一種煙草立枯病人工發病的快捷方法
【專利摘要】本發明公開了一種煙草立枯病人工發病的快捷方法，該方法的步驟如下：1.煙草幼苗培育準備；2.接種菌絲體的準備；3.煙草幼苗接種前處置；4.接種立枯病菌；5.接種后處置。本發明的優點是：1）接種技術體系微型化，使用微小的幼苗，在很小的空間內接種發病，耗用很短的試驗周期。2）實施過程簡單，操作方便效率高。3）全程在普通實驗室內完成，發病局部條件容易控制，受干擾小，容易實現技術方法標準化。
【專利說明】一種煙草立枯病人工發病的快捷方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及農業技術和生物技術。具體是一種煙草立枯病人工發病的快捷方法。【背景技術】
[0002]由病原真菌Rhizoctonia solani侵染引起的煙草立枯病是煙草生產的重要病害之一，主要在苗期發病，引起死苗，嚴重時造成一些田塊大量缺苗，近年在煙草成株期也常見發生，特別是一些高產栽培區，往往出現較高的發病率，由于在成株期該病害主要引起煙草植株的莖基部壞死，從而導致整株受害，造成較大的損失，這已成了生產上面臨的重要問題，要解決這個問題，仍然有賴于加強煙草立枯病的基礎研究，而人工發病又是該病害有關研究的基礎手段之一。由于長期以來對該病害的研究薄弱，至今還未形成規范和成熟的人工發病方法。雖然該病害主要危害煙株莖基部，但發明人發現，立枯病菌也可以侵染煙草上部葉片引起清晰的壞死病斑，這個致病特性可在人工接種發病中加以利用，而至今未發現將煙草立枯病菌能侵染葉片致病的有利特性，在人工發病實踐中加以應用并建立配套技術。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種煙草立枯病人工發病的快捷方法，在短期內完成人工發病工作。
[0004]本發明解決上述技術問題的技術方案如下:
[0005]一種煙草立枯病人工 發病的快捷方法是利用立枯病菌可侵染煙草葉片引起組織壞死的特性，在培養皿內接種幼小煙苗，導致煙苗葉片快速發病，表現清晰癥狀。人工發病方法的步驟如下:
[0006]1.煙草幼苗培育準備:
[0007]用普通的淺盤盛裝肥力較好且疏松的土壤，用常規方法在室內培育煙苗，長至3~4片小葉片后備用。
[0008]2.接種菌絲體的準備:
[0009]將立枯病菌移植到PSA普通真菌培養基平板中心，PSA培養基成分為:馬鈴薯200克，蔗糖20克，瓊脂18克，水1000mL,在28°C條件下培養至長出較大菌落，取直徑為6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌絲瓊脂圓塊，以此菌絲塊作接種體。
[0010]3.煙草幼苗接種前處置:
[0011]取步驟I育好的適用幼苗，接種前先澆水濕潤軟化育苗土壤，以便于拔苗。取出干凈的培養皿置于普通淺方盤內，并往培養皿內加入薄層清水；選取有3~4片小葉片的幼苗，用手輕輕拔起并轉到其它容器盛裝的清水中，輕輕晃動洗脫幼苗根系上的土壤，將幼苗轉到上述備好的培養皿內，把小葉片架放于培養皿的皿緣上，根系靠在皿底上，使幼苗呈豎立狀態，并且使清水浸沒根系。
[0012]4.接種立枯病菌:[0013]挑取步驟2準備的菌絲塊，輕輕貼放于步驟3處置完畢的幼苗的心葉上或心芽上。
[0014]5.接種后處置:
[0015]步驟4操作完備后，將盛裝接種幼苗的培養皿放在淺方盤內，并將有機玻璃罩罩在淺方盤上,往淺方盤內注入薄層清水,使有機玻璃罩內部封閉并形成罩內穩定的高濕狀態；然后將整套裝置放于具備日常散射光的普通室內培養，培養溫度維持在25~30°C。注意避開直射陽光照曬。
[0016]接種結果導致幼苗葉片出現水潰狀壞死，最后整個幼苗全部壞死腐爛。通常情況下，接種I天后可見明顯壞死表現，3~4天后全株腐爛。
[0017]本發明的優點是:
[0018]I)接種技術體系微型化，主要表現在用微小的幼苗，在很小的空間內接種發病，耗用很短的試驗周期。
[0019]2)實施過程簡單，操作方便效率高。
[0020]3 )全程在普通實驗室內完成，發病局部條件容易控制，受干擾小，容易實現技術方法標準化。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1是本發明在普通實驗室內培育的煙草幼苗示意圖。
[0022]圖中，A是用普通搪瓷方盤培育；B是用培養皿培育。
[0023]圖2是本發明的架放在培養皿皿緣上的幼苗及其接種菌絲塊后的示意圖。
[0024]圖3是本發明用有機玻璃罩將接種后的幼苗罩在淺方盤內的示意圖。
[0025]圖4是本發明接種2天后的發病表現。
[0026]圖中，A~E是不同幼苗接種病菌的表現；F部是空白接種對照。
[0027]圖5是本發明接種3天后的發病表現。
[0028]圖中，A~E是接種病菌的發病表現，其中A示意多株幼苗的病情，B~E示意單株苗的表現；F是空白接種對照。
【具體實施方式】
[0029]下面結合附圖與實施例對本發明作進一步描述。
[0030]本發明的煙苗培育和接種發病全程均在普通實驗室內實施，實驗室只需要具備窗口向南，透光良好，并配備普通空調即行。按常規方法在室內近窗口旁培育煙苗，本發明設計主要是采用較大的育苗盤統一大量育苗，如圖1的A所示，這可使得育苗護理(主要是澆水護理)相對簡單；幼苗大小適合使用之后，將幼苗移轉到另外的器具上實施接種操作；采用此方式育苗還有個好處，就是一般培育的煙苗生長通常是大小參差不齊，移苗到另處接種操作可以選擇大小一致的幼苗進行試驗；另外，移苗操作可以獲得無土狀態的幼苗，對于一些需要排除土壤干擾的試驗有利。實際應用也可采用培養皿等器具育苗，如圖1的B所示；
[0031]接種所采用的是生長至3~4片小葉片的微小煙苗，如圖1的B部所示，通常只需要培育3~4周。接種操作是在普通培養皿內實施，在幼苗輪生狀的小葉片中心接種病菌，如圖2所示。[0032]煙草立枯病菌侵染煙草發病的關鍵條件是需要環境處于高濕狀態，本發明采用自制玻璃罩罩住幼苗的方式，如圖3所示，提供穩定的高濕條件，同時還便于發病過程觀察。
[0033]發病通常在接種點開始，表現為水潰狀壞死，如圖4所示，隨菌絲的蔓延，壞死斑快速向周圍擴展，最后整個幼苗都壞死腐爛，如圖5所示。通常情況下，接種I天后可見壞死斑出現，3~4天后全株壞死腐爛。
[0034]接種導致病情發展的快慢或輕重，與立枯病菌接種菌絲體菌齡狀態有關，也與接種后的培養溫度有關，病情輕重可以用壞死的最前沿點與接種點的距離、或壞死病斑面積、或株發病率等指標來衡量。
[0035]實施例1
[0036]一種煙草立枯病人工發病的快捷方法，在煙草品種云煙87微小幼苗上接種煙草立枯病菌菌株Rs-1，按如下步驟操作:
[0037]1.煙草幼苗培育準備:用普通的搪瓷方盤內盛裝肥力較好且疏松的土壤，用常規方法在室內培育煙苗，長至如圖1的B所示的3~4片小葉片后備用。
[0038]2.接種菌絲體的準備:將立枯病菌移植到PSA培養基平板中心，PSA培養基成分為:馬鈴薯200克，蔗糖20克，瓊脂18克，水1000mL，28°C下培養48小時長出較大菌落，取直徑為6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌絲瓊脂圓塊，以此菌絲塊作接種體。
[0039]3.煙草幼苗接種前處置:取步驟I育好的適用幼苗，接種前0.5~I小時先澆水濕潤軟化育苗土壤，以便于拔苗。取出干凈的9cm培養皿置于普通淺方盤內，并往培養皿內加入20ml清水；選取有3~4片小葉片的幼苗，用手輕輕拔起并轉到其它容器盛裝的清水中，輕輕晃動洗脫幼苗根系上的土壤，將幼苗轉到上述備好的9cm培養皿內，把小葉片架放于培養皿的皿緣上，根系靠在皿底上，使幼苗呈豎立狀態，并且皿內清水浸沒根系。
[0040]4.接種立枯病菌:挑取步驟2準備的菌絲塊，輕輕貼放于步驟3處置完畢的幼苗的心葉上或心芽上，完備后如圖2所示。
[0041]5.接種后處置:步驟4操作完備后，取自制有機玻璃罩將盛裝接種幼苗的培養皿罩在淺方盤上，往淺方盤內注入薄層清水，使玻璃罩內部封閉并形成罩內穩定的高濕狀態，如圖3所示；然后將整套裝置放于具備日常散射光的普通室內培養，培養溫度維持在25~27V。注意避開直射陽光照曬。
[0042]結果表現出如圖3和圖4 一樣清晰的葉片壞死癥狀；接種48小時后壞死的最前沿點與接種點的距離2.1cm0
[0043]實施例2
[0044]—種煙草立枯病人工發病的快捷方法，在煙草品種云煙87微小幼苗上接種煙草立枯病菌菌株Rs-Ι，按實施例1的步驟I至步驟5操作實施。其中在步驟5的操作的與實施例I步驟5的操作有變化，實施例1的步驟5)接種后培養溫度維持在25~27°C，而本實施例的步驟5)接種后培養溫度維持在19~20°C。結果也表現出如圖3和圖4 一樣清晰的葉片壞死癥狀；接種48小時后壞死的最前沿點與接種點的距離0.6cm。
[0045]實施例3
[0046]—種煙草立枯病人工發病的快捷方法，在煙草品種云煙87微小幼苗上接種煙草立枯病菌菌株Rs-Ι，按實施例1的步驟I至步驟5操作實施。其中在步驟2)的操作的與實施例I步驟2)的操作有變化，實施例1的步驟2)接種體菌絲的培養時長為48小時，本實施例的步驟2)接種體菌絲的培養時長為96小時。結果同樣表現出如圖3~圖5 —樣清晰的葉片壞死癥狀，但病斑擴大速 度比實施例1的速度慢，接種48小時后壞死的最前沿點與接種點的距離0.8cm。
【權利要求】
1.一種煙草立枯病人工發病的快捷方法，其特征在于，利用立枯病菌可侵染煙草葉片引起組織壞死的特性，在培養皿內接種幼小煙苗，導致煙苗葉片快速發病，表現清晰癥狀； 方法的步驟如下: 1)煙草幼苗培育準備: 用普通的淺盤盛裝肥力較好且疏松的土壤，用常規方法在室內培育煙苗，長至3~4片小葉片后備用； 2)接種菌絲體的準備: 將立枯病菌移植到PSA普通真菌培養基平板中心，PSA培養基成分為:馬鈴薯200克，蔗糖20克，瓊脂18克，水1000mL,在28°C條件下培養至長出較大菌落，取直徑為6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌絲瓊脂圓塊，以此菌絲塊作接種體； 3)煙草幼苗接種前處置: 取步驟I)育好的適用幼苗，接種前先澆水濕潤軟化育苗土壤，以便于拔苗，取出干凈的培養皿置于普通淺方盤內，并往培養皿內加入薄層清水；選取有3~4片小葉片的幼苗，用手輕輕拔起并轉到其它容器盛裝的清水中，輕輕晃動洗脫幼苗根系上的土壤，將幼苗轉到上述備好的培養皿內，把小葉片架放于培養皿的皿緣上，根系靠在皿底上，使幼苗呈豎立狀態，并且使清水浸沒根系； 4)接種立枯病菌: 挑取步驟2)準備的菌絲塊，輕輕貼放于步驟3)處置完畢的幼苗的心葉上或心芽上； 5)接種后處置: 步驟4)操作完備后，將盛裝接種幼苗的培養皿放在淺方盤內，并將有機玻璃罩罩在淺方盤上,往淺方盤內注入薄層清水,使有機玻璃罩內部封閉并形成罩內穩定的高濕狀態；然后將整套裝置放于具備日常散射光的普通室內培養，培養溫度維持在25~30°C，注意避開直射陽光照曬； 接種結果導致幼苗葉片出現水潰狀壞死，最后整個幼苗全部壞死腐爛。通常情況下，接種I天后可見明顯壞死表現，3~4天后全株腐爛。
【文檔編號】A01G7/06GK103782816SQ201410006422
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月7日 優先權日:2014年1月7日
【發明者】張君成, 熊英, 黃柳, 譚金樂, 陳江凝 申請人:廣西大學