一種抑制家蠶體內BmNPV病毒增殖的方法
【專利摘要】本發明公開了一種抑制家蠶體內BmNPV病毒增殖的方法，首先將納米二氧化鈦配置成濃度為4.5～5.5mg/L的添加劑溶液，再將溶液按照100kg桑葉添加1.0L溶液的使用劑量噴灑桑葉，晾干后添食家蠶，可以顯著抑制家蠶體內BmNPV的擴增。本發明根據提過對家蠶添食納米二氧化鈦，抑制的BmNPV的擴增，可以為防治家蠶的BmNPV病提供理論支撐，所公開的方法食用性強、操作方便、效果顯著，適合在我國蠶區推廣應用。
【專利說明】—種抑制家蠶體內BmNPV病毒增殖的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種抑制家蠶體內病毒增殖的方法，具體涉及一種通過納米粒子作用抑制家蠶體內BmNPV病毒增殖的方法。
【背景技術】
[0002]家蠶iBombyx mori)是重要的經濟昆蟲，已經被馴化飼養5700余年，其產絲的性能得到了大幅度的提高，但其對病原的抗性較弱。近年來，由于養蠶的蠶期重疊，消毒不徹底，蠶病的發生率有所上升。
[0003]家蠶核型多角體病毒(BmNPV)是蠶病中發病率最高的一種，由于病毒在體外有多角體外殼保護，存在時間長，消毒難；另外由于該病的潛伏期長，一旦暴發就會造成蠶農重大損失。BmNPV病毒通常通過消化道進入蠶體，病毒粒子不斷的增殖，造成蠶體的營養不足和組織損傷，直至蠶體死亡。
[0004]另一方面，納米氧化物由于其獨特的小尺寸效應、表面效應、量子尺寸效應及宏觀量子隧道效應而具有優于常規粒子的熱、磁、光敏感特性以及表面穩定性，從而應用于各個方面，如工業中的涂 料和顏料領域，日常生活中的陶瓷、防曬化妝品及食品領域，環境治理中用于空氣凈化、污水處理和抗菌除毒領域。在納米抗菌材料中抗菌劑以納米尺寸分散，具有高比表面積和高反應活性，抗菌材料整體的抗菌效果較傳統抗菌劑有顯著提高，更能顯著的抑制細菌、真菌等微生物的生長和繁殖，同時納米氧化物高效的催化性能又可以促使化學毒劑降解。
[0005]但是現有技術中，未見關于納米氧化物與家蠶體內病毒關系的報道；因此結合納米材料的特性開發出一種低成本、見效快的抑制家蠶體內BmNPV病毒增殖的方法很有必要。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種抑制家蠶體內BmNPV病毒增殖的方法，以促進蠶絲業的健康發展。
[0007]為達到上述發明目的，本發明采用的技術方案是:一種抑制家蠶體內BmNPV病毒增殖的方法，包括以下步驟:
(1)添加劑溶液的配制:將納米二氧化鈦與水進行混合后配制成濃度為4.5~5.5mg/L的添加劑溶液；
(2)添食家蠶:將步驟(1)中制備的添加劑溶液按照IOOkg桑葉添加IL溶液劑量噴灑適熟葉，待適熟葉晾干后連續添食家蠶3天即可抑制家蠶體內BmNPV的增殖。
[0008]上述技術方案中，所述納米二氧化鈦的粒徑為I~100 nm。
[0009]優選的技術方案中，添加劑溶液的濃度為5.0mg/L。
[0010]上述技術方案中，步驟(2)中的晾干為自然晾干；添食家蠶時的給桑量和平常使
用量一樣。[0011]本發明結合家蠶的生理特征，開發了蠶用納米添加劑；步驟(1)中制備的添加劑溶液在使用前充分混勻，按照IOOkg桑葉添加1.0L劑量均勻噴灑適熟葉,量少會影響使用效果，量高會增加使用成本；待適熟葉自然晾干后添食家蠶，避免食下水份過多，影響飼料的消化和吸收，給桑量和平常使用量一樣；納米添加劑可以和其他蠶藥及添加劑混合使用，不用影響使用效果。
[0012]本發明通過給正常家蠶添食帶有BmNPV病毒的適熟葉，一段時間后，通過測試家蠶對BmNPV病毒的抑制率來判斷納米二氧化鈦的效果。具體為:先喂食家蠶帶有納米二氧化鈦的適熟葉，再添食帶有BmNPV病毒的適熟葉，采用血球計數板統計的每毫升添食溶液中含有的多角體數量來確定添加BmNPV病毒的濃度。每隔一段時間后，解剖家蠶取去除食物殘渣的中腸，提取基因組DNA，以家蠶的Actin3基因組序列為內參，采用定量PCR方法檢測BmNPV的相對拷貝數，計算出家蠶對BmNPV病毒的抑制率。
[0013]由于上述技術方案運用，本發明具有下列優點:
1.本發明首次利用納米二氧化鈦作為添加劑喂食家蠶以抑制家蠶體內家蠶核型多角體病毒BmNPV的增殖，效果顯著，能夠提高家蠶對BmNPV病毒的抗性，病毒抑制率達99.6450% ；
2.本發明公開的方法中使用的添加劑用量少、來源廣泛、成本低；無需改變生產規律，操作方便，易于推廣應用。
【具體實施方式】 [0014]下面結合實施例對本發明作進一步描述:
實施例一:一種抑制家蠶體內BmNPV增殖的方法 ⑴材料及藥品:
家蠶品種:蘇秀X春豐，取得了江蘇省蠶品種審定委員會頒發的蠶品種證書(蘇審蠶201001)，具有家蠶的基本共性。
[0015]藥品:納米二氧化鈦(TiO2)為杭州萬景新材料有限公司公司產品。
[0016]其他分子生物學試劑為生工生物工程(上海)股份有限公司產品。
[0017]⑵納米二氧化鈦的使用
取納米二氧化鈦與水混合配制成濃度為5.0 mg/L的添加劑溶液；使用前充分混勻添加劑，按照100 kg桑葉添加1.0L劑量進行噴灑各齡期的適熟葉，桑樹品種為育711，待適熟葉晾干后連續添食家蠶3天，給桑量和平常使用量一樣。
[0018]家蠶BmNPV病毒抑制率研究 (3) BmNPV病毒添食
將試驗區(添食納米二氧化鈦)和對照區(添食水)各取400頭家蠶備用，分別添食涂有濃度為I X IO7個/mL BmNPV溶液的桑葉1000克，采用血球計數板統計的每毫升添食溶液中含有的多角體數量來確定添加BmNPV病毒的濃度。待家蠶連續取食I小時后，清除剩余葉片，換正常桑葉進行常規飼養。
[0019]⑷樣本提取
每隔24小時分別取試驗區和對照區家蠶10頭，解剖后取去除食物殘渣的中腸置一80°C保存備用。[0020](5)基因組DNA的提取
將各樣本分別存有液氮的研砵中充分磨碎，采用酚一氯仿方法提取基因組DNA。
[0021](6)定量PCR引物的設定
根據定量PCR反應的要求，結合家蠶和BmNPV基因組信息，設定內參基因組引物 Bmactin3-1 (SEQ ID N0.1:GTTATCTGACGAATGACTTTGT), Bm-actin3-2(SEQ ID N0.2:CGGAGTCCAGCACGATA),目標基因引物 BmNPV-gp64_l (SEQ IDN0.3:TTCTTGACTCGGTGCTCG)，BmNPV- gp64_2 (SEQ ID N0.4:GCTGCGTGTCTGCTCATT)?
[0022](7)定量PCR反應
Real-time PCR反應采用熒光染料SYBR Green I在ABI Prism 7300熒光定量PCR儀上進行。PCR 反應體系(總體積 20 μ L): 2 X SYBR Premix Ex Taq 10 μ L, 10 μ mo I/L 上下游引物各 0.4 μ L,50 X ROX Reference Dye 0.4 μ L，模板DNA 2.0 μ L, dH20
6.8 μ LoPCR 程序:50°C 2 min; 95 °C 預變性 I min; 95 °C 15 s，60 °C 31 s，45 個循環；采集熒光信號，分析熔解曲線，每個樣品重復3次。
[0023](7)數據統計與分析
分別把含有BmNPV的家蠶中腸基因組DNA進行稀釋10倍、100倍、1000倍和10000倍，按照 J.H.Schefe 公開的方法(參見:J.H.Schefe, K.E.Lehmann, 1.R.Buschmann, T.Unger, H.Funke-Kaiser, Quantitative real-time RT-PCR data analysis: currentconcepts and the novel “gene expression’s CT difference” formula, Journal ofMolecular Medicine 2006 (84): 901 - 910)測定不同濃度的家香中腸基因組DNA溶液的Ct值，根據測定得的Ct值分別制定Bm-actin3和BmNPV_gp64的Y值和log值對應的標準曲線。根據各對照區和實驗區家蠶樣本測定的Ct值，經三組平均后，分別求出對應的log值，再根據2—ΛΛα法求出對應的基因拷貝數，把gp64的基因組拷貝數和actin3基因組拷貝數的比值表示為BmNPV的相對拷貝數，相對拷貝數統計如表1。
[0024]表1 BmNPV相對拷貝數統計
【權利要求】
1.一種抑制家蠶體內BmNPV病毒增殖的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)添加劑溶液的配制:將納米二氧化鈦與水進行混合后配制成濃度為4.5~5.5mg/L的添加劑溶液； (2)添食家蠶:將步驟(1)中制備的添加劑溶液按照IOOkg桑葉添加IL溶液劑量噴灑適熟葉，待適熟葉晾干后連續添食家蠶3天，即可抑制家蠶體內BmNPV病毒的增殖。
2.根據權利要求1所述抑制家蠶體內BmNPV病毒增殖的方法，其特征在于:納米二氧化鈦的粒徑為1~100 nm。
3.根據權利要求1所述抑制家蠶體內BmNPV病毒增殖的方法，其特征在于:添加劑溶液的濃度為5.0mg/Lo
4.根據權利要求1所述抑制家蠶體內BmNPV病毒增殖的方法，其特征在于:步驟(2)中的晾干為室溫下自然晾干。
5.根據權利要求1所述抑制家蠶體內BmNPV病毒增殖的方法，其特征在于:步驟(2)中添食家蠶時的給桑量和平常使用量一樣。
【文檔編號】A23K1/14GK103947614SQ201410168991
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月24日 優先權日:2014年4月24日
【發明者】李兵, 徐開遵, 沈衛德, 洪法水 申請人:蘇州大學