毛葡萄莖尖的包埋干燥超低溫保存方法
【專利摘要】本發明公開了一種毛葡萄莖尖的包埋干燥超低溫保存方法，其特征在于：包括以下步驟：(1)莖尖包埋干燥超低溫冷凍保存：取繼代腋芽飽滿的組培苗，在光照低溫鍛煉，后剝取組培苗腋芽莖尖，制成莖尖包埋丸，再將包埋丸在蔗糖固體培養基中預培養，干燥后的莖尖包埋丸置于液氮中冷凍24h以上；(2)解凍及恢復后再生培養：莖尖包埋丸冷凍保存后，解凍，然后取包埋丸莖尖接種到恢復培養基上進行恢復培養和繼代培養得到再生莖尖;(3)生根培養：取步驟二中的再生莖尖置于生根培養基中進行生根培養；(4)煉苗移栽：將培養30-40d的生根苗的根部清洗，KMnO4浸根，移栽至盛有滅菌蛭石的營養缽中用1/8MS營養液澆灌，然后放入培養室培養2-3d后澆灌殺菌劑，待地上部葉色加深后轉移到盛有營養土的營養缽中繼續溫室鍛煉，生長2~3個月左右，翌年春移栽大田。
【專利說明】毛葡萄莖尖的包埋干燥超低溫保存方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及農業科學領域，尤其是基于包埋干燥法超低溫冷凍保存毛葡萄莖尖的方法。
【背景技術】
[0002]超低溫保存技術可實現植物種質的長期、穩定保存。自1991年以來，葡萄品種超低溫保存的影響因素得到逐步研究，趙艷華、吳永杰(《園藝學報》2001年第I期第62頁至64頁)利用包埋干燥法成功實現了歐洲葡萄(Kiii1S vinifera)釀酒品種‘品麗珠’側芽莖尖超低溫保存，存活率達40%以上，但不同品種、不同基因型之間保存成活率存在較大差異，且不同基因型的保存技術體系存在差異，尤其是野生葡萄資源的超低溫冷凍沒有研究。
[0003]毛葡萄(Kiii1SRoem.& Schult.)又名絨毛葡萄、五角葉葡萄,在我國華中、華東、西南、華南北部、西北的陜、甘及華北的山西均有分布，是分布最為廣泛的野生葡萄種類之一。毛葡萄抗性強、適應性好，既是葡萄嫁接栽培的優良抗性砧木，與栽培品種嫁接親和性良好，也是釀造紅葡萄酒的優良原料。盡管我國的野生毛葡萄種類較多，具有良好的適應性和抗旱性，但是由于環境變化和人類的過度開發利用，收集與保存方式單一，導致毛葡萄資源流失嚴重，甚至一些野生毛葡萄自然資源瀕臨滅絕，這意味著其中蘊含的優良基因及優良性狀也會隨之消失，因此對野生毛葡萄種質資源的收集與保存越來越重要。研究者雖然采用組織培養技術已經建立了毛葡萄短期離體保存的技術體系(潘學軍、李霞、張文娥，《果樹學報》“離體保存對野生毛葡萄試管苗生長及葉片抗氧化酶活性的影響”，2013年第4期615頁至620頁)，但因在保存過程中，需要多次繼代，耗費大量的人力物力，且容易發生變異，不能達到毛葡萄長期、安全、穩定保存的需求。因此，明確毛葡萄超低溫保存的主要影響因子，建立毛葡萄超低溫保存技術體系迫在眉睫。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的技術問題是:提供一種毛葡萄莖尖的包埋干燥超低溫冷凍保存方法，它解決毛葡萄田間種植保存和緩慢生長法離體保存過程中耗費人力物力的缺點，為野生毛葡萄珍稀種質及葡萄屬植物其它野生種的長期保存提供理論基礎，滿足野生毛葡萄的長期、安全、穩定保存。
[0005]本發明的技術方案是:一種毛葡萄莖尖的包埋干燥超低溫保存方法，包括以下步驟:
(1)莖尖包埋干燥超低溫冷凍保存:取繼代腋芽飽滿的組培苗，在光照低溫鍛煉，后剝取組培苗腋芽莖尖，制成莖尖包埋丸，再將包埋丸在蔗糖固體培養基中預培養，干燥后的莖尖包埋丸置于液氮中冷凍24 h以上；
(2)解凍及恢復后再生培養:莖尖包埋丸冷凍保存后，解凍，然后取包埋丸莖尖接種到恢復培養基上進行恢復培養和繼代培養得到再生莖尖；
(3)生根培養:取步驟二中的再生莖尖置于生根培養基中進行生根培養； (4)煉苗移栽:將培養30-40d的生根苗的根部清洗，KMnO4浸根，移栽至盛有滅菌蛭石的營養缽中用1/8MS營養液澆灌，然后放入培養室培養2-3 d后澆灌殺菌劑，待地上部葉色加深后轉移到盛有營養土的營養缽中繼續溫室鍛煉，生長2?3個月左右，翌年春移栽大田。
[0006]步驟一中用于剝取莖尖的組培苗需繼代60 d且腋芽飽滿，并需在光照條件下低溫(10±1)°C鍛煉 14 do
[0007]步驟一中莖尖包埋丸的制備:莖尖投入含有2M甘油、0.4M蔗糖和2.5%海藻酸鈉的MS溶液中，然后吸取含有一個莖尖的液體轉移到含有2M甘油/0.4M蔗糖h和0.1M CaC12的MS溶液中，室溫下形成莖尖包埋丸。
[0008]步驟二中恢復培養基為在MS培養基中每升添加1.5 mg的6_芐基嘌呤、0.02 mg的吲哚丁酸、20 g蔗糖和5 8瓊脂粉，？冊.8?6.0。
[0009]步驟二中恢復培養過程中，先暗培養7 d，后轉移到光照條件下正常繼代培養，30d后檢測莖尖存活率和再生率，莖尖以轉變為綠色為存活、最終能生成小植株為再生標準。
[0010]步驟三中生根培養基為:1/2MS培養基中每升添加0.15 mg吲哚丁酸、0.2 mg吲哚乙酸、20 g蔗糖和5 g瓊脂粉，ρΗ5.8?6.0。
[0011]步驟(2) (3)中培養溫度為25±1°C，光照強度為40umol.s_l.m_2，光照時間為12 h/d ；
步驟四中采用的1/8MS營養液中添加吲哚乙酸。
[0012]本發明的有益效果:與現有技術相比，本發明采用莖尖包埋干燥法成功實現了毛葡萄莖尖的超低溫冷凍保存，使毛葡萄莖尖的保存存活率達44%以上，再生率達17%以上，再生苗生根率100%，煉苗后移栽成活率可達100%，解決了毛葡萄短期離體保存過程中耗費人力物力的缺點，成功建立野生毛葡萄超低溫冷凍保存技術體系，為野生毛葡萄珍稀種質及葡萄屬植物其它野生種的長期保存提供技術基礎；本發明方法長期、安全、穩定、簡單，成本低廉，使用效果好，應用前景廣闊。
【具體實施方式】
[0013]本發明的實施例1:毛葡萄莖尖的包埋干燥超低溫保存方法，包括以下步驟， 步驟一、莖尖包埋干燥超低溫冷凍保存:取繼代60 d的毛葡萄“花溪_9”腋芽飽滿的組培苗，在光照培養箱中以培養溫度(10±1)°C條件下低溫鍛煉14 d，在超凈工作臺上利用解剖鏡無菌剝取組培苗2 mm大小腋芽莖尖，投入含有2.5% (w/v)海藻酸鈉的MS溶液(無Ca2+，加有2 M甘油，0.4 M蔗糖)中，然后吸取含有一個莖尖的液體轉移到含有0.1 MCaCl2的MS溶液(含有2 M甘油，0.4 M蔗糖)中，室溫下30 min形成直徑約4 mm左右的莖尖包埋丸，后用無菌濾紙吸干包埋丸表面的液體，再將包埋丸在0.25mol.L'0.5mol.L'
0.75mol ?L'lmol *L_1不同鹿糖梯度的固體培養基中各預培養Id,后將包埋丸置于無菌濾紙上吸取表面糖液，在超凈工作臺上無菌條件下以風速0.6 m 干燥3 h，再將干燥后的莖尖包埋丸10個一組置于1.8 mL冷凍管中，最后快速置于液氮中冷凍24 h以上；
步驟二、解凍及恢復后再生培養:莖尖冷凍保存24 h后，從液氮中快速取出冷凍管，在40°C水浴鍋中解凍3 min，然后于超凈工作臺上直接取包埋丸莖尖接種到MS+BA1.5mg.U1HM0.02 mg.Γ1的培養基上進行恢復培養和繼代增殖培養。恢復培養過程中，先暗培養7 d，后轉移到光照條件下正常繼代培養，培養溫度為25±1°C，光照強度為40umol.s-1.m_2，光照時間為12 h/d。30d后莖尖存活率為44%，再生率為17%。
[0014]步驟三、生根培養:取步驟二中的再生莖尖置于再生芽適宜生根的培養基1/2MS+IBA0.15 mg.Γ'+ΙΑΑΟ.2 mg.L—1上進行生根，培養溫度為25±1°C，光照強度為40umol.s 1.m2，光照時間為12 h/d ；30 d后生根率可達100% ；
步驟四、煉苗移栽:將培養3(T40 d的生根苗的根部用自來水清洗干凈，然后在超凈工作臺上用0.1% KMnO4浸根10 S，移栽至盛有滅菌蛭石的營養缽中用1/8 MS營養液澆灌(以后每隔7 d澆I次)，每次100 mL，并加蓋與營養缽同樣大小的塑料杯以保持濕度，然后放入培養室培養2?3 d后澆灌殺菌劑(以后每隔7 d澆I次)。培養室溫度為25°C ±1°C，培養過程中以塑料杯開口大小來調節培養濕度，待地上部葉色加深后轉移到盛有營養土的營養缽中繼續溫室鍛煉，生長2?3個月左右，翌年春移栽大田，成活率100%。
[0015]本發明的實施例2:毛葡萄莖尖的包埋干燥超低溫保存方法，包括以下步驟， 步驟一、莖尖包埋干燥超低溫冷凍保存:取繼代60 d的毛葡萄“花溪_4”腋芽飽滿的組培苗，在光照培養箱中以培養溫度(10±1)°C條件下低溫鍛煉14 d，在超凈工作臺上利用解剖鏡無菌剝取組培苗2 mm大小腋芽莖尖，投入含有2.5% (w/v)海藻酸鈉的MS溶液(無Ca2+，加有2 M甘油，0.4 M蔗糖)中，然后吸取含有一個莖尖的液體轉移到含有0.1 MCaCl2的MS溶液(含有2 M甘油，0.4 M蔗糖)中，室溫下30 min形成直徑約4 mm左右的莖尖包埋丸，后用無菌濾紙吸干包埋丸表面的液體，再將包埋丸在0.25mol.L'0.5mol.L'
0.75mol ?L'lmol *L_1不同鹿糖梯度的固體培養基中各預培養Id,后將包埋丸置于無菌濾紙上吸取表面糖液，在超凈工作臺上無菌條件下以風速0.6 m 干燥3 h，再將干燥后的莖尖包埋丸10個一組置于1.8 mL冷凍管中，最后快速置于液氮中冷凍24 h以上；
步驟二、解凍及恢復后再生培養:莖尖冷凍保存24 h后，從液氮中快速取出冷凍管，在40°C水浴鍋中解凍3 min，然后于超凈工作臺上直接取包埋丸莖尖接種到MS+BA1.5mg.U1HM0.02 mg.Γ1的培養基上進行恢復培養和繼代增殖培養。恢復培養過程中，先暗培養7 d，后轉移到光照條件下正常繼代培養，培養溫度為25±1°C，光照強度為40umol.s-1.m_2，光照時間為12 h/d。30d后莖尖存活率為49%，再生率為22%。
[0016]步驟三、生根培養:取步驟二中的再生莖尖置于再生芽適宜生根的培養基1/2MS+IBA0.15 mg.Γ'+ΙΑΑΟ.2 mg.L—1上進行生根，培養溫度為25±1°C，光照強度為40umol.s 1.m2，光照時間為12 h/d ；30 d后生根率可達100% ；
步驟四、煉苗移栽:將培養3(T40 d的生根苗的根部用自來水清洗干凈，然后在超凈工作臺上用0.1% KMnO4浸根10 S，移栽至盛有滅菌蛭石的營養缽中用1/8 MS營養液澆灌(以后每隔7 d澆I次)，每次100 mL，并加蓋與營養缽同樣大小的塑料杯以保持濕度，然后放入培養室培養2?3 d后澆灌殺菌劑(以后每隔7 d澆I次)。培養室溫度為25°C ±1°C，培養過程中以塑料杯開口大小來調節培養濕度，待地上部葉色加深后轉移到盛有營養土的營養缽中繼續溫室鍛煉，生長2?3個月左右，翌年春移栽大田，成活率100%。
[0017]“花溪-9”及“花溪-4”均是從野外收集的貴州野生毛葡萄優良單株，與栽培葡萄品種相比，果粒小，含糖量較低、含酸量較高，風味獨特，抗病性及抗旱性強，蘊含豐富的抗性基因，既可作為釀酒葡萄栽培，也可作為抗性砧木利用。
【權利要求】
1.一種毛葡萄莖尖的包埋干燥超低溫保存方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)莖尖包埋干燥超低溫冷凍保存:取繼代腋芽飽滿的組培苗，在光照低溫鍛煉，后剝取組培苗腋芽莖尖，制成莖尖包埋丸，再將包埋丸在蔗糖固體培養基中預培養，干燥后的莖尖包埋丸置于液氮中冷凍24卜以上； (2)解凍及恢復后再生培養:莖尖包埋丸冷凍保存后，解凍，然后取包埋丸莖尖接種到恢復培養基上進行恢復培養和繼代培養得到再生莖尖； (3)生根培養:取步驟二中的再生莖尖置于生根培養基中進行生根培養； (4)煉苗移栽:將培養30-40(1的生根苗的根部清洗，^1104浸根，移栽至盛有滅菌蛭石的營養缽中用1/813營養液澆灌，然后放入培養室培養2-3 (1后澆灌殺菌劑，待地上部葉色加深后轉移到盛有營養土的營養缽中繼續溫室鍛煉，生長2?3個月左右，翌年春移栽大田。
2.根據權利要求1所述的一種毛葡萄莖尖的包埋干燥超低溫保存方法，其特征在于:步驟一中用于剝取莖尖的組培苗需繼代60 (1且腋芽飽滿，并需在光照條件下低溫(10 ±1)1 鍛煉 14 己。
3.根據權利要求1所述的一種毛葡萄莖尖的包埋干燥超低溫保存方法，其特征在于:步驟一中莖尖包埋丸的制備:莖尖投入含有21甘油、0.41蔗糖和2.5%海藻酸鈉的13溶液中，然后吸取含有一個莖尖的液體轉移到含有21甘油/0.41蔗糖卜和0.1I 0^12的13溶液中，室溫下形成莖尖包埋丸。
4.根據權利要求1所述的一種毛葡萄莖尖的包埋干燥超低溫保存方法，其特征在于:步驟二中恢復培養基為在13培養基中每升添加1.5呢的6-芐基嘌呤、0.02呢的吲哚丁酸、20 8蔗糖和5 8瓊脂粉，邱5.8^6.0。
5.根據權利要求1所述的一種毛葡萄莖尖的包埋干燥超低溫保存方法，其特征在于:步驟二中恢復培養過程中，先暗培養7山后轉移到光照條件下正常繼代培養，30(1后檢測莖尖存活率和再生率，莖尖以轉變為綠色為存活、最終能生成小植株為再生標準。
6.根據權利要求1所述的一種毛葡萄莖尖的包埋干燥超低溫保存方法，其特征在于:步驟三中生根培養基為:1/213培養基中每升添加0.15呢吲哚丁酸、0.2呢吲哚乙酸、208蔗糖和5 8瓊脂粉，邱5.8^6.0。
7.根據權利要求1所述的一種毛葡萄莖尖的包埋干燥超低溫保存方法，其特征在于:步驟(2) (3)中培養溫度為25±1。〇，光照強度為401111101 - 8-1 - 111-2，光照時間為12匕/己。
8.根據權利要求1所述的一種毛葡萄莖尖的包埋干燥超低溫保存方法，其特征在于:步驟四中采用的1/813營養液中添加吲哚乙酸。
【文檔編號】A01N3/00GK104304238SQ201410463148
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月12日 優先權日:2014年9月12日
【發明者】潘學軍, 張文娥, 甘專, 王沙沙 申請人:貴州大學