在微生物肥料方面研究缺乏投入，使得我國的微生物肥料產業依然存在整體水平不高、技術創新不足、產品質量與應用效果表現欠穩定的問題。在農業可持續發展已成為人類共識的今天，這些問題成了微生物肥行業函待打通的“瓶頸”。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種綠色微生態復合肥:
[0005]重量份數組成為:黑曲霉培養物5-10份，膠質芽抱桿菌菌劑3-8份，解磷巨大芽抱桿菌菌劑3-8份，枯草芽孢桿菌培養物5-12，泡盛曲霉培養物4-7，植物乳桿菌劑2-4份。
[0006]黑曲霉(Aspergillusniger) L1-2013-03 保藏號為 CGMCC N0.7927。
[0007]所述枯草芽孢桿菌培養物制備:從斜面轉接培養枯草芽孢桿菌，逐級擴培后的種子液轉接入發酵罐中，發酵完畢發酵液經過板框過濾、干燥后獲得枯草芽孢桿菌培養物。
[0008]植物乳桿菌劑的制備方法:從斜面轉接培養植物乳桿菌，逐級擴培后的種子液轉接入發酵罐中，發酵完畢發酵液經低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液。添加載體:向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液與載體的重量比為0.5-0.6:1，載體組成為:CaC0320-30份，糊精10-15份。流化床干燥，干燥溫度50°C。
[0009]泡盛曲霉培養物制備:菌種培養，固體發酵培養:孢子液接種到米曲霉固態發酵培養料中，26-33 °C培養至菌絲長滿培養料，低溫流化床干燥，粉碎干燥物。
[0010]黑曲霉培養物制備:菌種培養，采用常見固體發酵培養方法制備:孢子液接種到固態發酵培養料中，26-33 °C培養至菌絲長滿培養料，干燥，粉碎干燥物。
[0011]河北保定瑞谷生物科技有限公司提供膠質芽孢桿菌菌粉；
[0012]有益效果
[0013]本發明的肥料能夠增強作物的抗旱能力。本發明的復合菌種中的膠質芽抱桿菌能分泌生長素物質和赤霉素物質等促生長物質，增根壯苗；分解土壤里硅元素供植物利用，使得植物的蠟質層增厚，提高植物保水能力；能促進土壤團粒結構形成，防止土壤板結；破壞土壤毛細現象，防止土壤水分蒸發。
[0014]本發明的肥料由復合微生物發酵而成，能夠改善土壤的微生態環境，為農作物的生長提供有益條件。本發明的肥料能夠改良土壤。肥料中有益微生物能產生糖類物質，占土壤有機質的0.1%，與植物粘液，礦物胚體和有機膠體結合在一起，可以改善土壤團粒結構，增強土壤的物理性能和減少土壤顆粒的損失，在一定的條件下，還能參與腐殖質形成。所以施用微生物肥料能改善土壤物理性狀，有利于提高土壤肥力。
[0015]本產品使用方法簡單，每畝地使用量0.3-1公斤，成本僅為80-100元/畝，拌種或生長期灌水前地表噴灑。 【具體實施方式】
[0016]下面通過具體的實施方案敘述本發明。除非特別說明，本發明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的范圍，本發明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發明的保護范圍。
[0017]本發明提供的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)L1-2013_03是由實驗室保藏的一株產纖維素酶產的黑曲霉(Aspergillus niger)L1-2010經多輪亞硝基胍誘變，然后對突變株逐級篩選淘汰，最后對優良菌株經發酵性能測試篩選得到產高活力纖維素酶的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)L1-2013-03。
[0018]本發明提供的產高活力纖維素酶的菌株具體為黑曲霉(Aspergillus niger)L1-2013-03。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110:，地址為:中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號，郵編100101)，保藏號為 CGMCC N0.7927。
[0019]產高活力纖維素酶菌株的篩選方法，包括以下步驟:
[0020]I)斜面培養:將原始黑曲霉菌株(Aspergillus niger)L1-2010劃線接種斜面培養基，30°C培養2~3d，直至菌絲體成熟、產大量黑色孢子。所述斜面培養基組成如下:120Brix 麥芽汁 1000mL, pH 值自然，121°C滅菌 20min ；
[0021]2)孢子懸液制備(以下步驟均在無菌條件下操作):向試管斜面加入15mL無菌水，把孢子刮下，用濾紙過濾，將濾過液倒入已滅菌、并加有5-10粒無菌玻璃珠的150mL三角瓶中，將三角瓶放入搖床振蕩10-15min，使孢子分散。
[0022]3)亞硝基胍(NTG )誘變
[0023]A.用無菌水將孢子懸浮液調節為稀釋成106-107個/mL。
[0024]B.取IOmL菌懸液轉移至IOOmL三角瓶中，加入IOmg的NTG,配制成終濃度為IOmg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0025]C.在30°C下200rpm振蕩反應30min, 5000rpm離心IOmin收集菌體,用無菌生理
鹽水洗滌數次，中止反應。
[0026]D.適當稀釋將孢子濃度調節為103個/mL，取最后稀釋度的菌液0.2mL,稀釋涂布于纖維素-剛果紅平板篩選培養基上。在30°C培養2~3天后挑取透明圈/菌落直徑較大的菌株200支。(所述纖維素-剛果紅平板篩選培養基組成如下:纖維素粉10g、剛果紅
0.2g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、明膠2g、瓊脂20g、自來水定容1000mL, pH 值 5-6，121°C滅菌 20min)。
[0027]E.復篩:將獲得的200株菌分別用無菌牙簽接種于斜面培養基，30°C培養至孢子鋪滿斜面。分別將孢子以無菌水洗下接種于裝有50mL復篩培養基的250mL三角瓶中進行發酵，接種量10%( v/v)，30°C、100r/min培養96h，分別測定各菌株的纖維素酶活性。(所述復篩培養基組成如下:纖維素粉50g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、自來水定容1000mL，pH值5-6，121°C滅菌20min)。選取纖維素酶酶活力最高的菌株進行放大實驗。
[0028]4)遺傳穩定性試驗
[0029]將L1-2013-03菌株在斜面上連續十次傳代，并用搖瓶復篩的方法檢測每次傳代后的發酵情況。實驗發現，在斜面上連續十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標都正常，說明該菌種的遺傳穩定性較強。
[0030]5)放大試驗
[0031](I)種子培養:將纖維素酶酶活力最高的菌株Aspergillus niger L1-2013-03接入500mL三角瓶中，種子培養基裝量100`毫升，30°C、150rpm搖床培養72_96h。
[0032](2)種子罐培養:將種子液以10% (v/v)接種量接入裝有7.5L發酵液的IOL發酵罐中，控制pH值恒定為6.0 ± 0.2，培養溫度30 ± 0.1°C，攪拌速度300rpm，通風量(v/v )1:0.8-1.2，培養時間96h，溶解氧20-30%。所述發酵培養基組成為:纖維素粉100g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、自來水定容lOOOmL，pH值5-6，121°C滅菌20mino
[0033]發酵結束后，取發酵上清液(粗酶液)進行酶活力檢測經測定，菌株Aspergillusniger L1-2013-03的外切β-葡聚糖酶、內切β _葡聚糖酶、β _葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達到 620U/mL、1289U/mL、456U/mL 和 732U/mL,分別比出發菌株 Aspergillus nigerL1-2010 提高了 9.21 倍、7.43 倍、8.15 倍和 10.31 倍。
[0034]解磷巨大芽抱桿菌是芽抱桿菌屬(Baci I Ius )中的一個種。運動，形成莢膜，好氧。從葡萄糖產酸，也常從阿拉伯糖和甘露醇產酸。水解淀粉，不產生卵磷脂酶，VP陰性。能分解土壤中的有機磷成為植物可利用的速效磷。
[0035]解磷巨大芽孢桿菌劑由滄州旺發生物技術研究所提供，地址:中國河北滄州市運河區解放西路頤和國際商務中心A座I區807-812。
[0036]河北保定瑞谷生物科技有限公司提供膠質芽孢桿菌菌粉。
[0037]本發明提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)L1-2013_02。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCC N0.7926。[0038]所述菌株特點如下:
[0039]所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，邊緣整齊，為具有運動性的好氧菌。鏡檢為長桿狀，革蘭氏染色呈陽性。該菌可利用檸檬酸鹽，硝酸還原、V-P實驗成陽性。
[0040]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)L1-2013_02由一株保藏于本實驗室的產耐高溫α -淀粉酶的枯草芽孢桿菌L1-2013經紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變篩選獲得，具體篩選步驟如下: [0041](I)菌懸液的制備
[0042]將在平板劃線分離后長出的L1-2013單菌落接入種子培養基中，100r/min，40°C培養12h后,取ImL培養液離心后用生理鹽水洗漆兩次,并重懸與9mL生理鹽水中。
[0043](2)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變
[0044]將菌懸液置于無菌平板中，在距離為30cm，功率15w的紫外燈下攪拌照射100s。將經過照射的菌液經梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板，并以未經紫外照射的菌液稀釋涂平板做對照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報紙包好，置40°C培養48h，在長出菌落的平板上篩選出水解圈與菌落直徑比值最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經梯度稀釋后與硫酸二乙酯原液充分混合，并于40°C震蕩處理40min，將處理過的菌液經梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板。
[0045](3)高產菌種的初篩
[0046]將上述涂布均勻的平板，置40°C培養48h，在長出菌落的平板上初篩出水解圈與菌落直徑比值較大者挑至斜面保存，純化后獲得三株菌L1-2013-01，L1-2013-02，L1-2013-03
[0047](4)搖瓶發酵復篩
[0048]將獲得的三株菌L1-2013-01，L1-2013-02, L1-2013-03在含有30mL發酵培養基的250mL搖瓶中進行搖瓶發酵，種子接種量10% (V/V)，40°C、100r/min培養72h，離心取發酵上清液制得粗酶液。
[0049](5)酶活測定
[0050]酶活單位的定義:ImL粗酶液,于105°C、pH4.2條件下，Imin液化Img可溶性淀粉，即為I個酶活力單位，以U/mL表示。
[0051]經測定，菌株L1-2013-02，為穩定的最高產菌株，且酶活達到30000U/mL，比原始菌株酶活提高1.6倍。
[0052]所述氯化鋰平板:淀粉1%，蛋白胨 1%，(NH)2SO40.4%, K2HPO40.8%, CaCl20.2%，氯化鋰0.9%，瓊脂2%。
[0053]所述的種子培養基:酵母粉0.5%，蛋白胨I %，可溶性淀粉I %，NaCl I %。
[0054]所述的發酵培養基:玉米粉5%~15%，豆餅粉4%~10%，(NH) 2S040.4 %,K2HP040.8%, CaC120.2%?
[0055]所述的搖瓶培養條件:該菌在含有30mL發酵培養基的250mL搖瓶中，接種量10%(V/V)，100r/min、40°C 發酵培養 72h。
[0056]由菌株L1-2013-02發酵獲得了一種耐高溫的α -淀粉酶，其酶學性質如下:
[0057](I)該酶溫度適應范圍較寬，最適作用溫度在105_115°C之間，且在110°C以下保存的溫度穩定性較好，而115°C以上保存長時間溫度穩定性較差。[0058](2)該酶最適反應pH值為4.2。在pH值3.0_7.0之間均有較高酶活力，在pH值為3.0時酶活完全穩定。
[0059](3)酶活性:由本發明所提供的突變株L1-2013-02，制備的耐高溫α -淀粉酶酶活力為 30000-35000U/ml。
[0060]1、本發明使用紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變的方法獲得了一株高產耐高溫α -淀粉酶的枯草芽孢桿菌L1-2013-02，該菌株具有強耐酸、耐熱性，產酶活力高的特點。
[0061]2、有該菌株生產所得的耐高溫α-淀粉酶酶活力高達30000-35000u/ml，；適用溫度范圍為25-115°C，最適反應溫度110°C，在110°C酶活完全穩定；適用反應pH值范圍為
3.0-7.0，在pH值為3.0時酶活完全穩定，最適反應pH值為4.2，比現有的耐高溫α -淀粉酶酶活力高，酶作用最適PH值范圍寬泛，耐溫度高，特別適合反應溫度高、液化工藝與糖化工藝并存的工業化需求。
[0062]實施例1
[0063]提供一種綠色微生態復合肥:重量份數組成為:黑曲霉培養物6份，膠質芽抱桿菌菌劑5份，解磷巨大芽抱桿菌菌劑5份，枯草芽孢桿菌培養物10，泡盛曲霉培養物6，植物乳桿菌劑3份。
[0064]采用的菌種如 下:
[0065]枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis subsp) CGMCC7926
[0066]植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) CICC20764
[0067]泡盛曲霉(Aspergillusawamori) CGMCC3.6484
[0068]黑曲霉(Aspergillusniger) L1-2013-03 保藏號為 CGMCC N0.7927。
[0069]泡盛曲霉菌劑的制備方法:
[0070]技術方案如下:
[0071]斜面菌種活化培養:將泡盛曲霉斜面菌種轉接到斜面培養基上，27°C培養3天。
[0072]固體一級種子培養:挑取泡盛曲霉斜面菌種接入裝有100克培養基的500毫升三角瓶中進行種子培養，30°C培養3天即可。
[0073]固體二級種子培養:將上述培養好的固體一級種子攪拌為碎塊后加入裝有1000克培養基的5000毫升三角瓶中進行種子培養，培養條件:30°C培養3天即可。
[0074]固體發酵培養:將二級搖瓶種子粉碎，加入裝有滅菌培養基的發酵池或托盤中混合均勻后培養，曲料培養溫度控制在26-35°C，濕度80-90%，每隔10小時翻料一次，培養時間5-7天；固體曲料的培養采用常用曲料培養技術；待培養料長滿菌絲即可結束培養，培養基預先經高溫蒸煮滅菌處理，滅菌條件控制溫度121°C，時間I小時。
[0075]干燥粉碎:發酵結束培養料在流化床或其他干燥設備上進行干燥，干燥溫度控制在60°C，干燥到水分含量在10%以下，然后將固體培養料進行粉碎，物料粉碎孔徑在60目以上。
[0076]培養基組成:固體原料:麩皮80%，豆餅粉10%，玉米淀粉10%，添加等量自來水；初始PH自然。
[0077]枯草芽孢桿菌培養物的制備方法:
[0078]1.發酵液的獲得:采用斜面菌種逐級擴培獲得枯草芽孢桿菌發酵液；[0079](I) 一級種子培養:將枯草芽孢桿菌斜面菌種接入500毫升搖瓶中，培養基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養溫度30°C，培養時間24小時；
[0080](2)二級種子培養:將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養條件與一級種子相同；
[0081](3)三級種子培養:將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養溫度30°C，培養時間24小時；
[0082](4) 一級種子罐培養:將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發酵培養基裝量100L，培養溫度28°C，攪拌速度100轉/分，通風量(V/V) 1:0.5,罐壓
0.05Mpa,培養時間24小時；
[0083](5)發酵培養:將一級種子罐菌種以10%接種量接入總容積為1.5噸二級種子罐，發酵培養基裝量I噸，培養條件培養溫度28°C，攪拌速度100轉/分，通風量(V/V) 1:0.5，罐壓0.05Mpa,培養時間24小時。
[0084]培養基組成:葡萄糖6%，酵母提取物1%,蛋白胨0.2%，CaC031%, pH6.8。
[0085]植物乳桿菌劑的制備方法:
[0086](I)一級種子培養:將植物乳桿菌菌種接入500毫升搖瓶中，培養基裝量100毫升，培養溫度30°C，培養時間24小時；
[0087](2)二級種子培養:將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養條件與一級種子相同；
[0088](3)三級種子培養:將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養基裝量1000毫升，培養溫度30°C，培養時間24小時；
[0089](4)一級種子罐培養:將三級種子以5%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發酵培養基裝量100L，培養溫度30°C，罐壓0.05Mpa,培養時間18小時；
[0090](5)發酵罐培養:將一級種子罐菌種以5%接種量接入總容積為3噸二級種子罐，發酵培養基裝量2噸，培養條件培養溫度30°C，罐壓0.05Mpa,培養時間22小時。發酵完畢發酵液經低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液。添加載體:向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液與載體的重量比為0.5:1，載體組成為:CaC0325份，糊精12份。流化床干燥，干燥溫度50°C。
[0091]培養基組成為:酪蛋白胨1%，牛肉提取物1%，酵母提取物0.5%,葡萄糖0.5%,乙酸鈉 0.5%,檸檬酸二胺 0.2%, Tween800.1%, K2HP040.2%, MgS04.7H200.02%, MnS04.H200.005%, CaC032%,瓊脂 1.5%, ρΗ6.8。
[0092]實施例2
[0093]基本同實施例1
[0094]提供一種綠色微生態復合肥:重量份數組成為:黑曲霉培養物5份，膠質芽抱桿菌菌劑7份，解磷巨大芽抱桿菌菌劑6份，枯草芽孢桿菌培養物12，泡盛曲霉培養物6，植物乳桿菌劑2份。
[0095] 產品效果實驗
[0096]試驗地的選擇與試驗設計:試驗于2009年3月20日一9月30日在寧夏鹽池縣花馬池鎮八堡村進行。
[0097]試驗田達到田種植玉米10畝,分別在種植時使用本發明產品每畝0.7公斤，出苗I個月左右通過鋤地松土方式使用發明產品0.6公斤，對照組使用常規肥料。
[0098] 發明產品使用玉米地玉米產量達到650公斤，對照組達到510公斤；該地塊在第2年種植春小麥，春小麥產量達到了 400公斤，比對照組單產提高了 20%。且試驗田土壤結構良好，無大塊和板結。`
【權利要求】
1.一種綠色微生態復合肥，重量份數組成為:黑曲霉培養物5-10份，膠質芽抱桿菌菌劑3-8份，解磷巨大芽抱桿菌菌劑3-8份，枯草芽孢桿菌培養物5-12，泡盛曲霉培養物4-7，植物乳桿菌劑2-4份；黑曲霉(Aspergillus niger)保藏號為CGMCC N0.7927。
2.根據權利要求1所述綠色微生態復合肥，所述枯草芽孢桿菌培養物制備:從斜面轉接培養枯草芽孢桿菌，逐級擴培后的種子液轉接入發酵罐中，發酵完畢發酵液經過板框過濾、干燥后獲得枯草芽孢桿菌培養物。
3.根據權利要求1所述綠色微生態復合肥，所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilissubsp)為 CGMCC7926。
4.根據權利要求1所述綠色微生態復合肥，所述綠色微生態復合肥重量份數組成為:黑曲霉培養物6份，膠質芽抱桿菌菌劑5份，解磷巨大芽抱桿菌菌劑5份，枯草芽孢桿菌培養物10，泡盛曲霉培養物6，植物乳桿菌劑3份。
5.根據權利要求1所述綠色微生態復合肥，所述綠色微生態復合肥重量份數組成為:黑曲霉培養物5份，膠質芽抱桿菌菌劑7份，解磷巨大芽抱桿菌菌劑6份，枯草芽孢桿菌培養物12，泡盛曲霉培養 物6，植物乳桿菌劑2份。
【文檔編號】C05F11/08GK103739321SQ201310743690
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月30日 優先權日:2013年12月30日
【發明者】邵素英, 孔日祥 申請人:邵素英