培養用于觀察根腫菌侵染十字花科植株的方法
【專利摘要】本發明提供一種培養用于觀察根腫菌侵染十字花科植株的方法，取新鮮發病的十字花科植物的根組織制成根腫菌菌液，在石英砂中播下十字花科種子，用MS基本培養液浸濕石英砂及種子，并在光照強度為100μmolphotons/(m2.s)、光照時間為16～18h、溫度為20～22℃、濕度為75%以上的條件下，培養至種子萌發，再生長至長出2片真葉的植株；在每株植株的根部施加根腫菌菌液進行侵染，然后分階段將侵染的植株根系用生物顯微鏡觀察，直至侵染階段結束。本發明操作簡便且觀察結果清晰，占用空間小，試驗成本低，具有操作安全、簡單、重復性強，觀察方便、結果清晰的優點。
【專利說明】培養用于觀察根腫菌侵染十字花科植株的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種植物培養方法,尤其是一種培養被根腫菌侵染的十字花科植株的方法，以用于觀察根腫菌對十字花科植株侵染的過程，屬于植物病理學研究【技術領域】。
【背景技術】
[0002]十字花科根腫病是由蕓薹根腫菌ora brassicae Woron.)侵染引起的一種土傳真菌病害，在十字花科植物中危害嚴重。蕓薹根腫菌在侵染植株的過程中分為兩個階段，初侵染階段(或根毛侵染，即土壤中休眠孢子變成初級游動孢子到達根毛表面后，穿過細胞壁侵入根毛內部，這個階段被稱為初侵染階段)和再侵染階段(或皮層侵染，即病原菌在根毛內部形成次生原生質團，一部分細胞核裂解形成多核的游動孢子囊，每個游動孢子囊產生4~16個次游動孢子，侵入主根皮層，這個過程叫做再侵染階段)，整個侵染過程主要在根部進行，因此可通過對根毛部位的觀察對根腫菌的侵染過程進行研究。
[0003]目前，國內根腫病方面的研究多集中于根腫病發病規律的調查與防治，而對根腫菌侵染過程的研究報道較少。在已有研究中，用于觀察根腫菌侵染過程的植物的培養主要采用土壤培養或水培養的方法，土壤培養法觀察時對植株破壞性大，干擾因素多，操作繁雜，觀察結果不清晰，且容易造成病害的傳播和污染，而用水培法則存在培養液容易污染，植株根系不發達等問題，且根部容易腐爛，不利于觀察；在培養方法上存在不足，亟需改進。
【發明內容】
[0004]為解決現有技術中干擾因素多、操作繁雜、觀察結果不清晰等問題，本發明提供一種培養被根腫菌侵染的十字花科植株的方法，并在培養過程中，取樣觀察根腫菌對十字花科植株侵染的過程。
[0005]本發明通過下列技術方案實現:一種培養用于觀察根腫菌侵染十字花科植株的方法，其特征在于經過下列各步驟:
(O取新鮮的被根腫菌侵染而發病的十字花科植物的根組織并攪碎，經孔徑為25μπι的紗布過濾，將濾液于3000r/min的轉速下離心分離9min，去上清液，然后在沉淀物中加入適量蒸懼水，于4000r/min的轉速離心分離12min,去上清液,再在沉淀物中加入適量蒸懼水，于4000r/min的轉速離心分離12min，去上清液，之后在沉淀物中加入蒸餾水懸浮沉淀物，直至得到lX107CFU/mL的根腫菌菌液，保存于4°C下備用；
(2)在消毒石英砂中播下消毒十字花科種子，用MS基本培養液浸濕石英砂及種子，在光照強度為100 μ mo I photons/ (m2.s)、光照時間為16~18h、溫度為20~22°C、濕度為75%以上的條件下，培養至種子萌發，再生長至長出2片真葉的植株，其間每2天補加I次MS基本培養液，以保持石英砂及種子的濕潤；
(3)在步驟(2)的每株植株的根部施加0.5mL步驟(1)的根腫菌菌液進行侵染；
(4)從侵染后的第4天開始，隨機取出部分步驟(3)所得的植株，并洗去植株根部的沙子，從根部選取大小均勻的根系，剪下I~2cm的包括根尖部分的須根，置于載玻片上，于生物顯微鏡下觀察，如此每隔2天取出部分步驟(3)所得植株，進行一次顯微觀察，直至侵染階段結束。
[0006]所述步驟(2)的消毒石英砂是:用質量濃度為20%的鹽酸浸泡24h，再用水沖洗至石英砂接近中性后，用高壓蒸汽滅菌處理15~30min的石英砂。
[0007]所述步驟(2)的消毒十字花科種子是:經質量濃度為2%的次氯酸鈉溶液消毒IOmin的種子。
[0008]所述步驟(2)的MS基本培養液是:經常規高溫高壓滅菌后，再用濃度為0.lmol/L的HCl溶液將其pH值調節為6.2的MS基本培養液。
[0009]所述根腫菌為蕓薹根腫菌。
[0010]本發明應用沙子-培養液體系對十字花科植株進行培養和根腫菌侵染，侵染植株拔出沖洗后，即可進行觀察，對根毛部位基本沒有損傷，根毛透明度高、通透性強，可清晰觀察到根腫菌在寄主根毛部位的整個發育過程，觀察后的植株仍可繼續存活，與傳統方法相比操作簡單、觀察方便且清晰，能較早地觀察到病害的發生，對十字花科及其他植物對蕓薹根腫菌的抗性研究具有重要意義。
[0011]本發明操作簡便且觀察結果清晰，且應用常用用品和試劑，占用空間小，試驗成本低，具有操作安全、簡單，可操作性、可重復性強，觀察方便、結果清晰的優點，能夠廣泛應用于十字花科植物對蕓薹根腫菌的抗性鑒定中，從而加快根腫病抗性品種的篩選和應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1為侵染后第4 天根毛的顯微觀察結果；
圖2為侵染后第8天根毛的顯微觀察結果；
圖3為侵染后第10天根毛的顯微觀察結果；
圖4為侵染后第12天根毛顯微觀察結果；
圖5為侵染后第14天根毛顯微觀察結果。
【具體實施方式】
[0013]下面通過實施例對本發明做進一步說明。
[0014]實施例1
(1)取新鮮的被蕓薹根腫菌侵染而發病的十字花科植物的根組織并攪碎，經孔徑為25 μ m的紗布過濾,將濾液于3000r/min的轉速下離心分離9min,去上清液,然后在沉淀物中加入適量蒸餾水，于4000r/min的轉速離心分離12min，去上清液，再在沉淀物中加入適量蒸餾水，于4000r/min的轉速離心分離12min，去上清液，之后在沉淀物中加入蒸餾水懸浮沉淀物，直至得到I X 107CFU/mL的蕓薹根腫菌菌液，保存于4°C下備用；
(2)在消毒石英砂中播下消毒十字花科種子，用MS基本培養液浸濕石英砂及種子，在光照強度為100 μ mo I photons/ (m2.s)、光照時間為16h、溫度為22°C、濕度為75%以上的條件下，培養至種子萌發，再生長至長出2片真葉的植株，其間每2天補加I次MS基本培養液，以保持石英砂及種子的濕潤；
所述消毒石英砂是:用質量濃度為20%的鹽酸浸泡24h，再用水沖洗至石英砂接近中性后，用高壓蒸汽滅菌處理15min的石英砂；所述消毒十字花科種子是:經質量濃度為2%的次氯酸鈉溶液消毒IOmin的種子；
所述MS基本培養液是:經常規高溫高壓滅菌后，再用濃度為0.lmol/L的HCl溶液將其pH值調節為6.2的MS基本培養液；
(3)在步驟(2)的每株植株的根部施加0.5mL步驟(1)的蕓薹根腫菌菌液進行侵染；
(4)從侵染后的第4天開始，隨機取出部分步驟(3)所得的植株，并洗去植株根部的沙子，從根部選取大小均勻的根系，剪下Icm的包括根尖部分的須根，置于載玻片上，于生物顯微鏡下觀察，結果見圖1，由圖1中可見根毛細長，根毛管腔內中空；如此每隔2天取出部分步驟(3)所得植株，進行一次顯微觀察，直至侵染階段結束，結果見圖2-5，由圖2中可見根毛腫大，根毛管腔內出現原生質團和游動孢子囊，由圖3中可見根毛內的游動孢子囊開始產生游動孢子，由圖4中可見游動孢子從游動孢子囊中游出，由圖5中可見根毛腫大，根毛管腔內中空。
[0015]實施例2
(1)取新鮮的被蕓薹根腫菌侵染而發病的十字花科植物的根組織并攪碎，經孔徑為25 μ m的紗布過濾,將濾液于3000r/min的轉速下離心分離9min,去上清液,然后在沉淀物中加入適量蒸餾水，于4000r/min的轉速離心分離12min，去上清液，再在沉淀物中加入適量蒸餾水，于4000r/min的轉速離心分離12min，去上清液，之后在沉淀物中加入蒸餾水懸浮沉淀物，直至得到I X 107CFU/mL的蕓薹根腫菌菌液，保存于4°C下備用；
(2)在消毒石英砂中播下消毒十字花科種子，用MS基本培養液浸濕石英砂及種子，在光照強度為100 μ mo I photons/ (m2.s)、光照時間為18h、溫度為20°C、濕度為75%以上的條件下，培養至種子萌發，再生長至長出2片真葉的植株，其間每2天補加I次MS基本培養液，以保持石英砂及種子的濕潤；
所述消毒石英砂是:用質量濃度為20%的鹽酸浸泡24h，再用水沖洗至石英砂接近中性后，用高壓蒸汽滅菌處理20min的石英砂；
所述消毒十字花科種子是:經質量濃度為2%的次氯酸鈉溶液消毒IOmin的種子；
所述MS基本培養液是:經常規高溫高壓滅菌后，再用濃度為0.lmol/L的HCl溶液將其pH值調節為6.2的MS基本培養液；
(3)在步驟(2)的每株植株的根部施加0.5mL步驟(1)的蕓薹根腫菌菌液進行侵染；
(4)從侵染后的第4天開始，隨機取出部分步驟(3)所得的植株，并洗去植株根部的沙子，從根部選取大小均勻的根系，剪下1.5cm的包括根尖部分的須根，置于載玻片上，于生物顯微鏡下觀察，如此每隔2天取出部分步驟(3)所得植株，進行一次顯微觀察，直至侵染階段結束，從而可清晰地觀察到蕓薹根腫菌在寄主根毛部位的整個發育過程，其結果同圖1~圖5。
[0016]實施例3
(1)取新鮮的被蕓薹根腫菌侵染而發病的十字花科植物的根組織并攪碎，經孔徑為25 μ m的紗布過濾,將濾液于3000r/min的轉速下離心分離9min,去上清液,然后在沉淀物中加入適量蒸餾水，于4000r/min的轉速離心分離12min，去上清液，再在沉淀物中加入適量蒸餾水，于4000r/min的轉速離心分離12min，去上清液，之后在沉淀物中加入蒸餾水懸浮沉淀物，直至得到I X 107CFU/mL的蕓薹根腫菌菌液，保存于4°C下備用；
(2)在消毒石英砂中播下消毒十字花科種子，用MS基本培養液浸濕石英砂及種子，在光照強度為100 μ mo I photons/ (m2.s)、光照時間為17h、溫度為21°C、濕度為75%以上的條件下，培養至種子萌發，再生長至長出2片真葉的植株，其間每2天補加I次MS基本培養液，以保持石英砂及種子的濕潤；
所述消毒石英砂是:用質量濃度為20%的鹽酸浸泡24h，再用水沖洗至石英砂接近中性后，用高壓蒸汽滅菌處理30min的石英砂；
所述消毒十字花科種子是:經質量濃度為2%的次氯酸鈉溶液消毒IOmin的種子；
所述MS基本培養液是:經常規高溫高壓滅菌后，再用濃度為0.lmol/L的HCl溶液將其pH值調節為6.2的MS基本培養液；
(3)在步驟(2)的每株植株的根部施加0.5mL步驟(1)的蕓薹根腫菌菌液進行侵染；
(4)從侵染后的第4天開始，取出步驟(3)所得部分植株，并洗去植株根部的沙子，從根部選取大小均勻的根系，剪下2cm的包括根尖部分的須根，置于載玻片上，于生物顯微鏡下觀察，如此每隔2天取出部分步驟(3)所得植株，進行一次顯微觀察，直至侵染階段結束，從而可清晰地觀察到蕓薹根腫菌在寄主根毛部位的整個發育過程，其結果同圖1~圖5。
【權利要求】
1.一種培養用于觀察根腫菌侵染十字花科植株的方法，其特征在于經過下列各步驟: (O取新鮮的被根腫菌侵染而發病的十字花科植物的根組織并攪碎，經孔徑為25μπι的紗布過濾，將濾液于3000r/min的轉速下離心分離9min，去上清液，然后在沉淀物中加入適量蒸懼水，于4000r/min的轉速離心分離12min,去上清液,再在沉淀物中加入適量蒸懼水，于4000r/min的轉速離心分離12min，去上清液，之后在沉淀物中加入蒸餾水懸浮沉淀物，直至得到I X 107CFU/mL的根腫菌菌液，于4°C下保存備用； (2)在消毒石英砂中播下消毒十字花科種子，用MS基本培養液浸濕石英砂及種子，在光照強度為100 μ mo I photons/ (m2.s)、光照時間為16~18h、溫度為20~22°C、濕度為75%以上的條件下，培養至種子萌發，再生長至長出2片真葉的植株，其間每2天補加I次MS基本培養液，以保持石英砂及種子的濕潤； (3)在步驟(2)的每株植株的根部施加0.5mL步驟(1)的根腫菌菌液進行侵染； (4)從侵染后的第4天開始，隨機取出部分步驟(3)所得的植株，并洗去植株根部的沙子，從根部選取大小均勻的根系，剪下包括根尖部分在內的I~2cm的側根，置于載玻片上，于生物顯微鏡下觀察，如此每隔2天隨機取出部分步驟(3)所得的植株，進行一次顯微觀察，直至侵染階段結束。
2.根據權利要求1所述的培養用于觀察根腫菌侵染十字花科植株的方法，其特征在于:所述步驟(2)的消毒石英砂是:用質量濃度為20%的鹽酸浸泡24h，再用水沖洗至石英砂接近中性后，用高壓蒸汽滅菌處理15~30min的石英砂。
3.根據權利要求1 所述的培養用于觀察根腫菌侵染十字花科植株的方法，其特征在于:所述步驟(2)的消毒十字花科種子是:經質量濃度為2%的次氯酸鈉溶液消毒IOmin的種子。
4.根據權利要求1所述的培養用于觀察根腫菌侵染十字花科植株的方法，其特征在于:所述步驟(2)的MS基本培養液是:經常規高溫高壓滅菌后，再用濃度為0.lmol/L的HCl溶液將其PH值調節為6.2的MS基本培養液。
【文檔編號】A01G1/00GK103931476SQ201410159860
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月21日 優先權日:2014年4月21日
【發明者】吳麗艷, 龔亞菊, 李石開, 鮑銳, 黎志彬, 孔令明, 鐘利 申請人:云南省農業科學院園藝作物研究所