一種四倍體矮牽牛的誘變方法
【專利摘要】本發明公開了一種四倍體矮牽牛的誘變方法，該方法為：在二倍體矮牽牛2片子葉完全展開時期，用二甲戊樂靈和秋水仙素的混合藥液滴到附著在2子葉之間生長點上，進行變溫處理。處理后的植株與對照比較，選擇葉片增大，葉片增厚、莖增粗，株高增加，柱頭、花藥和萼片變大等多個農藝性狀發生變化，和解剖學性狀如葉背氣孔和花粉粒明顯變大的植株作為變異植株，最后進行細胞學的鑒定，采集變異植株的幼小花蕾，觀察雌蕊柱頭體細胞有絲分裂中期分裂相，選擇染色體數目2n=28的植株確定為四倍體植株。本發明處理時間短、誘變效率高，鑒定方法對儀器要求低，操作簡單易行，具有較好的應用前景。
【專利說明】一種四倍體矮牽牛的誘變方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于園藝植物育種領域，具體涉及到一種四倍體矮牽牛的誘變方法。
【背景技術】
[0002]植物多倍體是指體細胞中含有三個或三個以上染色體組，因具有巨大性、抗逆性強、結實性低和營養成分高等特點而得到廣泛應用，多倍體化不僅能使植株基因活性及酶的差異性增強，而且還增強了植株的生態適應性、對逆境的抗耐性以及提高了光合效率等，對植株的生長量和某些生物產量、營養成分含量和品質有促進作用。研究植物的多倍體具有重要意義，不僅為植物進化提供大量的證據，而且在生產實踐上也具有廣泛的應用價值，在現代育種中具有廣闊前景。
[0003]許多植物都可以通過自然突變產生四倍體，但因其變異率很低，不能滿足人們對四倍體品種的需求。所以各國的科學工作者都在不斷的探索新的高效誘變四倍體的途徑，目前人工誘變主要采取物理誘變法和化學誘變法二種方法。
[0004]人工物理誘變主要是使用X射線、Y射線、紫外線、P射線和中子及Cl重離子為誘變源。吳明珠等早在1983年通過6tlC射線為輻射源獲得了甜瓜短蔓多倍體變異株。利用高空環境具有高真空、微重力、高能粒子輻射、超凈、無晝夜變化等空間誘變技術，可從中篩選出具有優良特性的變異植株，通過太空搭載誘變已獲得一些在生產上大面積的推廣的蔬菜品種。空間誘變效果顯著，變異類型廣泛，可得到各種變異類型，但其誘變效果不穩定、重復性差，難以在育種實踐中應用。
[0005]化學方法誘變是目前應用最廣泛的方法，主要誘變劑有秋水仙素、吲哚乙酸、萘駢乙燒、完萎腦、苯及其衍生物、有機神制劑、有機萊制劑(富民隆)等。秋水仙素是最常用的化學誘變劑，它與正在有絲分裂的細胞接觸后，著絲點連接的姊妹染色體還是能夠正常分離，但秋水仙素可抑制微管的聚合過程不能形成紡錘絲，使染色體不能排在赤道板上也不能分向細胞的兩極，使細胞不發生分裂不能形成兩個子細胞，因而最后就形成了染色體加倍的細胞。通過此方法已成功獲得了很多多倍體農作物品種如培養出多倍體蘋果、柑橘、葡萄、金絲小棗、西瓜、白菜、黃瓜、番茄、不結球白菜、花椰菜、芹菜、蘿卜、金魚草、百合、香石竹、君子蘭等。
[0006]矮牽牛(Petunia hybrida Vilm.)又名碧冬爺為爺科碧冬爺屬植物,為一年生草本花卉。矮牽牛花朵碩大，色彩豐富，花型變化頗多，目前矮牽牛在國際上已成為主要的盆花和裝飾植物，廣泛應用于庭院、露天花壇、廣場的美化裝飾與綠化，被喻為“世界花壇花卉之王”。我國矮牽牛于20世紀初開始引種栽培，僅在大城市有零星栽培，直到80年代初，開始從美國、荷蘭、日本等國引進新品種，作為花壇后起之秀市場對矮牽牛需求越來越大，目前國內廣泛種植的優良矮牽牛品種如重瓣“雙瀑布”系列、大花“夢幻”系列、多花單瓣“慶典”系列和吊藍等系列都為二倍體品種，利用多倍體誘變技術獲得觀賞性更高、抗逆性和適應性強的多倍體品種具有十分良好的應用前景，但對矮牽牛目前尚無多倍體化學誘變的發明報道。
[0007]現有秋水仙素誘導多倍體方法往往存在著幼苗死亡率高，誘導成功率較低(通常都低于10% )，容易形成嵌合體植株。誘變植株倍性細胞學鑒定一般將根尖作為檢測對象，檢測材料少且根尖切去后對植株生長影響較大，如采用對細胞核內DNA含量進行測定的方法，需要采用流式細胞儀，儀器昂貴、操作程序復雜技術要求高。
【發明內容】
[0008]為了克服現有誘導與鑒定技術的不足，本發明的目的在于提供了一種四倍體矮牽牛的誘變和鑒定方法，采用該方法能提高多倍體的誘變率，倍性鑒定時采用幼小花蕾作為鑒定材料，材料充足對植株生長不會產生影響，對儀器要求不高、操作過程相對簡單易行。
[0009]為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案為:一種四倍體矮牽牛的誘變方法，該方法包括如下步驟:
[0010](I)將矮牽牛種子播種在穴盤中，當幼苗2片子葉完全展開時，將脫脂棉放在2片子葉中間，與生長點緊密接觸。2片子葉時期是比較好的時期，早或者晚效果不好，早了多倍體誘導效率低，晚了嵌合體比較多。
[0011](2)將穴盤放置于光照培養箱中，每天早8點和下午3點進行處理，用質量濃度為1%的二甲基亞砜(DMSO)配制的二甲戍樂靈(Pendimethalin)6_60mg/L和秋水仙素質量濃度為0.1% -1%混合藥液滴到附著在2子葉之間的脫脂棉上，對子葉展開期的二倍體矮牽牛幼苗進行處理，每天處理2次持續處理3天，采取變溫處理，每次處理前3小時光照培養箱溫度設定為15°C，處理后溫度升高設定為30°C。處理結束繼續在光照培養箱中生長5天后，移入溫室大棚中。
[0012](3)當誘變植株生長發育進入成株后，與對照初步進行農藝性狀如葉片長度與寬度、葉片厚度、莖粗、株高、萼片長度與寬度、柱頭和花藥大小的比較，接著進行包括葉背氣孔和花粉細胞大小比較鑒定，選擇多個農藝性狀和解剖學性狀明顯增加的變異植株，并在此基礎上進行細胞學鑒定。于晴天早晨8:00-10:00取長度4?7mm的幼蕾，先置于0.002mol.1^8-羥基喹啉水溶液中預處理3小時，蒸餾水沖洗3次后轉入卡諾氏固定液固定24小時，蒸餾水沖洗3次在lmol.L-1HCl溶液60°C水浴解離5分鐘，蒸餾水沖洗3次用濾紙吸干水，放入45% (體積百分濃度)醋酸溶液配制的1% (質量百分濃度)洋紅染色液染色10小時。用鑷子將幼蕾移入干凈的載玻片上，用刀片切取雌蕊柱頭部位，滴1-2滴I %洋紅染色液，蓋上蓋玻片，用濾紙吸去多余洋紅染色液。蓋玻片上覆蓋4-5層濾紙，用鉛筆一端垂直敲打10余下，使材料盡量分散壓平，最后用大拇指垂直按壓，制片在酒精燈烘烤1-2秒。先在低倍鏡下尋找有絲分裂中期分裂相視野，然后在10X100倍油鏡下進行染色體計數。
[0013]步驟⑵中，所述藥液的配制方法為:先配制質量濃度為1%二甲基亞砜溶液，再根據計算結果往里面添加二甲戊樂靈和秋水仙素，其中二甲戊樂靈是質量濃度為33%的乳油，即1000毫升乳油中有330克二甲戊樂靈。
[0014]有益效果:與現有技術相比，本發明所的優點在于:
[0015]1、誘導劑的選擇:本發明采用二甲戍樂靈(Pendimethalin)為誘導劑,二甲戍樂靈為二硝基甲苯類除草劑(DNH)，較低濃度下仍與微管蛋白具有高度親和性能形成復合體，通過干擾紡錘絲形成從而抑制細胞分裂中期的有絲分裂，使染色體加倍，與秋水仙素一起使用可提高誘導率，還可降低秋水仙素使用濃度，減少對幼苗的毒害降低死亡率。使用二甲基亞砜可利于誘變劑滲透發揮誘導作用。
[0016]2、變溫處理:處理前設定溫度為15°C，可抑制和減緩幼苗生長點有絲分裂活動，處理后提高至30°C加速生長點有絲分裂活動，使更多生長點分生細胞處于有絲分裂期，促使誘變率提高。
[0017]3、本發明中的鑒定方法:多倍體與二倍體植株比較一般具有巨大性，當誘變植株生長發育進入成株后，先進行農藝性狀如葉片長度與寬度、葉形指數(葉長/葉寬)、葉片厚度、莖粗、株高、萼片長度與寬度、柱頭和花藥大小等和解剖學性狀如葉背氣孔和花粉細胞大小比較，選擇多項指標顯著增加的變異植株，可減少細胞學鑒定工作量。細胞學倍性鑒定時采用幼小花蕾作為鑒定材料，取樣材料充足對植株生長也不會產生影響，體細胞有絲分裂觀察對儀器要求不高，一般光學顯微鏡即可，操作過程相對簡單易行。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為葉片比較圖；上排為二倍體品種‘梅林’，下排為誘變四倍體；
[0019]圖2為株高、莖粗比較圖；右為二倍體品種‘梅林’，左為誘變四倍體；
[0020]圖3為柱頭比較圖；左為二倍體品種‘梅林’，右為誘變四倍體；
[0021]圖4為萼片比較圖；右為二倍體品種‘梅林’，左為誘變四倍體；
[0022]圖5為花藥比較圖；左為二倍體品種‘梅林’，右為誘變四倍體；
[0023]圖6為氣孔比較(標尺為1um)圖；右為二倍體品種‘梅林’，左為誘變四倍體；
[0024]圖7為花粉比較(標尺為1um)圖；右為二倍體品種‘梅林’，左為誘變四倍體；
[0025]圖8為柱頭體細胞有絲分裂中期染色體數目比較圖；右為二倍體品種‘梅林’2n =14，左為誘變四倍體2n = 28。
【具體實施方式】
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[0026]下面通過具體實施例對本發明做進一步的詳細說明。
[0027]實施例1: 一種四倍體矮牽牛的誘變方法，
[0028]I材料與方法
[0029]1.1材料矮牽牛‘梅林’種子來源于浙江虹越花卉有限公司
[0030]1.2誘變處理
[0031](I)矮牽牛‘梅林’種子播種在穴盤中，穴盤內的基質為草炭土:珍珠巖:田園土按質量比例6:1:1混合，當幼苗2片子葉完全展開時，將脫脂棉放在2片子葉中間，與生長點緊密接觸。
[0032](2)將穴盤放置于光照培養箱，光照強度設置為40001x，溫度為30°C，每天早8點和下午3點進行處理，用質量濃度為1%的二甲基亞砜(DMSO)配制的二甲戊樂靈(Pendimethalin) 6-60mg/L和秋水仙素質量濃度為0.1% -1 %混合藥液滴到附著在2子葉之間的脫脂棉上，確保藥液浸潤到生長點，每天處理2次持續處理3天。采取變溫處理，每次處理前3小時光照培養箱溫度設定為15°C，處理后溫度升高設定為30°C，并以誘變處理前后恒溫30°C和分別單獨使用二甲戊樂靈、秋水仙素作為參照。誘變處理結束3小時后去掉脫脂棉，并用噴壺將幼苗沖洗去除殘留藥液，繼續在光照強度設置為40001χ，溫度為30°C的光照培養箱中生長5天后，移入溫室大棚中。
[0033]上述混合藥液的配制方法為:先配制質量濃度為1%二甲基亞砜溶液(二甲基亞砜的液體密度為1.lg/ml),再根據計算結果添加二甲戊樂靈和秋水仙素；其中二甲戊樂靈是在市面買到的二甲戊樂靈，它是質量濃度為33%的乳油，即1000毫升乳油中有330克二甲戊樂靈，可較好溶解于水，秋水仙素要先溶解于乙醇中再加入水溶液。如配制IL混合藥液方法是先在水溶液中加入0.909ml 二甲基亞砜，混勻后再加入33%二甲戊樂靈乳油18.2-182ul，再加入秋水仙素1-1Og (先將秋水仙素溶解于10_20ml左右少量乙醇中)，最后用水定容至IL體積，即可。
[0034]1.3多倍體鑒定
[0035]1.3.1農藝性狀和解剖學鑒定
[0036]當處理植株生長發育進入成株后，初步進行農藝性狀如葉片長度與寬度、葉片厚度、株高、莖粗、萼片、柱頭和花藥大小的測量，與對照植株進行比較初步。接著進行解剖學鑒定包括葉背氣孔和花粉細胞大小比較，觀察氣孔方法為:用尖頭鑷子將葉片背面表皮撕下，放置于載玻片上，滴一滴清水在40倍顯微鏡下用具有顯微測微標尺的目鏡觀察葉背保衛細胞長與寬。觀察花粉細胞方法為:從開放花朵中取少量成熟花粉，放置于載玻片上，滴一滴質量濃度為I %醋酸洋紅溶液染色，5分鐘后在40倍顯微鏡下用具有顯微測微標尺的目鏡測量花粉細胞大小。
[0037]1.3.2細胞學鑒定
[0038]選取多項農藝性狀和解剖學性狀顯著大于對照的誘變植株，在初步鑒定基礎上繼續進行細胞學鑒定，步驟為于晴天早晨8:00-10:00取長度4?7mm的幼蕾，先置于
0.002mol.1^8-羥基喹啉水溶液中預處理3小時，蒸餾水沖洗3次后轉入卡諾氏固定液固定24小時，蒸餾水沖洗3次在lmol.L-1HCl溶液60°C水浴解離5分鐘，蒸餾水沖洗3次用濾紙吸干水，放入45% (體積百分濃度)醋酸溶液配制的1% (質量濃度)洋紅染色液染色10小時。用鑷子將幼蕾移入干凈的載玻片上，用刀片切取雌蕊柱頭部位，滴1-2滴I %洋紅染色液，蓋上蓋玻片，用濾紙吸去多余洋紅染色液。蓋玻片上覆蓋4-5層濾紙，用鉛筆一端垂直敲打10余下，使材料盡量分散壓平，最后用大拇指垂直按壓，制片在酒精燈烘烤1-2秒。先在低倍鏡下尋找有絲分裂中期分裂相視野，然后在10X 100倍油鏡下進行染色體計數。
[0039]其中，所述體積百分濃度45%醋酸溶液配制的1% (質量濃度)洋紅染色液配制方法為:先加入45ml乙酸再加水55ml，混勻后將洋紅粉末I克緩慢倒入100ml45%醋酸溶液中，邊煮邊攪拌，煮沸冷卻后過濾即可使用。
[0040]2.結果與分析
[0041]2.1多倍體與二倍體農藝性狀和解剖學比較
[0042]誘變后形成多倍體植株葉片比對照二倍體植株相同節位的葉片明顯變大,其中多倍體第4-10片真葉平均長度、寬度分別為5.63厘米、4.97厘米，對照二倍體相應值為4.6厘米、3.05厘米，分別增加了 22.4^^63% (圖1)。多倍體植株成熟葉片平均厚度為1.4毫米，相比對照二倍體植株成熟葉片平均厚度為0.95毫米增加47.4%。多倍體植株平均株高為19.5厘米，莖粗0.93厘米，對照二倍體植株株高12.0厘米，莖粗0.43厘米，株高和莖粗分別增加62.5%、116.3% (圖2)。多倍體植株柱頭平均直徑為2.97毫米，比對照二倍體植株柱頭直徑2.34毫米增加26.9% (圖3)。多倍體植株萼片平均長度、寬度分別為1.47厘米、0.41厘米，比對照二倍體植株萼片平均長度、寬度分別為1.32厘米、0.36厘米分別增加11.4%,13.9% (圖4)。多倍體植株花藥平均長度、寬度分別為3.32毫米、2.48毫米，比對照二倍體植株花藥平均長度、寬度分別為2.12毫米、1.82毫米花藥分別增加56.6%、36.3% (圖 5)。
[0043]多倍體植株氣孔平均長度、寬度分別為47.5um、32.5um，比對照二倍體植株氣孔平均長度、寬度分別為35um、27.5um，分別增加35.7%U8.2% (圖6)。多倍體植株的花粉形態特征多為圓形或近似四邊形，直徑3 40um，有4個萌發孔，外形皺縮畸形、染色淺或不染色不育花粉比率在38.3% -69.1%之間；對照二倍體的η花粉形態特征一般為圓形或者近似三角形，直徑=35um，有3個萌發孔，不育花粉比率較低彡7.9% (圖7)。
[0044]2.2細胞學比較
[0045]二倍體雌蕊柱頭體細胞有絲分裂中期染色體數目2n = 14 (圖8右)，多倍體植株雌蕊柱頭體細胞有絲分裂中期染色體數目2n = 28(圖8左)，表明為四倍體。
[0046]2.3不同藥劑和溫度處理誘導效果的比較
[0047]表I不同藥劑配方和溫度處理誘變效果的比較
[0048]
【權利要求】
1.一種四倍體矮牽牛的誘變方法其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)將矮牽牛種子播種在穴盤中，當幼苗2片子葉完全展開時，用吸附液體效果較好的介質放在2片子葉中間，與生長點緊密接觸； (2)將穴盤放置于光照培養箱中，每天早8點和下午3點進行變溫處理，處理方法為:用質量濃度為1%的二甲基亞砜配制的二甲戊樂靈6-60mg/L和質量濃度為0.1%_1%的秋水仙素混合后得到的藥液滴到附著在2片子葉之間的介質上，對子葉展開期的二倍體矮牽牛幼苗進行誘導處理，每天處理2次持續處理3天； (3)將處理結束的幼苗繼續在光照培養箱中生長5天后，移入溫室大棚中； (4)當誘變植株生長發育進入成株后，初步進行農藝性狀、解剖學鑒定，在此基礎上進行細胞學鑒定，選擇染色體數目2n=28的植株確定為四倍體植株。
2.根據權利要求1所述的四倍體矮牽牛的誘變方法，其特征在于，步驟(2)中，光照培養箱中，光照強度設定為40001x。
3.根據權利要求1所述的四倍體矮牽牛的誘變方法，其特征在于，步驟(2)中，所述變溫處理的方法為:每次處理前3小時光照培養箱溫度設定為15°C，處理后溫度設定為30°C。
4.根據權利要求1所述的四倍體矮牽牛的誘變方法，其特征在于，步驟(2)中，所述藥液的配制方法為:先配制質量濃度為1% 二甲基亞砜溶液，再根據計算結果往里面添加二甲戊樂靈和秋水仙素，其中二甲戊樂靈是質量濃度為33%的乳油。
5.根據權利要求1所述的四倍體矮牽牛的誘變方法，其特征在于，步驟(4)中觀測的農藝性狀有:葉片長度與寬度、葉片厚度、莖粗、株高、萼片長度與寬度、柱頭和花藥大小。
6.根據權利要求1所述的四倍體矮牽牛的誘變方法，其特征在于，步驟(4)中解剖學觀察性狀有葉背氣孔和花粉細胞的大小，觀察氣孔方法為:用尖頭鑷子將葉片背面表皮撕下，放置于載玻片上，滴一滴清水在40倍顯微鏡下用具有顯微測微標尺的目鏡測量氣孔長與寬；觀察花粉細胞方法為:從開放花朵中取少量成熟花粉，放置于載玻片上，滴一滴質量濃度為1%醋酸洋紅染色，5分鐘后在40倍顯微鏡下用具有顯微測微標尺的目鏡測量花粉細胞大小。
7.根據權利要求1所述的四倍體矮牽牛的誘變方法，其特征在于，步驟(4)中細胞學鑒定方法為:于晴天早晨8:00-10:00取長度Γ7πιπι的幼蕾，先置于0.00211101.171 8-羥基喹啉水溶液中預處理3小時，蒸餾水沖洗3次后轉入卡諾氏固定液固定24小時，蒸餾水沖洗3次在I mol.L^1HCl溶液60°C水浴解離5分鐘，蒸餾水沖洗3次用濾紙吸干水，放入45% (體積百分濃度)醋酸溶液配制的1% (質量濃度)洋紅染色液染色10小時；用鑷子將幼蕾移入干凈的載玻片上，用刀片切取雌蕊柱頭部位，滴1-2滴1%洋紅染色液，蓋上蓋玻片，用濾紙吸去多余洋紅染色液；蓋玻片上覆蓋4-5層濾紙，用鉛筆一端垂直敲打10余下，使材料盡量分散壓平，最后用大拇指垂直按壓，制片在酒精燈烘烤1-2秒；先在低倍鏡下尋找有絲分裂中期分裂相視野，然后在1X 100倍油鏡下進行染色體計數。
8.根據權利要求7所述的四倍體矮牽牛的誘變方法，其特征在于，所述卡諾氏固定液是由無水乙醇和冰醋酸按體積比3:1制成的。
9.根據權利要求7所述的四倍體矮牽牛的誘變方法，其特征在于，所述體積百分濃度45%醋酸溶液配制的1%(質量濃度)洋紅染色液配制方法為:先加入45ml乙酸再加水55ml，混勻后將洋紅粉末I克緩慢倒入10ml 45%醋酸溶液中，邊煮邊攪拌，煮沸冷卻后過濾即可
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【文檔編號】A01H1/08GK104160953SQ201410387594
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月7日 優先權日:2014年8月7日
【發明者】魏躍, 嵇怡, 樊開青, 劉艷, 張瑩, 史紅林, 陳嘯寅, 顏志明, 王全智, 賈思振, 董慧 申請人:江蘇農林職業技術學院