玉米鋅鐵調控轉運體ZmZIPs基因及其應用的制作方法

玉米鋅鐵調控轉運體ZmZIPs基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了玉米鋅鐵調控轉運體ZmZIPs基因及其應用。本發明從玉米中分離得到5個鋅鐵調控轉運體ZmZIPs基因，其cDNA序列分別選自SEQIDNo.1、SEQIDNo.3、SEQIDNo.5、SEQIDNo.7或SEQIDNo.9所示的核苷酸序列。亞細胞定位表明，這些基因所編碼的鋅鐵調控轉運體定位在細胞的質膜與內質網。酵母互補實驗表明，本發明所分離的5個ZmZIPs基因均具有鋅鐵轉運功能。本發明ZmZIPs基因對于調控植物吸收、轉運和儲存鋅鐵的能力，促進胚和胚乳的發育、成熟，增加作物種子中鋅鐵含量等方面具有重要的應用景。
【專利說明】玉米鋅鐵調控轉運體ZmZ I Ps基因及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及從植物中分離的金屬離子轉運體基因，尤其涉及從玉米中分離的與 鋅鐵的吸收、轉運或儲存有關的調控轉運體ZmZIPs基因，本發明進一步涉及調控轉運體 ZmZIPs基因在調控植物吸收、轉運或儲存鋅或鐵能力，促進胚和胚乳的發育或成熟以及增 加糧食作物種子鋅鐵含量中的應用，屬于植物金屬離子調控轉運體基因的分離和應用領 域。

【背景技術】
[0002] 鋅和鐵是生物體所必需的微量元素，在植物的生長發育過程中有著重要作用 (ffintz H,Fox T, Wu YY, et al. Expression profiles of Arabidopsis thaliana in mineral deficiencies reveal novel transporters involved in metal homeostasis.The Journal of biological chemistry2003, 278(48) :47644-47653.)。鋅是生物體 300 多種酶和重要 蛋白質的結構輔助因子（Haydon MJ, Cobbett CS. A novel major facilitator superfamily protein at the tonoplast influences zinc tolerance and accumulation in Arabidopsis. Plant physiology2007, 143 (4) : 1705-1719.)。鋅不僅參與機體的各種代謝，在生物 膜穩定和基因表達調控等生理機能中也擔負著重要的角色（Mathews WR，Wang F，Eide DJ, et al. Drosophila fear of intimacy encodes a Zrt/IRT-like protein(ZIP)family zinc transporter functionally related to mammalian ZIP proteins. The Journal of biological chemistry2005, 280(1) :787-795.)。適量增加植物體內鋅的含量可提高作物產 量，而鋅的缺乏會導致葉綠素、脂質、蛋白、質膜的氧化破壞，植物體內鋅離子的過度積累又 會對植物產生毒害。
[0003] 鐵在細胞呼吸、光合作用和金屬蛋白的催化反應過程中發揮重要作用，是重要的 電子傳遞體，因此，鐵元素在原核和真核生物的生命活動中具有不可替代的功能。另外， 細胞內過高的Fe 3YFe2+氧化還原勢會導致超氧化合物的產生，對細胞造成傷害（Briat JFjLebrun M. Plant responses to metal toxicity. Comptes rendus de IiAcademie des sciences Serie III，Sciences de la viel999, 322(1) :43-54.)。因此，嚴格控制植物體內 金屬離子的平衡是至關重要的。
[0004] 參與鋅鐵吸收的蛋白主要有三類，都是以蛋白家族形式存在的，包括：ZIP，即 鋒調控轉運體（Zinc-regulated transporter，ZRT)和鐵調控轉運體（Iron-regulated transporter，IRT)。酵母功能互補實驗顯示ZIP家族基因能夠轉運包括Zn 2+、Fe2+、 Cu2+、Cd2+ 在內的多種金屬離子（Colangelo EP，Guerinot ML. Put the metal to the petal:metal uptake and transport throughout plants.Current opinion in plant biology2006, 9 (3) : 322-330.)。ZIP -般由309-476個氨基酸殘基組成，有8個潛在的跨膜 結構域和相似的拓撲結構，第3和第4跨膜區之間有一長的可變區，可變區位于胞內，其C、 N末端位于胞外，該區富含組氨酸殘基，可能與金屬的結合、轉運有關（Guerinot ML. The ZIP family of metal transporters. Biochim Biophys Acta2000, 1465 (1-2) : 190-198.) 〇
[0005] 目前在擬南芥、水稻、蒺藜、苜蓿、大豆、野生型二粒小麥、葡萄等植物中鑒定出ZIP 基因并對其功能進行了研究。在擬南芥中發現16個ZIP家族基因，AtIRTl是通過酵母互補 實驗分離得到的第一個ZIP功能基因，其主要在根部表達，且該基因的過表達可導致鎳的 過度積累（Eide D，Broderius M，Fett J，et al. A novel iron-regulated metal transporter from plants identified by functional expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Americal996, 93 (11) : 5624-5628 ; Henriques R，Jasik J，Klein M，et al.Knock-out of Arabidopsis metal transporter gene IRTlresults in iron deficiency accompanied by cell differentiation defects. Plant molecular biology2002,50 (4-5):587-597 ；Varotto Cj Maiwald Dj Pesaresi Pj et al.The metal ion transporter IRTlis necessary for iron homeostasis and efficient photosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant journal:for cell and molecular biology2002, 31 (5):589-599 ;Vert G，Grotz N，Dedaldechamp F，et al. IRTlj an Arabidopsis transporter essential for iron uptake from the soil and for plant growth.Plant Cell2002, 14(6):1223-1233 ；Nishida Sj Tsuzuki Cj Kato A, et al. AtIRTlj the primary iron uptake transporter in the root, mediates excess nickel accumulation in Arabidopsis thaliana. Plant&cell physiology2011,52 (8):1433-1 442.)。AtIRT2主要在根部表達，定位在囊泡，推測具有細胞內過量金屬元素的解毒功 會巨(Vert GjBriat JFjCurie C.Arabidopsis IRT2gene encodes a root-periphery iron transporter. The Plant journal:for cell and molecular biology2001, 26(2):181-189 ； Vert Gj Barberon Mj Zelazny Ej et al. Arabidopsis IRT2cooperates with the high-affinity iron uptake system to maintain iron homeostasis in root epidermal cells. Planta20 09, 229 (6) : 1171-1179. 14, 15)。AtIRT3能互補鋅、鐵轉運雙突變體，過表達AtIRT3會使鋅 在地上部以及鐵在地下部積累（Lin YF，Liang HM，Yang SY，etal. Arabidopsis IRT3is a zinc-regulated and plasma membrane localized zinc/iron transporter. The New phytol ogist2009, 182(2) :392-404.)。表達分析顯示，六七21?1、六七21?54七21?9、六七21?12和六《訂3 受缺鋅誘導，由此推測，這些基因在缺鋅條件下可能增強鋅的吸收能力（Kramer U，Talke IN，Hanikenne Μ· Transition metal transport. FEBS Lett2007, 581 (12) : 2263-2272.)。
[0006] 玉米（Zea mays)是中國重要的糧食、飼料和經濟作物，增加玉米籽粒中鋅、鐵等 微量元素的含量，對提高飲食或飼料利用效率、促進經濟的發展及人體健康尤為重要。目 前，已知許多轉運蛋白參與了植物體內鋅鐵離子平衡網絡系統，其中ZH^Zinc-regulated transporters，Iron-regulated transporter-like proteins，ZIP)基因家方矣對鋒、鐵等二 價金屬離子的吸收、運輸和儲存起著重要作用，在擬南芥、水稻、大麥、大豆上，已報道了一 些有關ZIP家族基因的研究，但對ZIP家族基因在植物體內具體的作用機制尚未完全了解， 而關于玉米的ZIP家族基因的研究報道較少。了解Zn 2+、Fe2+在玉米中的吸收、運輸方式， 分布規律和調節機制，將有助于改善玉米在鋅、鐵缺乏的環境中的生長發育，為進一步揭示 玉米中ZIP家族基因的作用機理奠定基礎，為玉米鋅、鐵高效轉基因育種提供候選基因，也 為人類鋅鐵營養提供良好的基礎。


【發明內容】

[0007] 本發明的目的之一是提供從玉米（Zea mays)中分離的鋅鐵調控轉運體基因；
[0008] 本發明的目的之二是提供鋅鐵調控轉運體基因所編碼的蛋白質；
[0009] 本發明的目的之三是將所述的鋅鐵調控轉運體基因應用于調控植物對鋅鐵等金 屬離子的吸收、轉運或儲存，促進胚根和胚芽發育以及胚成熟或者增加糧食作物籽粒中鋅 鐵含量。
[0010] 本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：
[0011] 從玉米（Zea mays)中分離的鋅鐵調控轉運體ZmZIPl基因，其cDNA序列為（a)、 (b)或（c)所示：
[0012] (a)、SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；
[0013] (b)、編碼SEQ ID No. 2所示氨基酸的核苷酸序列；
[0014] (c)、與SEQ ID No. 1所示核苷酸的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的核苷 酸，該核苷酸所編碼的蛋白質具有鋅鐵調控轉運體的功能。
[0015] 從玉米（Zea mays)中分離的鋅鐵調控轉運體ZmZIP2基因，其cDNA序列為（a)、 (b)或（c)所示：
[0016] (a)、SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列；
[0017] (b)、編碼SEQ ID No. 4所示氨基酸的核苷酸序列；
[0018] (c)、與SEQ ID No. 3所示核苷酸的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的核苷 酸，該核苷酸所編碼的蛋白質具有鋅鐵調控轉運體的功能。
[0019] 從玉米（Zea mays)中分離的鋅鐵調控轉運體ZmZIP3基因，其cDNA序列為（a)、 (b)或（c)所示：
[0020] (a)、SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列；
[0021] (b)、編碼SEQ ID No. 6所示氨基酸的核苷酸序列；
[0022] (c)、與SEQ ID No. 5所示核苷酸的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的核苷 酸，該核苷酸所編碼的蛋白質具有鋅鐵調控轉運體的功能。
[0023] 從玉米（Zea mays)中分離的鋅鐵調控轉運體ZmZIP7基因，其cDNA序列為（a)、 (b)或（c)所示：
[0024] (a)、SEQ ID No. 7所示的核苷酸序列；
[0025] (b)、編碼SEQ ID No. 8所示氨基酸的核苷酸序列；
[0026] (c)、與SEQ ID No. 7所示核苷酸的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的核苷 酸，該核苷酸所編碼的蛋白質具有鋅鐵調控轉運體的功能。
[0027] 從玉米（Zea mays)中分離的鋅鐵調控轉運體ZmZIP8基因，其cDNA序列為（a)、 (b)或（c)所示：
[0028] (a)、SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列；
[0029] (b)、編碼SEQ ID No. 10所示氨基酸的核苷酸序列；
[0030] (c)、與SEQ ID No. 9所示核苷酸的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的核苷 酸，該核苷酸所編碼的蛋白質具有鋅鐵調控轉運體的功能。
[0031] 所述"嚴謹雜交條件"意指在所屬領域中已知的低離子強度和高溫的條件。通 常，在嚴謹條件下，探針與其靶序列雜交的可檢測程度比與其它序列雜交的可檢測程度更 高（例如超過本底至少2倍。嚴謹雜交條件是序列依賴性的，在不同的環境條件下將會不 同，較長的序列在較高溫度下特異性雜交。通過控制雜交的嚴謹性或洗滌條件可鑒定與探 針100%互補的祀序列。對于核酸雜交的詳盡指導可參考有關文獻（Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, ^Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays. 1993)〇 更 具體的，所述嚴謹條件通常被選擇為低于特異序列在規定離子強度pH下的熱熔點（Tm)約 5-KTC。Tm為在平衡狀態下50 %與目標互補的探針雜交到目標序列時所處的溫度（在指定 離子強度、PH和核酸濃度下）（因為目標序列過量存在，所以在Tm下在平衡狀態下50%的 探針被占據）。嚴謹條件可為以下條件：其中在PH7. 0到8. 3下鹽濃度低于約I. OM鈉離子 濃度，通常為約〇· 01到I. OM鈉離子濃度（或其它鹽），并且溫度對于短探針（包括（但不 限于）10到50個核苷酸）而言為至少約30°C，而對于長探針（包括（但不限于）大于50個 核苷酸）而言為至少約60°C。嚴謹條件也可通過加入諸如甲酰胺的去穩定劑來實現。對于 選擇性或特異性雜交而言，正信號可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。例 示性嚴謹雜交條件可如下：50%甲酰胺，5XSSC和1% SDS，在42°C下培養；或5XSSC，1% SDS，在65 °C下培養，在0.2 X SSC中洗滌和在65 °C下于0. 1 % SDS中洗滌。所述洗滌可進行 5、15、30、60、120min 或更長時間。
[0032] 優選的，本發明從玉米中所分離的鋅鐵調控轉運體ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、 ZmZIP7 或 ZmZIP8 基因的 cDNA 序列分別為 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列。
[0033] 本發明目的之二是提供由上述鋅鐵調控轉運體ZmZIPs基因（ZmZIPl、ZmZIP2、 ZmZIP3、ZmZIP7或ZmZIP8)所編碼的能夠吸收、轉運或儲存鋅鐵的蛋白質；
[0034] 本發明目的之二是通過以下技術方案來實現的：
[0035] ZmZIPs基因所編碼的鋅鐵調控轉運體，其氨基酸序列為（a)或（b)所示：
[0036] (a)、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8 或 SEQ ID No. 10 所示的 氨基酸序列；
[0037] (b)、將 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8 或 SEQ ID No. 10 所示 的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有鋅 鐵調控轉運體功能的蛋白變體。
[0038] 所述的"多個"通常意味著2-8個，優選為2-4個，這取決于鋅鐵調控轉運體三維 結構中氨基酸殘基的位置或氨基酸的種類；所述的"替換"是指分別用不同的氨基酸殘基取 代一個或多個氨基酸殘基；所述的"缺失"是指氨基酸殘基數量的減少，也即是分別缺少其 中的一個或多個氨基酸殘基；所述的"插入"是指氨基酸殘基序列的改變，相對天然分子而 言，所述改變導致添加一個或多個氨基酸殘基。
[0039] 本發明所述的蛋白變體可由遺傳多態性或人為操作產生，這些操作方法通常為本 領域所了解。例如，可通過DNA的突變來制備鋅鐵調控轉運體的氨基酸序列變體或片段，其 中由于誘變或改變多核苷酸的方法為本領域所習知。其中，保守的取代是將一種氨基酸殘 基替換成具有相似性質的另一種氨基酸。因此，本發明所述的鋅鐵調控轉運體及其編碼基 因包括天然存在的序列和變體兩種形式。"變體"意指基本相似的序列，對于多核苷酸，變 體包含天然多核苷酸中一個或多個位點處一個或多個核苷酸的缺失、插入或/和替換。對 于多核苷酸，保守的變體包括由于遺傳密碼的簡并性而不改變編碼的氨基酸序列的那些變 體。諸如此類天然存在的變體可通過現有的分子生物學技術來鑒定。變體多核苷酸還包括 合成來源的多核苷酸，例如，采用定點誘變所得到的仍編碼SEQ ID No. 2所示的氨基酸的多 核苷酸變體，或者是通過重組的方法（例如DNA重排等）。本領域技術人員可通過以下分子 生物技術手段來篩選或評價變體多核苷酸所編碼蛋白的功能或活性：DNA結合活性，蛋白 之間的相互作用，瞬時研究中基因表達的激活情況或轉基因植物中表達的效應等。
[0040] 從亞細胞定位結果可知，本發明分離的5個ZmZIPs基因（ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、 ZmZIP7或ZmZIP8基因）所編碼的蛋白定位在質膜與細胞內膜上。為進一步確定細胞內膜 的具體定位，本發明選用ERmarker與5個ZmZIPs基因共定位進行擬南芥葉肉原生質體的 轉化，結果證明這5個ZmZIPs基因均定位在細胞質膜及內質網上。在亞細胞定位的基礎上， 通過real-time RT-PCR表達分析發現，正常營養條件下，5個ZmZIPs基因主要在地上部表 達，其中，缺鋅條件下，ZmZIP8在96h地上部表達上調，ZmZIP3在6h時地上部和地下部表達 量都有所升高；在高鋅條件ZmZIP7和ZmZIP8在地上部的表達量是逐漸降低的，ZmZIP3在 地下部的表達量明顯的降低。這些結果表明，ZmZIP3、ZmZIP7和ZmZIP8在幼苗時期對鋅的 濃度比較敏感。缺鐵條件下，ZmZIP7和ZmZIP8在地上與地下的表達量是逐漸增高的，說明 ZmZIP7和ZmZIP8對鐵的濃度比較敏感。缺銅、缺錳條件下，5個ZmZIPs基因的表達量都沒 有明顯的變化。
[0041] 酵母互補實驗表明，本發明所分離的5個ZmZIPs不論在低鋅還是在低鐵條件下都 表現出不同程度的轉運鋅或鐵活性，說明本發明所分離的5個ZmZIPs均具有轉運鋅鐵的功 能。
[0042] 目前，已知許多轉運蛋白參與了植物體內鋅鐵離子平衡網絡系統，一些蛋白也 被應用到植物的轉基因研究中，比如在大麥中過表達AtZIPl基因能夠增加鋅和鐵在種 子中的含量（Ramesh SA，Choimes S，Schachtman DP. Over-expression of an Arabidopsis zinc transporter in hordeum vulgare increases short-term zinc uptake after zinc deprivation and seed zinc content. Plant molecular biology2004, 54(3):373-385.), 同樣，過表達OsIRTl基因，水稻中鋅和鐵的含量在地上部、地下部和種子中都有所 提高(Lee SjAn G. Over-expression of OsIRTlleads to increased iron and zinc accumulations in rice. Plant，cell&environment2009, 32 (4) :408-416.) 〇 然而，在 水稻中過表達0sZIP4、0sZIP5、0sZIP8, 0sZIP9結果導致過量的鋅聚集于根部，降低 了植株地上部分的鋒含量（Lee S，Kim SA，Lee J，et al. Zinc deficiency-inducible 0sZIP8encodes a plasma membrane-localized zinc transporter in rice. Molecules and cells2010, 29 (6) : 551-558 ;Lee S，Jeong HJ，Kim SA，et al. 0sZIP5is a plasma membrane zinc transporter in rice. Plant molecular biology2010, 73 (4-5) :507-517 ；Ishimaru YjMasuda Hj Suzuki Mj et al.Overexpression of the 0sZIP4zinc transporter confers disarrangement of zinc distribution in rice plants. Journal of experimental botany2007, 58 (11) :2909-2915.)沒有達到在籽粒中增加鋅含量的目的，因此，這些基因的 過表達對水稻籽粒中鋅的富集是不利的。這些結果表明，異位過表達對于鋅鐵的積累與分 布可能會起到一定的作用。然而，有關鋅鐵轉運蛋白在籽粒中的研究還很少。
[0043] 因此，本發明提供了一種調控植物吸收、轉運或儲存鋅鐵的能力的方法，包括：將 本發明ZmZIPs基因可操作的與表達調控元件相連接得到重組植物表達載體；將重組植物 表達載體轉化到植物中，在植物體中過表達ZmZIPs基因，能夠有效調控或改善目標植物對 鋅鐵的吸收、轉運或儲存的能力。
[0044] 本發明提供了一種解除過量的鋅鐵對植物體毒害的方法，該方法包括：將本發明 ZmZIPs基因可操作的與表達調控元件相連接得到重組植物表達載體；將重組植物表達載 體轉化到植物中，在植物體中過表達ZmZIPs基因。
[0045] 本發明還提供了一種調控或促進植物種子胚發育的方法，該方法包括：將本發明 ZmZIPs基因可操作的與表達調控元件相連接得到重組植物表達載體；將重組植物表達載 體轉化到植物中，在植物體中過表達ZmZIPs基因；其中，所述的表達調控元件中啟動子優 選為種子特異性表達的啟動子。
[0046] 本發明進一步提供了一種調控或促進種子胚成熟的方法，該方法包括：將本發明 ZmZIPs基因可操作的與表達調控元件相連接得到重組植物表達載體；將重組植物表達載 體轉化到植物中，在植物體中過表達ZmZIPs基因；其中，所述的表達調控元件中的啟動子 優選為種子特異性表達的啟動子。
[0047] 本發明進一步提供了含有所述鋅鐵調控轉運體ZmZIPs基因的重組植物表達載體 以及含有該重組植物表達載體的宿主細胞。
[0048] 將本發明所述鋅鐵調控轉運體ZmZIPs基因可操作的與表達調控元件相連接，得 到可以在植物中表達該鋅鐵調控轉運體基因的重組植物表達載體。"可操作的連接"指兩 個或更多個元件之間功能性的連接，可操作的連接的元件可為鄰接或非鄰接的。例如，該 重組植物表達載體可以由Y端非編碼區，SEQ ID No. 1 (或者是SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、 SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 9中的任一序列）所示的核苷酸和3'非編碼區組成，其中，所述 的5'端非編碼區可以包括啟動子序列、增強子序列或/和翻譯增強序列；所述的啟動子可 以是組成性啟動子、誘導型啟動子、組織或器官特異性啟動子；所述的3'非編碼區可以包 含終止子序列、mRNA切割序列等。合適的終止子序列可取自根癌農桿菌的Ti-質粒，例如 章魚堿合成酶或胭脂堿合成酶終止區。例如，為了使本發明的鋅鐵調控轉運體基因在糧食 作物種子進行特異性表達，可以將鋅鐵調控轉運體基因連接在種子特異性表達啟動子的下 方構建得到重組植物表達載體，將該重組植物表達載體轉化受體植物后，鋅鐵調控轉運體 基因可以在受體植物的種子里進行特異性表達，達到促進胚根和胚芽發育、促進胚成熟或 增加種子鋅鐵含量或調控胚發育的效果。
[0049] 另外，本領域技術人員可以將ZmZIPs的核苷酸序列進行優化以增強其在植物中 的表達。例如。可采用目標植物的偏愛密碼子進行優化來合成多核苷酸以增強該基因在目 標植物中的表達水平，這些方法均為本領域技術人員所習知。
[0050] 此外，該重組植物表達載體還可含有用于選擇轉化細胞的選擇性標記基因。選擇 性標記基因用于選擇經轉化的細胞或組織。所述的選擇性標記基因包括：編碼抗生素抗性 的基因以及賦予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的標記基因還包括表型標記，例如 β-半乳糖苷酶和熒光蛋白等。
[0051] 所述的"轉化"指將基因導入到植物細胞內部這樣的方式將多核苷酸或多肽遺傳 轉化到植物中。將所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法為本領域所習知，包括但不限 于穩定轉化法、瞬時轉化法和病毒介導法等。"穩定轉化"指被引入的多核苷酸構建體整合 至植物細胞的基因組中并能通過其子代遺傳；"瞬時轉化"指多核苷酸被引入到植物中但只 能在植物中暫時性表達或存在。
[0052] 轉化方案以及將所述多核苷酸引入植物的方案可視用于轉化的植物（單子葉植 物或雙子葉植物）或植物細胞的類型而變化。將所述多核苷酸轉化植物細胞的合適方法包 括：顯微注射、電穿孔、農桿菌介導的轉化、直接基因轉移以及高速彈道轟擊等。在特定的 實施方案中，可利用多種瞬時轉化法將本發明的ZmZIPs基因提供給植物。在其它實施方案 中，本發明的ZmZIPs基因可通過將植物與病毒或病毒核酸接觸來引入到植物中，通常，這 樣的方法涉及將本發明的ZmZIPs基因構建體引入病毒DNA或RNA分子中。
[0053] 利用常規方法可使已轉化的細胞再生穩定轉化植株（McCormick et al. Plant Cell Reports. 1986. 5:81-84)。本發明可用于轉化任何植物種類，包括但不限于：單子葉植物或 雙子葉植物；優選的，所述的目標植物包括糧食作物、蔬菜或果樹等，更優選為糧食作物，例 如，可以是玉米、水稻、大麥小麥、高粱、大豆、馬鈴薯等糧食作物。
[0054] 本發明所涉及到的術語定義
[0055] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發明所屬領域的 普通技術人員通常所了解相同的含義。雖然在本發明的實踐或測試中可使用與本文所述者 類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現在描述優選方法、裝置和材料。
[0056] 術語"重組宿主細胞株"或"宿主細胞"意指包含本發明多核苷酸的細胞，而不管 使用何種方法進行插入以產生重組宿主細胞，例如直接攝取、轉導、f配對或所屬領域中已 知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組 中。宿主細胞可為原核細胞或真核細胞，宿主細胞還可為單子葉或雙子葉植物細胞。
[0057] 術語"核苷酸"意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷 或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似 物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結合特性并以類似于天然產生的核苷酸的方 式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術語也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA (肽核 酸）、在反義技術中所用的DNA類似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指定，否 則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體（包括（但不限于）簡并密碼子取代） 和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產生其中一個或一個以上所選（或所 有）密碼子的第3位經混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現簡并密碼子取代。
[0058] 術語"多肽"、"肽"和"蛋白質"在本文中互換使用以意指氨基酸殘基的聚合物。艮P， 針對多肽的描述同樣適用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述術語適用于天然產生氨 基酸聚合物以及其中一個或一個以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如 本文中所使用，所述術語涵蓋任何長度的氨基酸鏈，其包括全長蛋白（即抗原），其中氨基 酸殘基經由共價肽鍵連接。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0059] 圖1酵母表達載體pFL61的不意圖。
[0060] 圖2標準Hoagland培養基條件下ZmZIPs的表達模式；S (shoot)，R (root)。
[0061] 圖3 ZmZIPs基因在各種處理條件下的表達模式。
[0062] 圖4 ZmZIPs基因在玉米胚和胚乳發育過程中的表達模式。
[0063] 圖5 pRTL2NGFP-ZmZIPs重組載體酶切鑒定；M為IKb的Marker ; 1-5分別為 pRTL2NGFP-ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7、ZmZIP8 雙酶切的結果
[0064] 圖6 ZmZIPs洋蔥表皮細胞中的亞細胞定位；GFP為pRTL2NGFP空載體定位情況； ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7、ZmZIP8 為 pRTL2NGFP-ZmZIPl、2、3、7、8 的亞細胞定位情 況。
[0065] 圖7 ZmZIPs擬南芥葉肉原生質體中的亞細胞定位；GFP為pRTL2NGFP空載體定位 情況；GFP 為 pRTL2NGFP 空載體定位情況；ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7、ZmZIP8 分別為 pRTL2NGFP-ZmZIPI、2、3、7、8 的亞細胞定位情況。
[0066] 圖 8 pFL61-ZmZIPs 及 pFL61-〇sZIP5、pFL61-〇sZIP8、pFL61-〇sIRTl 正向連 接重組載體酶切鑒定；M為IKb的Marker ;l-8依次為pFL61-ZmZIPl、pFL61-ZmZIP2、 pFL61-ZmZIP3、pFL61-ZmZIP7、pFL61-ZmZIP8、pFL61-〇sZIP5、pFL61-〇sZIP8、pFL61-〇sIRTl 雙酶切結果。
[0067] 圖9 ZmZIPs酵母互補實驗結果。
[0068] 圖 10 ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7 和 ZmZIP8 的植物表達載體示意圖。
[0069] 圖11 ZmZIPs基因在擬南芥中過表達提高擬南芥中鋅含量的實驗結果；ZmZIP2 為轉ZmZIP2基因在擬南芥中過表達提高擬南芥中鐵或鋅含量的實驗結果；ZmZIP3為轉 ZmZIP3基因在擬南芥中過表達提高擬南芥中鐵或鋅含量的實驗結果；ZmZIP7為轉ZmZIP7 基因在擬南芥中過表達提高擬南芥中鐵或鋅含量的實驗結果；ZmZIP8為轉ZmZIP8基因在 擬南芥中過表達提高擬南芥中鐵或鋅含量的實驗結果；WT為野生型哥倫比亞種子中鐵和 鋅含量測定的結果。

【具體實施方式】
[0070] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0071] 實驗材料
[0072] I. 1植物材料
[0073] 玉米自交系X178由河北農業大學農學院/國家玉米改良中心河北分中心實驗室 提供，水稻自交系日本晴由北京師范大學生命科學院惠贈。
[0074] L 2菌株與載體
[0075] 大腸桿菌（E. coli)菌株 Machl-Tl 和農桿菌（A. tumefacterium)菌株 EHA105、 GV3101均由本實驗室保存。pGEM-Teasy載體購自Promega公司。酵母表達載體pFL61(不 意圖見圖 1)、酵母菌株 zrtlzrt2ZHY3 (MAT a ade6canlhis31eu2trplura3zrtl: :LEU2zrt2: :HIS3), fet3fet4DEY1453 (MATa/MATa ade2/+ canl/canl his3/his3 Ieu2/leu2 trpl/trpl ura3/ura3fet3-2::HIS3/fet3-2::HIS3fet4-l::LEU2/fet4-l::LEU2), DY1455 (MATa ade6 canl his3 leu2 trpl ura3)由南京農業大學張紅生教授友情惠贈。
[0076] 實施例1玉米鋅鐵調控轉運體ZmZIPs基因的克隆
[0077] 1、植物材料的處理
[0078] 先把蛭石用Hoagland營養液浸透，將玉米自交系X178種子點播于育苗盤中，上面 覆蓋上一層干蛭石，在溫室（16h光照/8h黑暗，26°C )中培養，12天幼苗長至2葉一心時移 入標準Hoagland營養液中生長6天至3葉一心（每3天換一次營養液），3葉一心的玉米 幼苗在標準營養液和不加鋅、鐵、銅、錳、高鋅、鐵的條件下處理〇、6、12、24、48、96h后，分別 收取幼苗地上部和根，液氮速凍后于_80°C保存用于總RNA提取。
[0079] 2、玉米總RNA的提取
[0080] 采用Trizol法提取玉米總RNA。
[0081] 3、cDNA 的合成
[0082] (1)去除 DNA，按下述配制反應體系：總 RNA (1 μ g/ μ L) I. 0 μ L，DNAse I (10U/ yL)1.0yL，10XDNAseIbufTerl.0yL，DEPCH20 7.0 yL"g4fl0.0yL;37t：30min，WA I μ L25mM EDTA，65°C 5min 終止反應。
[0083] (2)、加入 I μ L oligo(dT18)，65°C 5min ;
[0084] (3)、以上共12 μ L，再加入以下組分得到反轉錄體系：5X反應緩沖液4.0 μ L，Ri RT (20U/ μ L) I. 0 μ L，Re RT (200U/ μ L) I. 0 μ L，IOmM dNTP mix 2· 0 μ L，總計：20. 0 μ L ;42°C 60min，70°C 5min，終止反應。
[0085] 4、目的基因的克隆
[0086] (1)、根據目的基因的ORF框設計引物：
[0087] ZmZIPlF5'-GCGGCCGCATGCGCCGCCAAAGCCT-3,NotI
[0088] ZmZIPlR5'-GCGGCCGCTTATTCTACCAGAGAAATGCCTAGAGCG-3'NotI
[0089] ZmZIP2F5'-TACGTAATGGCCCGCGCCAC-3'SnaBI
[0090] ZmZIP2R 5' -TACGTATCAGGTGTCCCATATCATGACG-3' SnaBI
[0091] ZmZIP3F 5'-CCCGGGATGGGAGCTGTGAAGCATACATTG-3'SmaI
[0092] ZmZIP3R 5'-GGTACCCTATGCCCATATAGCAAGCATGGAC-3'KpnI
[0093] ZmZIP7F 5' -TCTAGAATGGTTCTCGCCGGCCTC-3 , XbaI
[0094] ZmZIP7R 5'-GAGCTCTCAAGCCCATATTGCAAGTGATGACATAG-3'SacI
[0095] ZmZIP8F 5' -CCCGGGATGGCCATGAGGCCACG-3, SmaI
[0096] ZmZIP8R 5' -GAGCTCCTAGGCCCACTTGGCCAGC-3, SacI
[0097] 以上述步驟3的cDNA為模板，選用ExTaq酶，2 X GCI buffer進行PCR擴增，PCR程 序為：95°C預變性4min ;94°C變性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸lmin，33個循環；72°C延 伸 IOmin ;
[0098] (2)、將克隆得到的片段克隆到pGEM-T載體中，轉化Machl-Tl菌株；
[0099] (3)、經酶切鑒定獲得陽性的重組質粒，測序得到正確克隆，所克隆的第1個基因 命名為ZmZIPl，該基因的cDNA序列為SEQ IDNo. 1所示，所推導的氨基酸序列為SEQ IDNo. 2 所示；所克隆的第2個基因命名為ZmZIP2,該基因的cDNA序列為SEQ ID No. 3所示，所推導 的氨基酸序列為SEQ ID No. 4所示；所克隆的第3個基因命名為ZmZIP3,該基因的cDNA序 列為SEQ ID No. 5所示，所推導的氨基酸序列為SEQ ID No. 6所示；所克隆的第4個基因命名 為ZmZIP7,該基因的cDNA序列為SEQ ID No. 7所示，所推導的氨基酸序列為SEQ ID No. 8所 示；所克隆的第5個基因命名為ZmZIP8,該基因的cDNA序列為SEQ ID No. 9所示，所推導的 氨基酸序列為SEQ ID No. 10所示。
[0100] 實施例2 ZmZIPs在幼苗、胚和胚乳中的表達模式
[0101] 將實施例1步驟3中反轉錄的cDNA稀釋10倍作為PCR反應的模板，PCR反應體 系如下：
[0102] cDNA2.0yL，ExTaqO. lyL，2XGCI 緩沖液 10.0yL，10mM dNTP mix0.8yL，上游 引物 RTZmZIPlF/RTZmZIP2F/RTZmZIP3F/RTZmZIP7F/RTZmZIP8F(10 μ M/μ L)I. 0 μ L，下 游引物 RTZmZIPlR/RTZmZIP2R/RTZmZIP3R/RTZmZIP7R/RTZmZIP8R(10yM/yL)1.0yL， ddH205. 1 μ L，總計 20. 0μ L ;
[0103] RTZmZIPlF 5' -CCTCTCTGCGTTGGTTGCTCT-3'
[0104] RTZmZIPlR 5' -TTGATGGTTGTTTTCTGGTCGT-3'
[0105] RTZmZIP2F 5' -CCACAAATGGCACGAGGTCT-3'
[0106] RTZmZIP2R 5' -CGAAGACGGAGTGGAAGCAAA-3，
[0107] RTZmZIP3F 5' -GCCTCTTGTTGGTGCCCTTA-3'
[0108] RTZmZIP3R 5' -TCAACAATGAACGCTGTAGTGCT-3'
[0109] RTZmZIP7F 5' -ACTAGGTGGGTGCATTGCTCAG-3'
[0110] RTZmZIP7R 5' -TGCCAGCAGATACCGAGTCAA-3'
[0111] RTZmZIP8F 5' -CGTGTCATCGCTCAGGTTCTTG-3'
[0112] RTZmZIP8R 5' -CCCTCGAACATTTGGTGGAAG-3'
[0113] PCR反應條件：94°C預變性4min ;30個循環，每個循環94°C變性45秒，60°C退火 lmin，72°C延伸Imin ;最后再延伸72°C lOmin，降溫至16°C，取出PCR產物放入4°C保存。
[0114] 目的基因表達量的檢測：實施例1步驟3中反轉錄的cDNA稀釋20倍作 為Real-time PCR反應的模板，Actin為內參照，反應體系如下：cDNA 5. 0 μ L，SYBR Green IlO.OyL，RoxO. 4 μ L，上游引物 ZmActinlF (10 μ M/μ L) 0.4 μ L，下游引物 ZmActinlR(10yM/y L)0. 4μ L，ddH203. 8 μ L，總計 10. Ομ L ;
[0115] ZmActinlF 5' -ATGTTTCCTGGGATTGCCGAT-3'
[0116] ZmActinlR 5' -CCAGTTTCGTCATACTCTCCCTTG-3'
[0117] 所用程序：95°C 2min，95°C 15sec，60°C 34sec，40 個循環，通過 Δ Δ Ct 法計算表 達量。
[0118] 通過real-time RT-PCR表達分析發現，正常營養條件下，5個ZmZIPs基因主要在 地上部表達，其中，缺鋅條件下，ZmZIP8在96h地上部表達上調，ZmZIP3在6h時地上部和 地下部表達量都有所升高；在高鋅條件ZmZIP7和ZmZIP8在地上部的表達量是逐漸降低的， ZmZIP3在地下部的表達量明顯的降低。這些結果表明，ZmZIP3、ZmZIP7和ZmZIP8在幼苗時 期對鋅的濃度比較敏感。缺鐵條件下，ZmZIP7和ZmZIP8在地上與地下的表達量是逐漸增高 的，說明ZmZIP7和ZmZIP8對鐵的濃度比較敏感。缺銅、缺錳條件下，5個ZmZIPs基因的表 達量都沒有明顯的變化。5個ZmZIPs基因可能參與胚和胚乳的發育（圖2、圖3和圖4)。
[0119] 實施例3 ZmZIPs的生物信息學分析
[0120] ZmZIPs由367-483個氨基酸組成，含有6-9個跨膜結構域，在第3與第4跨膜區之 間有一富含組氨酸的可變區，可能和金屬離子的結合轉運有關。進化樹分析顯示，ZmZIPl與 AtIARUOsIARl進化關系較近。另外，ZmZIP3和ZmZIP4與0sZIP3和0sZIP4形成一個基因 簇，ZmZIP2與0sZIP2鄰近，和鋅轉運體OsZIPl，AtZIP2和AtZIPll在一個分支上，ZmZIP5 與ZmZIP7在一個分支上，ZmZIP8與0sZIP8, ZmZIP6與0sZIP6進化關系較近，這些結果顯 示，本發明所分離的5個ZmZIPs可能是鋅鐵轉運體。
[0121] 實施例4 ZmZIPs的亞細胞定位
[0122] 1、融合表達載體的構建
[0123] 根據ZmZIPs基因的序列設計引物，引物序列如下：
[0124] ZmZIPlGF 5' -GAATTCATGCGCCGCCAAAGCCT-3' EcoRI
[0125] ZmZIPlGR 5' -TCTAGATTCTACCAGAGAAATGCCTAGAGCG-3' XbaI
[0126] ZmZIP2GF 5' -GAATTCATGGCCCGCGCCACCAA-3, EcoRI
[0127] ZmZIP2GR 5' -TCTAGAGGTGTCCCATATCATGACGACGG-3' XbaI
[0128] ZmZIP3GF 5' -GAATTCATGGGAGCTGTGAAGCATAC-3' EcoRI
[0129] ZmZIP3GR 5' -TCTAGATGCCCATATAGCAAGCATGGACAT-3' XbaI
[0130] ZmZIP7GF 5' -GAATTCATGGTTCTCGCCGGCCTC-3' EcoRI
[0131] ZmZIP7GR 5' -TCTAGAAGCCCATATTGCAAGTGATGACATAG-3' XbaI
[0132] ZmZIP8GF 5' -GAATTCATGGCCATGAGGCCACGC-3' EcoRI
[0133] ZmZIP8GR 5' -TCTAGAGGCCCACTTGGCCAGCAT-3, XbaI
[0134] 加入合適的酶切位點，并且基因3'端去除終止密碼子，以克隆基因時連接到 pGEM-T載體上測序正確的質粒為模板，選用ExTaq酶與2 X GCI buffer進行PCR擴增，PCR 程序為：95°C預變性4min ;94°C變性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸lmin，33個循環；72°C 延伸lOmin。擴增片段經1 %瓊脂糖凝膠電泳回收后克隆到pGEM-T載體中，轉化大腸桿 菌菌株Machl-Tl，經LB培養基（IPTG、X-gal、Amp)得到陽性克隆，提質粒、酶切和測序驗 證；以克隆基因時連接到pGEM-Τ載體上測序正確的質粒為模板，選用ExTaq酶與2XGCI buffer進行PCR擴增，擴增片段經1%瓊脂糖凝膠電泳回收后克隆到pGEM-T載體中，測序 正確的質粒酶切后，將目的片段構建到PRTL2NGFP載體上，分別命名為pRTL2NGFP-ZmZIPl、 pRTL2NGFP-ZmZIP2、pRTL2NGFP-ZmZIP3、pRTL2NGFP-ZmZIP7、pRTL2NGFP-ZmZIP8,圖 5 為酶 切鑒定圖。
[0135] 2、用相應的酶切pRTL2NGFP載體與不同的酶切后的基因片段，經T4DNA連接酶連 接，轉化Machl-Tl菌株，提質粒酶切鑒定篩選出正確重組體大提質粒用于基因槍轉化洋蔥 表皮。
[0136] 3、基因槍微彈的制備
[0137] 4、用基因槍進行洋蔥表皮轉化
[0138] 從定位結果可知5個211121?8(211121?1、211121?2、211121?3、211121?7或211121?8)均定位 在質膜與細胞內膜上（圖6)。為進一步確定細胞內膜的具體定位，選用ER marker與ZmZIPs 共定位進行擬南芥葉肉原生質體的轉化，結果證明5個ZmZIPs均定位在細胞質膜及內質網 上（圖7)。
[0139] 實施例五酵母互補實驗
[0140] 1、酵母表達載體的構建
[0141] 根據目的基因序列加入合適的酶切位點設計引物：
[0142] ZmZIPlYF 5' -GCGGCCGCATGCGCCGCCAAAGCCT-3, NotI
[0143] ZmZIPlYR 5'-GCGGCCGCTTATTCTACCAGAGAAATGCCTAGAGCG-3'NotI
[0144] ZmZIP2YF 5' -TACGTAATGGCCCGCGCCAC-3' SnaBI
[0145] ZmZIP2YR 5' -TACGTATCAGGTGTCCCATATCATGACG-3' SnaBI
[0146] ZmZIP3YF 5' -CCCGGGATGGGAGCTGTGAAGCATACATTG-3' SmaI
[0147] ZmZIP3YR 5' -GGTACCCTATGCCCATATAGCAAGCATGGAC-3' KpnI
[0148] ZmZIP7YF 5' -TACGTAATGGTTCTCGCCGGCCTC-3' SnaBI
[0149] ZmZIP7YR 5'-TACGTATCAAGCCCATATTGCAAGTGATGACATAG-3'SnaBI
[0150] ZmZIP8YF 5' -TGCCATGGCCATGAGGCCAC-3'
[0151] ZmZIP8YR 5' -CTAGGCCCACTTGGCCAGCATG-3'
[0152] 0sZIP5YF 5' -CCCGGGGAGCCATCGGCGATGGCGA-3, SmaI
[0153] 0sZIP5YR 5, -GAGCTCGTGATGGTCACTCACTCATCACGCC-3, SacI
[0154] 0sZIP8YF 5' -GCGGCCGCATGAGGACGAACACCACC-3, NotI
[0155] 0sZIP8YR 5' -GCGGCCGCCCTCTACATTAGTCCCTGAG-3' NotI
[0156] OsIRTlYF 5'-GCGGCCGCCCCGGGATGGCGACGCCGCGGA-3,NotI，SmaI
[0157] OsIRTlYR 5'-GCGGCCGCCCCGGGTCACGCCCACTTGGCCATG-3,NotI，SmaI
[0158] 以克隆基因時連接到pGEM-T載體上測序正確的質粒為模板，選用ExTaq與2 X GCI buffer進行PCR擴增，PCR程序為：95°C預變性4min ;94°C變性lmin，60°C退火lmin， 72°〇延伸111^11，33個循環；721：延伸1〇1^11。擴增片段經1%瓊脂糖凝膠電泳回收后克隆 到pGEM-T載體中，轉化大腸桿菌菌株Machl-Tl，經LB培養基（IPTG、X-gal、Amp)得到陽 性克隆，提質粒、酶切和測序驗證，測序正確的質粒酶切后，將目的片段構建到PFL61載體 上,命名為 pFL61-ZmZIPl、pFL61-ZmZIP2、pFL61-ZmZIP3、pFL61-ZmZIP7、pFL61-ZmZIP8 及 pFL61-〇sZIP5、pFL61-〇sZIP8 和 pFL61-〇sIRTl，圖 8 為酶切鑒定圖。
[0159] 用NotI酶切pFL61載體與酶切后的ZmZIPs片段經T4DNA連接酶連接，轉化 Machl-Tl菌株，提質粒酶切鑒定篩選出正確重組體大提質粒用于轉化釀酒酵母。
[0160] 2、電擊轉化法轉化酵母
[0161] (1)、從 YPD 平板上挑取 zrtlzrt2ZHY3、fet3fet4DEY1453 和 DY1455 的單菌落于 20mL的YH)液體培養基中，28°C搖床培養約24h ;
[0162] (2)、吸取以上2%體積的菌液轉接到IOOmL的YH)培養基中繼續擴繁約4_5h，待 菌液OD 6c?為1. 2-1. 5時即可制備感受態；
[0163] (3)、將菌液收集到50mL的離心管中，4°C，5, OOOrpm，離心5min，倒掉上清；
[0164] (4)、加入等體積的去離子水，冰上重懸菌體，4°C，5, OOOrpm，5min離心，倒掉上 清；
[0165] (5)、加入1/2體積的去離子水，冰上重懸菌體，4°C，5, OOOrpm，5min離心，倒掉上 清；
[0166] (6)、加入IOmL的IM山梨醇溶液，冰上重懸菌體，4°C，5, OOOrpm，5min離心，倒掉上 清；
[0167] (7)、加入450-600μ?的山梨醇溶液，用去頭的槍頭輕吸，重懸菌體；
[0168] (8)、按照每個I. 5mL的離心管里加入約100 μ L的感受態為準，分裝；
[0169] (9)、在每管感受態中加入適量的DNA(10y L左右，c彡200ng/yL)，冰上放置 l-2min,之后吸到預冷的電擊杯中，不要有氣泡；
[0170] (10)、電擊轉化，立即加入約800 μ L，IM的預冷的山梨醇溶液，重懸菌體；
[0171] (11)、從電擊杯中吸出菌體，涂布SD/Ura-平板；
[0172] (12)、SD平板上28 °C培養約6天可長出肉眼可見的菌斑。
[0173] 3、酵母陽性克隆的鑒定
[0174] (1)、取1.5mL酵母培養物，9, OOOrpm離心30秒，盡可能的吸棄上清，收集酵母細 胞；
[0175] (2)、加入600 μ L Sorbitol buffer，輕柔吹打充分重懸細胞，加入80U的 Lyticase,充分顛倒混勻，37°C溫育30min消化細胞壁，中間顛倒數次；
[0176] (3)、13, OOOrpm離心Imin,盡可能吸棄上清，加入250 μ L溶液YPl重懸菌體沉淀， 渦旋震蕩至徹底懸浮；
[0177] (4)、加入250 μ L ΥΡ2溶液，輕柔地翻轉，使菌體充分裂解，室溫放置4min ;
[0178] (5)、加入350 μ L YP3溶液，輕柔地翻轉，充分混勻時會出現白色絮狀沉淀，冰上靜 置3_5min，13, OOOrpm離心5min，小心吸取上清液。
[0179] (6)、將上一步所得上清液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12, OOOrpm 離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液；
[0180] (7)、加入500 μ L去蛋白液PD，12, OOOrpm離心30-60秒，棄廢液；
[0181] (8)、加入500 μ L漂洗液WB (已加無水乙醇），12, OOOrpm離心30-60秒,棄廢液；
[0182] (9)、加入 500 μ L 漂洗液 WB，12, OOOrpm 離心 30-60 秒，棄廢液；
[0183] (10)、將吸附柱AC放回空收集管中，13, OOOrpm離心2min，除去漂洗液；
[0184] (11)、取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加50 μ L洗 脫緩沖液EB (65-70°C水浴），室溫放置2min，13, OOOrpm離心lmin。
[0185] (12)、以抽提的1 μ L DNA為模板，基因的兩端引物為PCR擴增引物，進行PCR擴增 驗證目的基因，驗證正確的菌液，加入25%的甘油于-80°C保存。
[0186] 4、酵母互補實驗結果
[0187] 將 pFL61、pFL6卜ZmZIPl、pFL6卜ZmZIP2、pFL6卜ZmZIP3、pFL61-ZmZIP7、 pFL61-ZmZIP8、pFL61-〇sZIP5、pFL61-〇sZIP8、pFL61-〇sIRTl 質粒分別轉化到酵母突變 株 zrtlzrt2ZHY3 和 fet3fet4DEY1453 中，pFL61 為陰性對照，0sZIP5、0sZIP8(Lee S，Kim SAj Lee Jj et al. Zinc deficiency-inducible 0sZIP8encodes a plasma membrane-localized zinc transporter in rice. Molecules and cells2010, 29 (6) : 551-558 ；Lee Sj Jeong HJj Kim SAj et al.0sZIP5is a plasma membrane zinc transporter in rice. Plant molecular biology2010, 73(4-5) :507-517 ；Ishimaru YjMasuda Hj Suzuki Mj et al. Overexpression of the 0sZIP4zinc transporter confers disarrangement of zinc distribution in rice plants. Journal of experimental botany2007, 58(11) :2909-2915.)為鋒轉運體的陽性 對照，OsIRTl (Lee S，An G. Over-expression of OsIRTlleads to increased iron and zinc accumulations in rice. Plant，cell&environment2009, 32 (4) :408-416.)為鐵轉運體的陽 性對照，PFL61轉化野生型菌株DY1455作為另一陽性對照，轉化后鑒定為陽性的酵母菌在 SD液體培養基中培養，酵母菌液分別稀釋4個濃度（0D6。。= 1、0. 1、0.01、0.001)，然后取 5 μ L點在低鋅、彳氐鐵和正常SD的培養基中，低鋅培養基（SD培養基加入0. 4mM EDTA、0. 4mM EDTA 和 250 μ M ZnS04、0. 4mM EDTA 和 300 μ M ZnSO4)，彳氐鐵培養基（SD 培養基加入 50mM MES、 50mM MES 和 50 μ M FeCl3、50mM MES 和 100 μ M FeCl3)酵母互補參照 Lin，Y. F 的試驗（Lin YF，Liang HM, Yang SY，et al. Arabidopsis IRT3is a zinc-regulated and plasma membrane localized zinc/iron transporter. The New phytologist2009, 182(2) :392-404.)方法進 行，28 °C培養，6天觀察試驗結果。
[0188] 實驗結果顯示，在低鋅條件下，加有250μΜ ZnSO4的培養基中能明顯觀察到 DY-pFL61(野生型）、Z-ZmZIPl、Z-ZmZIP2、Z-ZmZIP3、Z-ZmZIP7、Z-ZmZIP8、Z-〇sZIP5、 Z-〇sZIP8、Z-OsIRTl 比空載體 Z-pFL61 長勢好，并且，Z-ZmZIPl、Z-ZmZIP2、Z-ZmZIP3、 Z-ZmZIP7、Z-ZmZIP8與已經報道的水稻OsZIP長勢相當。在低鐵條件下，D-ZmZIPU D-ZmZIP2、D-ZmZIP3、D-ZmZIP7、D-ZmZIP8比空載體D-pFL61長勢好，但是沒有已經報道的 D-OsIRTl 的轉運活性強（圖 9) ;ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7 或 ZmZIP8 不論在低鋅還 是在低鐵條件下都表現出不同程度的轉運活性，說明ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7或 ZmZIP8具有轉運鋅鐵的功能。
[0189] 實驗例I ZmZIPs基因在擬南介中過表達提商擬南介種子中鐵和鋒含量的實驗
[0190] 將ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7以及ZmZIP8基因分別與組成型35S啟動子控 制的植物表達載體PBI121相連接構建得到ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7和ZmZIP8基 因重組植物表達載體（圖10);將構建的重組植物表達載體分別轉化到擬南芥中，鑒定獲得 陽性的轉ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7和ZmZIP8基因擬南芥；將陽性的轉ZmZIPs基因 擬南芥與野生型哥倫比亞在相同的載培條件下培養，收獲轉ZmZIPs基因擬南芥種子和野 生型種子，分別測定轉ZmZIPs基因擬南芥種子和野生型擬南芥種子中鐵或鋅的含量；稱取 一定量的種子材料經微波消解，定容，用ICP-MS方法進行鋅鐵含量的測定；每批測定200mg 種子，測定三批，取三批數據的平均值。測定結果見圖11。從圖11的結果可見，在擬南芥中 過表達ZmZIPl、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7或ZmZIP8基因均能夠不同程度的提高種子中鐵或 鋅含量。
【權利要求】
1. 從玉米（Zeamays)中分離的鋅鐵調控轉運體ZmZIPs基因，其特征在于，其cDNA序 列選自（a)、（b)或（c): (a) 、SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7 或 SEQ ID No. 9 所示的核苷酸 序列； (b) 、編碼 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8 或 SEQ ID No. 10 所示氨 基酸的核苷酸序列； (c) 、與 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7 或 SEQ ID No. 9 所示核苷酸 的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的核苷酸，該核苷酸所編碼的蛋白質具有鋅鐵調 控轉運體的功能。
2. 權利要求1所述ZmZIPs基因編碼的蛋白質。
3. 按照權利要求2所述的蛋白質，其特征在于，所述蛋白質的氨基酸序列為（a)或（b) 所示： (a) 、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8 或 SEQ ID No. 10 所示的氨基 酸序列； (b) 、將 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8 或 SEQ ID No. 10 所示的氨 基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有鋅鐵調 控轉運體功能的蛋白變體。
4. 含有權利要求1所述鋅鐵調控轉運體ZmZIPs基因的重組表達載體；優選的，所述的 重組表達載體是重組植物表達載體。
5. 權利要求1所述鋅鐵調控轉運體ZmZIPs基因在調控或改善植物吸收、轉運或儲存鋅 或鐵能力中的應用。
6. 權利要求1所述鋅鐵調控轉運體ZmZIPs基因在促進或調控種子胚乳發育中的應用。
7. 權利要求1所述鋅鐵調控轉運體ZmZIPs基因在促進或調控植物種子胚成熟中的應 用。
8. 權利要求1所述鋅鐵調控轉運體ZmZIPs基因在增加糧食作物種子鋅或鐵含量中的 應用。
9. 權利要求1所述鋅鐵調控轉運體ZmZIPs基因在解除過量的鋅或鐵對植物體毒害中 的應用。
10. 按照權利要求5-9任何一項所述的應用，其特征在于，包括：將權利要求1所述鋅 鐵調控轉運體ZmZIPs基因可操作的與表達調控元件相連接，得到重組植物表達載體；將重 組植物表達載體轉化受體植物或植物細胞，培育得到轉基因植物。
【文檔編號】A01H5/00GK104212816SQ201410240908
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年5月30日 優先權日:2013年5月31日
【發明者】李素貞, 陳景堂, 李宏博, 趙永鋒, 郭晉杰 申請人:河北農業大學