一種密碼子植物化改造的pmi基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種密碼子植物化改造的PMI(phosphomannose?isomerase，磷酸甘露糖異構酶)基因，本發明利用水稻優化密碼子設計合成了PMI基因。并且本發明提供一種表達盒和一種表達載體，以及該表達盒和表達載體在遺傳轉化方面的應用。本發明利用改造的PMI基因構建植物表達載體，以甘露糖為篩選劑，將外源基因導入水稻細胞中。本發明實現了水稻的高效遺傳轉化，這是因為經過密碼子植物化改造的plant?PMI的轉化效率顯著提高。
【專利說明】一種密碼子植物化改造的PMI基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術和植物基因工程【技術領域】。具體而言，本發明涉及一種密碼 子經過植物化改造的PMI基因，及其作為篩選標記，在植物遺傳轉化方面的應用。
【背景技術】
[0002] 轉基因技術，是20世紀80年代初發展起來的一種有效的植物定向改良方法。該 技術主要通過農桿菌介導、基因槍轉化等方法將目的基因導入受體，經過標記篩選和分子 檢測，獲得穩定表達的轉化體，實現目標性狀的快速定向改良，具有可用基因資源廣、改良 效率高等優點。轉基因技術為農作物的產量提升、品質改良和抗性增強提供了新路徑、開拓 了新空間。
[0003] 但現有轉基因技術，主要使用抗生素抗性基因作為篩選標記，該類基因可能隨食 物進入腸道，存在與腸道微生物基因交換產生耐藥菌株的潛在風險，以致影響抗生素的醫 用效果。為了替代抗生素抗性基因，其他類型篩選標記基因被陸續研究開發，如除草劑抗性 基因、氨基酸代謝篩選基因、可視標記基因等，但這些篩選標記基因要么存在類似問題，要 么篩選效率和成本不適于規模化應用。
[0004] 而PMI是一種糖代謝基因，廣泛存在于藻類和一些豆科植物中。水稻等高等植物 細胞雖能將甘露糖轉化為6-磷酸甘露糖，但由于細胞自身缺乏PMI，不能進一步將6-磷酸 甘露糖轉化為6-磷酸果糖，從而進入糖酵解途徑而被利用，因此PMI可以作為篩選標記基 因。與抗生素、除草劑等負選擇不同，甘露糖是進行正選擇，轉化的細胞表達PMI基因，可以 利用甘露糖為碳源而正常生長，篩選效率高。同時，甘露糖是廣泛存在于海藻、蕨類等植物 中的己糖，且PMI的催化產物為6-磷酸果糖，是蜂蜜和果漿的主要成份，二者都是環境友好 的天然物質。
[0005] 但現在使用的PMI是從原核生物大腸桿菌中分離出來的，而原核生物和真核生物 存在不同的密碼子偏好和堿基組成。例如以水稻為代表的單子葉植物，其GC含量高，較細 菌及雙子葉植物等物種，密碼子偏好性強。因此直接使用未經人工優化設計的PMI，會影響 其在真核細胞中的表達效率，并影響其作為篩選標記的使用效果。此外，由于PMI來自于大 腸桿菌，可能對轉化受體基因組造成不利影響，還可能引發對其安全性的擔憂。
【發明內容】
[0006] 針對上述問題，本發明希望對PMI進行密碼子植物化改造。本發明旨在將PMI基 因對密碼子經過植物化改造，并作為篩選標記，應用于植物遺傳轉化。
[0007] 具體而言，在第一個方面，本發明提供一種密碼子植物化改造的PMI基因，命名為 plant PMI，該基因具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，該序列是以模式作物水稻密碼子 偏好進行優化，即在維持編碼氨基酸序列不變的前提下，用水稻偏好密碼子替換原有密碼 子，得到植物化改造的plant PMI序列，再經過化學合成而來。
[0008] 在第二個方面，本發明提供一種含有所述plant PMI基因的植物表達載體。構建 方法是利用Xho I酶切位點，用Xho I酶切pCAMBIA1381載體并回收，由于合成的plant PMI 序列兩端加有Xho I酶切位點，可以利用T4連接酶將plant PMI連接到pCAMBIA1381載體， 得到植物表達載體pCAMBIA1381-plant PMI。
[0009] 另一方面，本發明提供一種表達盒，其特征在于，所述表達盒中包含上述的PMI基 因。
[0010] 另一方面，本發明提供一種上述基因、表達盒或載體的應用，其特征在于，所述應 用包括利用所述密碼子植物化改造的PMI基因作為篩選標記，獲得轉基因植物或植物部 分。
[0011] 優選地，所述植物包括：糧食作物、蔬菜作物、花卉作物、能源作物。
[0012] 優選地，所述植物部分包括：細胞、原生質體、細胞組織培養物、愈傷組織、細胞塊、 胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、葉、根、根尖、花藥和種子。
[0013] 在另一個方面，本發明提供一種利用pCAMBIA1381-plant PMI表達載體（其含有所 述密碼子植物化改造的PMI基因），將外源基因導入水稻細胞的方法，包括下述步驟：
[0014] (1)將水稻種子去殼、滅菌后將胚分離出來，置于愈傷組織誘導培養基上以產生次 級愈傷組織；
[0015] (2)將次級愈傷組織轉移至新的愈傷組織誘導培養基預培養；
[0016] (3)將步驟（2)中獲得的愈傷組織與攜帶plant PMI篩選標記基因的農桿菌接觸 15分鐘；
[0017] (4)將步驟（3)的愈傷組織轉移到上墊上三張無菌濾紙（加入2. 5-3. 5mL農桿菌 懸浮培養基）的培養皿中，21-23°C培養48小時；
[0018] (5)將步驟（4)的愈傷組織置于前篩選培養基上培養5-7天；
[0019] (6)將步驟（5)的愈傷組織轉移篩選培養基上，以獲得抗性愈傷組織；
[0020] (7)將抗性愈傷組織轉移到分化再生培養基中分化成苗；和
[0021] (8)將步驟（7)的苗轉移到生根培養基中生根。
[0022] 其中所述步驟（1)中的種子是成熟種子；所述步驟（1)、（2)中的誘導培養基是說 明書表1所列出的誘導培養基；所述步驟（3)中的與農桿菌接觸是將愈傷組織浸泡在所述 農桿菌懸浮液中；所述步驟（4)中的農桿菌懸浮培養基是說明書表1所列出的懸浮培養基； 所述步驟（5)中的前篩選培養基是說明書表1所列出的前篩選培養基；所述步驟￠)中的 篩選培養基是說明書表1所列出的篩選培養基；所述步驟（7)中的分化再生培養基是說明 書表1所列出的分化再生培養基；所述步驟（8)中的生根培養基是說明書表1所列出的生 根培養基。
[0023] 在優選的實施方案中，其中所述水稻是粳稻，更優選地，所述水稻是粳稻日本晴。
[0024] 表1培養基的示例性配方
[0025]
【權利要求】
1. 一種密碼子植物化改造的PMI基因，其特征在于，該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. -種表達盒，其特征在于，所述表達盒中包含權利要求1所述的PMI基因。
3. -種表達載體，其特征在于，所述表達載體包含權利要求1所述的PMI基因或權利要 求2所述的表達盒。
4. 一種權利要求1-3所述的基因、表達盒或載體的應用，其特征在于，所述應用包括利 用所述密碼子植物化改造的PMI基因作為篩選標記，獲得轉基因植物或植物部分。
5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述植物包括：糧食作物、蔬菜作物、花卉 作物、能源作物。
6. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述植物部分包括：細胞、原生質體、細胞 組織培養物、愈傷組織、細胞塊、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、葉、根、根尖、花藥和種 子。
7. -種利用含有權利要求1中所述的密碼子植物化改造的PMI基因的表達載體 pCAMBIA1381-plant PMI，將外源基因導入水稻細胞的方法，包括下述步驟： (1) 將水稻種子去殼、滅菌后將胚分離出來，置于愈傷組織誘導培養基上以產生次級愈 傷組織； (2) 將所述次級愈傷組織轉移至新的愈傷組織誘導培養基進行預培養，獲得愈傷組 織； (3) 將步驟（2)中獲得的愈傷組織與農桿菌接觸15分鐘，其中，所述農桿菌中引入了所 述表達載體，所述表達載體中攜帶所述密碼子植物化改造的PMI基因； (4) 將步驟（3)處理后的愈傷組織轉移到其上墊有無菌濾紙的培養皿中，21-23°C培養 48小時； (5) 將步驟（4)處理后的愈傷組織置于前篩選培養基上培養5-7天； (6) 將步驟（5)處理后的愈傷組織轉移篩選培養基上，以獲得抗性愈傷組織； (7) 將所述抗性愈傷組織轉移到分化再生培養基中分化成苗；和 (8) 將步驟（7)中所獲得的苗轉移到生根培養基中生根。
【文檔編號】A01H5/00GK104046636SQ201410276408
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月19日 優先權日:2014年6月19日
【發明者】李莉, 楊劍波, 魏鵬程, 宋豐順, 李 浩, 楊亞春, 倪大虎, 汪秀峰, 馬卉, 秦瑞英, 陸徐忠, 倪金龍 申請人:安徽省農業科學院水稻研究所