白榆組培苗瓶內復壯的方法
【專利摘要】本發明公開了一種白榆組培苗瓶內復壯的方法，采用(1)獲取白榆組培苗單株a；(2)白榆瓶內復壯苗的制備；將該組培苗再次轉接至正常繼代培養基中培養20-24天后，得生長健壯、葉片舒展，平均株高3.5-4.0厘米，增殖比例平均1:3.8。復壯后的白榆組培苗降低了組培苗內的激素含量，能夠繼續進行繼代培養20次，減少了重新獲取新組培苗的次數，更適于白榆組培苗工廠化生產過程中，不受季節限制、利于生態環境、能短期內為生產提供大量正常健康的無菌組培苗。本發明適用于白榆組培苗瓶內的復壯的培養。
【專利說明】白榆組培苗瓶內復壯的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物培植領域，涉及一種植物復壯的方法，具體涉及一種白榆組培苗 瓶內復壯的方法。
【背景技術】
[0002] 白榆也稱榆樹，榆科榆屬落葉喬木，分布較廣，在東北、華北、西北及西南各省區均 有栽培。白榆在中國乃至世界范圍內有著悠久的栽植歷史，是中國北方地區五大鄉土樹種 之一，也是世界四大行道樹種之一。白榆適應性強，喜光、耐旱、耐寒、耐貧瘠，不擇土壤，多 用于造林，是榆屬植物中造林最為主要的樹種。同時，白榆具有耐鹽堿能力，可在中低度鹽 堿地生長，因此可用于濱海鹽堿地的造林或四旁綠化。除造林外，白榆還是優良的木材，耐 磨、耐腐，可用于造船、建筑、室內裝修地板、家具。此外，白榆還具有較高的食用價值，葉片 含淀粉和蛋白質，可做飼料，幼嫩果實（榆錢）可食用且具有藥用效果。
[0003] 植物組培技術是保持植物優良性狀的有效手段。白榆組培工廠化過程中，隨著組 培繼代次數的增加，植株體內激素不斷累積，進而影響植物正常的表現，組培增殖比例下 降，更嚴重的是，組培生根率下降，出現變異的風險增加。通常白榆組培苗繼代20次以上， 需要采取新的外植體，通過利用升汞、次氯酸等化學物質進行消毒，以獲取新的無菌苗替代 超繼代次數的組培苗。由于常規的外植體消毒方法，使用的升汞等物質中含重金屬，易影響 身體健康，破壞生態環境；同時該方法以外植體為基礎，受季節限制，不利于大規模工廠化 生產。
[0004] 現有技術中通常獲得白榆無菌苗的方法，往往受到季節的限制，一般在母本植株 生長開始或生長旺季進行外植體材料的采集，此時外植體材料內源激素含量高，容易分化， 成活率高，生長速度快，相對易增殖。因此一般在春夏季節進行外植體材料的采集。另外， 外植體材料來源少，采集外植體需選定一個優良的母本植株，因同一個植株不同部位相對 樹齡不同，樹冠下部低齡化，所以一般采集樹冠下部枝條萌發的新芽，因此材料來源少。獲 得新芽后，新芽生長需要一定時間，從外植體采集到獲得100個無菌材料總耗時2個月。且 繼代前2個周期內出現無菌苗基部有黃葉、落葉現象，獲得正常生長的無菌苗需3. 5個月 時間，耗時長。對于整個無菌體系建立需要在采集2個月時間內重復進行外植體的采集、消 毒、接種。在無菌體系建立過程中使用的升汞為有毒試劑，易對環境產生污染，不慎接觸可 能產生毒副作用。并且成本相對高，其中無菌體系建立過程中需要使用消毒劑、配制啟動培 養基和增殖培養基，且均不可重復使用。
[0005] 白榆組培苗的培養方法的步驟分為無菌苗的獲取、瓶內擴繁（繼代）、瓶內復壯、 瓶內生根，每個階段所使用的培養基與培養方法均是不同的。并且其中所述的瓶內復壯是 在瓶內生根階段之前的復壯，目的是使生根階段的生根率提高。
[0006] 中國發明專利CN102726294公開了"一種白榆組培苗的瓶內生根方法"，采用以下 步驟進行（1)繼代苗的選取；（2)將繼代培養的組培苗接種到WPM生根培養基上；其針對的 是白榆組培苗的生根方法，應用階段為最終的生根階段。
[0007] 中國發明專利CN102934612公開了"一種白榆組培苗的繼代培養方法"，采用將到 達繼代周期的白榆組培苗在超凈工作臺通過切分從生芽形式進行擴繁增殖，接種到繼代培 養基中。其針對的是白榆組培苗的繼代培養階段。
[0008]因此，建立一種不受季節限制、耗時短、減少人力的耗費、減少化學試劑的使用和 生產成本低的，能短期內為生產提供大量正常健康的無菌組培苗方法具有重要的意義。
【發明內容】
[0009] 本發明要解決的技術問題，是提供一種白榆組培苗瓶內復壯的方法，該復壯階段 是在無菌苗的獲取和瓶內擴繁（繼代）之間，所制得的復壯苗較現有技術的繼代培養次數 增加，在白榆組培苗工廠化生產過程中，不受季節限制、利于生態環境、能短期內為生產提 供大量正常健康的無菌組培苗方法。
[0010] 為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是：
[0011] -種白榆組培苗瓶內復壯的方法，它按照以下步驟順序進行：
[0012] (1)獲取白榆組培苗單株a
[0013] 選取繼代周期為21-25天，生長健壯、葉色嫩綠、葉片舒展，莖30 % -50 %木質 化，株高為2. 5-3. 5厘米的白榆組培苗，切除基部愈傷組織及基部葉片，保留頂芽且株高 1. 8-2. 5厘米的白榆組培苗單株a;
[0014] (2)白榆瓶內復壯苗的制備
[0015] 將白榆組培苗單株a轉接至復壯培養基中，光照和暗培養交替進行，光照培養條 件為13小時光照，光照強度1500-3500勒克斯，溫度為23-27°C;暗培養條件為暗培養11小 時，溫度為19-23 °C，培養40天后，得白榆瓶內復壯苗。
[0016] 作為本發明的一種限定，步驟（2)中所述的復壯培養基為體積比為30ml:60ml的 營養液：蛭石。
[0017] 作為本發明的另一種限定，營養液為MS培養基中硝酸銨、7水硫酸鎂、磷酸二氫 鉀、硝酸鉀四種物質濃度變為原來的1/4-3/4,同時去除肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆 醇、甘氨酸。其中所述的原來的MS培養基為市售的MS培養基。
[0018] 由于采用了上述的技術方案，本發明與現有技術相比，所取得的技術進步在于：
[0019] 采用白榆組培苗瓶內復壯方法，該復壯階段是在無菌苗的獲取和瓶內擴繁（繼 代）之間，所制得的復壯苗較現有技術的繼代培養次數增加，且可以作為無菌苗繼續進行 復壯、繼代培養等下面的步驟，能夠進行循環使用。采用（1)獲取白榆組培苗單株a;(2)白 榆瓶內復壯苗的制備；將該組培苗再次轉接至正常繼代培養基中培養20-24天后，得生長 健壯、葉片舒展，平均株高3. 5-4. 0厘米，增殖比例平均1:3. 8。復壯后的白榆組培苗降低了 組培苗內的激素含量，能夠繼續進行繼代培養20次，減少了重新獲取新組培苗的次數，更 適于白榆組培苗工廠化生產過程中，不受季節限制、利于生態環境、能短期內為生產提供大 量正常健康的無菌組培苗。
[0020] 本發明適用于白榆組培苗瓶內的復壯的培養。
[0021] 本發明下面將結合具體實施例作進一步詳細說明。
【具體實施方式】
[0022] 實施例1 一種白榆組培苗瓶內復壯的方法
[0023] 一種白榆組培苗瓶內復壯的方法，它按照以下步驟順序進行：
[0024] (1)獲取白榆組培苗單株a
[0025] 選取繼代周期為23天，生長健壯、葉色嫩綠、葉片舒展，莖30% -50%木質化，株高 為2. 5厘米的白榆組培苗，切除基部愈傷組織及基部葉片，保留頂芽且株高2. 5厘米的白榆 組培苗單株a;
[0026] (2)白榆瓶內復壯苗的制備
[0027] 將白榆組培苗單株a轉接至復壯培養基中，光照和暗培養交替進行，光照培養條 件為13小時光照，光照強度3000勒克斯，溫度為25°C ;暗培養條件為暗培養11小時，溫度 為20 °C，培養40天后，得白榆瓶內復壯苗；其中，復壯培養基為體積比為30ml: 60ml的營養 液：輕石。營養液為MS培養基中硝酸銨、7水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硝酸鉀四種物質濃度變 為原來的1/4,同時去除肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、甘氨酸。
[0028] 將瓶內復壯苗轉接到繼代培養基中繼續進行培養所得到的復壯后的白榆組培苗a 與通過外植體消毒獲得的無菌苗b在相同的培養基中進行培養，比較培養結果：
[0029] (1)復壯后的白榆組培苗a的制備
[0030] 將上述瓶內復壯苗轉接至繼代培養基中，培養基的pH為5. 8,培養22天，得復 壯后的白榆組培苗a。所使用的繼代培養基為以改良MS培養基為基礎培養基，還添加有 BA 0.3mg/L、KT 0.2mg/L、糖 30g/L 和瓊脂 6.5g/L。改良 MS 培養基為包括 KN032022mg/L、 NH4N031600mg/L、MgS0 4 ? 7H20 740mg/L 和 KH2P04312mg/L。
[0031] (2)通過外植體消毒獲得的無菌苗b的制備
[0032] 通過外植體消毒獲得無菌苗b的方法為：選定的母本植株枝條萌發的新芽長 2-3cm時開始采集，新芽采集后立即帶回實驗室進行消毒、接種處理，步驟如下：外植體 采集一自來水沖洗兩遍一洗衣粉水沖洗瓶內順時針晃動重新2分鐘一流水沖洗30分鐘 -75%酒精消毒20秒一無菌水沖洗兩次一0. 04%升汞100毫升+ -滴吐溫20消毒搖床 晃動15分鐘一超凈工作臺內無菌水沖洗六次一用無菌紗布或無菌吸水紙吸除外植體材料 上的水一外植體材料進行修剪一接種至培養基中一培養室培養，光照培養條件為13小時 光照，光照強度為3000勒克斯，溫度為25°C，最終獲得無菌苗b。
[0033] 將通過外植體消毒方法獲得的無菌苗b與本實施例所培養出的復壯后的白榆組 培苗a生長情況作對比，如下表所示：
[0034]
【權利要求】
1. 一種白榆組培苗瓶內復壯的方法，其特征在于它按照以下步驟順序進行： (1) 獲取白榆組培苗單株a 選取繼代周期為21-25天，生長健壯、葉色嫩綠、葉片舒展，莖30% -50%木質化，株高 為2. 5-3. 5厘米的白榆組培苗，切除基部愈傷組織及基部葉片，保留頂芽且株高1. 8-2. 5厘 米的白榆組培苗單株a; (2) 白榆瓶內復壯苗的制備 將白榆組培苗單株a轉接至復壯培養基中，光照和暗培養交替進行，光照培養條件為 13小時光照，光照強度1500-3500勒克斯，溫度為23-27°C ;暗培養條件為暗培養11小時， 溫度為19_23°C，培養40天后，得白榆瓶內復壯苗。
2. 根據權利要求1所述的白榆組培苗瓶內復壯的方法，其特征在于：步驟（2)中所述 的復壯培養基為體積比為30ml :60ml的營養液：輕石。
3. 根據權利要求2所述的白榆組培苗瓶內復壯的方法，其特征在于：營養液為MS培養 基中硝酸銨、7水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硝酸鉀四種物質濃度變為原來的1/4-3/4,同時去除 肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、甘氨酸。
【文檔編號】A01H4/00GK104429958SQ201410705512
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月26日 優先權日:2014年11月26日
【發明者】林大為, 王蘇洋, 劉伯燕, 劉戈, 張承妹, 董舉文, 陳銘, 高暢, 郝治軍, 蘇涌 申請人:上海杉一植物科技有限公司