可發生光點擊化學反應的小分子rna及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于光點擊化學反應技術領域，具體涉及可發生光點擊化學反應的小分子 RNA及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 在哺乳動物細胞中，核糖核酸干擾（RNAinterference，RNAi)是一種廣泛和基 礎的生物過程，并在生理病理過程中起著決定性的作用。在RNAi過程中，小分子非編碼 RNA，如內源性的微小核糖核酸（microRNA，miRNA)和外源性的小干擾核糖核酸（small interferingRNA，siRNA)可通過堿基互補配對的原則使它們的祀信使核糖核酸（mRNA) 被降解或抑制它們的翻譯，這種廣泛的對靶基因表達的調控過程與疾病的發生發展密切相 關。因而，siRNA和miRNA近年來已經被視為可通過RNAi實現治療目的的一類新型的先導 藥物。然而，siRNA和miRNA的藥物作用機制包括在體內運輸、體內分布、作用靶點、相互作 用的其他生物分子、可能的毒副作用等仍然處于未知階段，亟需發展一類新型方法解決以 上siRNA和miRNA藥物應用中未知的問題。
[0003] 光點擊化學反應是一類新型的生物正交反應，可實現對生物大分子的修飾和熒光 標記。本發明中，發明人發現了可利用光點擊化學反應實現對siRNA和miRNA的熒光標記、 分子修飾、靶點分離鑒定、其他相互作用生物分子的分離鑒定以及以此對siRNA和miRNA藥 物應用中毒副作用的評估。
【發明內容】
[0004] 解決的技術問題：本發明提供可發生光點擊化學反應的小分子RNA及其制備方法 和應用，結合光點擊化學反應實現對siRNA和miRNA的熒光標記、分子修飾、靶點分離鑒定、 其他相互作用生物分子的分離鑒定以及以此對siRNA和miRNA藥物應用中毒副作用的評 估。
[0005] 技術方案：可發生光點擊化學反應的小分子RNA，結構如下：
[0006]
[0007] 其中RNA代表任意的siRNA或miRNA，X為二硫鍵、酰胺鍵、酯鍵或醚鍵，且X連接 在siRNA或miRNA的正義鏈或反義鏈的3'端或5'端，Y為含一至十個碳的烷基、低聚或多 聚乙二醇，Z為二硫鍵、酰胺鍵、酯鍵、醚鍵、含一至十個碳的烷基、低聚或多聚乙二醇中的任 意一種，Tet為可發生光點擊化學反應的四氮唑類化學小分子，其化學結構如下：
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[0009] 其中ArJPAr2為苯環或萘環，R「1?14分別為氫、氮、氧、硫、含有一至十個碳的烷基、 低聚或多聚乙二醇、烯丙基、炔丙基、疊氮、酰基或酯基、3-烯丙氧基或4-烯丁氧基，Z連接 在Ar^Ar2的任意位置上。
[0010]所述RNA為miR-122。
[0011] 所述Tet為
[0013] 所述可發生光點擊化學反應的小分子RNA的結構式為：
[0016]所述可發生光點擊化學反應的小分子RNA的制備方法，工藝路線為：
[0017]
.〇
[0018] 上述方法優選為，采用琥珀酰亞胺活化小分子化合物的羧基，再與修飾有氨基的 RNA進行縮合，其反應體系為pH= 7. 4的DMS0/PBS。
[0019] 上述小分子RNA在標記、成像中的應用。
[0020] 上述小分子RNA在其靶信使核糖核酸分離鑒定中的應用。
[0021] 上述小分子RNA在制備核糖核酸干擾藥物中的應用。
[0022] 上述小分子RNA在鑒定與其相互作用的不同生物分子中的應用。
[0023] 本發明采用現代分子生物學和化學生物學的方法研究四氮唑類小分子修飾的 siRNA和miRNA在核糖核酸干擾中的應用。
[0024] (一）四氮唑類化學小分子的合成
[0025] 四氮唑類化學小分子合成的合成路線為：
[0027](二）siRNA和miRNA的修飾
[0029] (三）siRNA和miRNA的標記
[0030] 通過四氮唑類化學小分子與雙鍵修飾的功能分子之間的光點擊化學反應實現對 siRNA和miRNA不同的功能性的修飾。
[0031] (四）熒光素酶實驗
[0032] 通過四氮唑類化學小分子修飾的siRNA和miRNA刺激細胞內的熒光素酶信號變化 判斷其的生物活性，具體流程如下：
[0033] (1)構建含有siRNA或miRNA結合位點的熒光素酶質粒；
[0034] (2)將質粒和四氮唑類化學小分子修飾的siRNA和miRNA共轉染到細胞中；
[0035] (3)測定熒光素酶信號。
[0036] (五）拉下實驗
[0037] 結合光點擊化學反應，將生物素連接到siRNA和miRNA上，并利用生物素與鏈霉素 間強親和作用對細胞內與siRNA和miRNA作用的生物分子進行分離，并對其進行相應的鑒 定。具體流程如下：
[0038] (1)將四氮唑類化學小分子修飾的siRNA或miRNA轉染到細胞中；
[0039] (2)在細胞裂解，通過光點擊化學反應將生物素連接到siRNA或miRNA上；
[0040] (3)將得到的siRNA或miRNA與帶有鏈霉素的磁珠作用，使siRNA或miRNA及與之 相互作用的生物分子固定到磁珠表面；
[0041] (4)分離磁珠上的生物分子；
[0042] (5)利用熒光定量PCR對分離的siRNA或miRNA進行分析定量；
[0043] (6)利用熒光定量PCR對分離的與siRNA或miRNA相互作用的靶信使核糖核酸進 行分離鑒定；
[0044] (7)對與siRNA或miRNA相互作用的蛋白進行電泳分離，蛋白印跡分析或銀染分 析、蛋白質譜分析。
[0045] (六）siRNA和miRNA的熒光成像
[0046] 通過光點擊化學反應對活細胞內的siRNA和miRNA進行熒光成像，具體流程如 下：
[0047] (1)將四氮唑類化學小分子修飾的siRNA或miRNA轉染到細胞中；
[0048] (2)用雙光子激發四氮唑的分子內光點擊化學反應；
[0049] (3)對siRNA或miRNA進行熒光成像。
[0050] (七）細胞凋亡檢測
[0051] 測定通過光點擊化學反應標記的siRNA和miRNA刺激后細胞活力，具體流程如 下：
[0052] (1)用標記的siRNA和miRNA轉染到細胞內對細胞進行刺激；
[0053] (2)利用流式細胞儀對細胞凋亡進行測定。
[0054] 有益效果：本發明提供可發生光點擊化學反應的小分子RNA及其制備方法和應 用，結合光點擊化學反應實現對siRNA和miRNA的熒光標記、分子修飾、靶點分離鑒定、其他 相互作用生物分子的分離鑒定以及以此對siRNA和miRNA藥物應用中毒副作用的評估。
【附圖說明】
[0055] 圖1為四氮唑類化合物1的核磁氫譜；
[0056] 圖2為四氮唑類化合物1的核磁碳譜；
[0057] 圖3為四氮唑類化合物2的核磁氫譜；
[0058] 圖4為四氮唑類化合物2的核磁碳譜；
[0059] 圖5為四氮唑類化合物3的核磁氫譜；
[0060] 圖6為四氮唑類化合物3的核磁碳譜；
[0061] 圖7為四氮唑類化合物1修飾miR-122的熒光素酶實驗結果；
[0062] 圖8為四氮唑類化合物1修飾miR-122的下拉實驗中miR-122分析結果；
[0063] 圖9為四氮唑類化合物1修飾miR-122的下拉實驗中miR-122的靶mRNA分析結 果；
[0064] 圖10為四氮唑類化合物1修飾miR-122的下拉實驗中miR-122的相互作用蛋白 (AG02)分析結果；
[0065] 圖11為四氮唑類化合物2和3修飾miR-122的熒光成像結果。
【具體實施方式】
[0066] 實施例1、四氮唑化學小分子1的合成
[0068] (1)化合物la(1. 5g，lOmmol)和對甲基苯磺酰肼（1. 86g，lOmmol)溶于甲醇 (50mL)及水（50mL)中，室溫攪拌5分鐘，析出大量白色固體，過濾得lb3g(產率93%)。
[0069] (2)苯胺重氮鹽是通過將2mL冷的亞硝酸鈉溶液（5mmol)在5°C以下倒入含有 1. 3mL濃鹽酸（37. 5wt. % )的苯胺（5mmol)的50vt. %乙醇水溶液中制備得到。將重氮鹽 滴加到30mL溶有lb(1. 6g，5mmol)的吡啶溶液中，控制反應溫度在-10°C至-15°C。滴加完 全后繼續反應3小時后，用二氯甲烷和水萃取反應，有機層合并后用稀鹽酸（質量濃度不超 過20% )洗滌并用無水硫酸鈉干燥。減壓蒸餾去除溶劑后，通過柱層析提出得到黃色粉末 lc0. 7g(產率 53% )。
[0070] (3)lc(0. 6g，2. 5mmol)溶解于Diox