一種牛角瓜組織培養的方法
【專利摘要】本發明涉及一種牛角瓜組織培養的方法，屬植物組織培養領域，包括如下步驟：培養基配制、外植體選取與消毒、種子萌發、不定芽誘導及增殖、生根誘導、組培苗馴化及移栽。基本培養基為MS培養基，蔗糖25～30g/L，瓊脂粉8～9g/L，PVP 0.1～0.5g/L，培養基pH為5.6～5.8；種子萌發培養基為MS或1/2MS；不定芽誘導培養基為MS+6-BA3.0～5.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L+PVP 0.1～0.5g/L；不定芽增殖培養基為MS+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L+PVP 0.1～0.5g/L；生根培養基為MS+IBA 0.01～0.5mg/L+PVP0.1～0.5g/L或1/2MS+IBA0.01～0.5mg/L+PVP 0.1～0.5g/L。培養條件為25±2℃，12～16h/d，40～60μ·mol·m-2·s-1。本發明的優點：建立的牛角瓜組培快繁技術體系種苗繁殖速度快，健壯均勻，變異少，移栽成活率高，適合優良牛角瓜品種種苗規模化生產。
【專利說明】一種牛角瓜組織培養的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物組織培養技術，具體涉及一種牛角瓜組織培養的方法。
【背景技術】
[0002]牛角瓜(Calotropisgigantea (Linn.)Dry.ex Ait.f)，別名斷腸草、羊浸樹、哮喘樹、皇冠花等，為蘿摩科牛角瓜屬多年生草本植物，在亞洲、美洲、非洲均有分布，我國主要分布于兩廣、海南、福建、云南、四川等省區。牛角瓜耐旱、耐貧瘠能力強，常生于干旱或半干旱的曠野地，可作為干旱地帶荒地、貧瘠地綠化先鋒植物，而且生長迅速，每周生長最快約30厘米，植株可高達3m，可起到防風、保土、保水的功效，可作為貧瘠土地改良的先鋒植物。
[0003]牛角瓜全身是寶，具有多種利用價值及廣闊的市場前景。牛角瓜整個植株無論老嫩均可用作肥料；牛角瓜纖維可用于生產中高檔針織產品、紙張及人造棉等，種毛可供制作絲絨原料，在紡織領域具有廣闊的應用前景；牛角瓜的乳液中含有大量的碳氫化合物及某些烴類物質，與天然原油成分相近，I公頃的牛角瓜可提煉出一萬多升的原油，也可用于提取生物農藥制劑，乳液干燥后可供作黃色染料、樹膠原料及鞣料等；此外牛角瓜還具有多種藥用價值，其干葉具袪痰、止咳等功效；乳汁具抗炎、抗凝血、強心及驅蟲等作用，樹皮亦可用于治療癩癬。
[0004]目前，牛角瓜栽培常用種子進行繁殖，但種子數量有限，同時由于生長環境限制，自然狀態下，種子萌發率較低，無法同時獲得大量優質種苗。植物組織培養是目前最有效的植物種苗快速繁殖的方法，目前關于牛角瓜組織培養研宄報道國內僅見李克烈等I篇，其主要是利用無菌萌發苗葉片為起始材料，通過先誘導愈傷再誘導愈傷分化的方式獲得牛角瓜再生植株；國外僅見Ashis T.Roy等利用子葉、幼嫩葉片和莖段為起始材料，誘導出愈傷之后利用液體懸浮培養技術對愈傷進行擴繁，然后對擴繁愈傷進行分化誘導從而獲得牛角瓜再生植株的研宄報道。在植物組培過程中，通過愈傷途徑獲得再生植株后代變異較高，后代品質差異較大，相對于通過誘導愈傷獲得的植株再生途徑，利用直接器官發生途徑獲得再生植株可極大降低組培過程中導致的變異發生，但是關于牛角瓜通過直接器官發生獲得再生植株尚未見報道。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于克服現有技術存在的不足，而提供一種牛角瓜組織培養的方法。本發明擬解牛角瓜利用種子無菌萌發獲得的無菌材料，通過直接誘導不定芽途徑建立良好的牛角瓜組培再生體系，為牛角瓜優良種植擴繁、新品種培育及遺傳改良等做好技術支持。
[0006]本發明的目的是通過如下技術方案來完成的。這種牛角瓜組織培養的方法，該方法包括如下步驟:
[0007]I)、外植體的選取及處理:選取牛角瓜種子作為起始材料，從牛角瓜果實中將種子取出，去除種子表面纖維之后經過浸種2h后，選擇沉在容器底部的種子作為組培用外植體；
[0008]2)、種子萌發:在超凈工作臺上，將經過表面消毒的牛角瓜種子轉移至無菌接種盤中，用無菌濾紙吸去外植體表面水分，接種于種子萌發培養基MS或1/2MS培養基中進行種子萌發，培養溫度25±2°C，光照時間為12?16h/d，光照強度為40?60 μ ?mol.πι2.s S
[0009]3)不定芽誘導:在無菌工作臺上，由種子萌發獲得的無菌苗從腋芽下方每兩個芽為一個單位切段，帶芽莖段接種于不定芽誘導培養基進行不定芽的誘導，不定芽誘導培養基為 MS+6-BA 3.0 ?5.0mg/L+NAA 0.05 ?0.2mg/L+PVP 0.1 ?0.5g/L 中，進行不定芽的誘導，培養溫度25±2°C，光照時間為12?16h/d，光照強度為40?60 μ.mo I.m 2.s S
[0010]4)不定芽增殖:在無菌工作臺上，將誘導獲得的I?2cm高的叢生不定芽從基部以2?3個連在一起的不定芽為一個接種單元分離，將分離材料接種于不定芽增殖培養基中增殖，不定芽增殖培養基為MS+6-BA 1.0?3.0mg/L+NAA 0.05?0.2mg/L+PVP 0.1?0.5g/L，培養溫度25±2°C，光照時間為12?16h/d，光照強度為40?60 μ.moI.πΓ2.s—1;
[0011]5)、不定芽生根誘導:將高生長到3?4cm的叢生不定芽從基部單個分離，接入生根培養基中進行不定根的誘導，生根培養基為MS+IBA 0.01?0.5mg/L+PVP 0.1?0.5g/L 或 1/2MS+IBA 0.01 ?0.5mg/L+PVP 0.1 ?0.5g/L，培養溫度 25±2°C，光照時間為 12 ?16h/d，光照強度為 40 ?60 μ.mo I.m 2.s S
[0012]6)、組培苗馴化及移栽:叢生不定芽基部長出4?6條2?3cm的不定根后，將生根苗移至溫室，散射光培養3?5d后再打開瓶蓋培養I?2d，將牛角瓜組培苗小心從培養瓶中連根取出，用自來水洗凈組培苗表面的培養基，然后在通風陰涼處稍晾干組培苗表面水分后將牛角瓜組培苗，栽入基質中，保濕90%以上培養15d，然后在溫室中正常培養；
[0013]種子萌發、不定芽誘導及增殖、不定芽生根誘導基本培養基均為MS培養基，蔗糖用量為25?40g/L，凝固劑為瓊脂粉，用量為8?9g/L，PVP用量為0.1?0.5g/L，培養基PH分裝前調整為5.6?5.8 ;種子萌發培養基為MS或1/2MS培養基；不定芽誘導培養基為 MS+6-BA3.0 ?5.0mg/L+NAA 0.05 ?0.2mg/L+PVP 0.1 ?0.5g/L ;不定芽增殖培養基為MS+6-BA1.0 ?3.0mg/L+NAA 0.05 ?0.2mg/L+PVP 0.1 ?0.5g/L ;生根培養基為 MS+IBA0.01 ?0.5mg/L+PVP 0.1 ?0.5g/L 或 1/2MS+IBA 0.01 ?0.5mg/L+PVP 0.1 ?0.5g/L ;種子萌發、不定芽誘導及增殖、不定芽生根培養條件為，培養溫度25±2°C，光照時間為12?16h/d，光照強度為 40 ?60 μ.mo I.m 2.s、
[0014]起始外植體的選擇及處理、種子萌發、不定芽誘導、不定芽增殖、生根誘導、移栽前馴化過程及移栽后保濕90%以上培養15d。
[0015]本發明的有益效果為:
[0016]1、通過組織培養技術進行牛角瓜種苗快繁，生產不受地區、季節、氣候及母株生長年限的限制，便于工廠化育苗，可根據訂單進行生產，生產時間及規模可控，為牛角瓜的推廣應用提供充足的優質種苗保障。
[0017]2、繁殖系數達到3.0?3.5，生根率100%，移栽成活率100%，達到種苗工廠化育苗生產的要求。
[0018]3、本發明采用牛角瓜腋芽直接誘導不定芽的增殖方式，無愈組織傷誘導及愈傷分化誘導環節，可極大減少植物組培過程中后代變異的發生，種苗可最大限度保持母本的優良性狀。
[0019]4、有利于牛角瓜優良單株、新品種組培快繁體系建立借鑒、推廣。
[0020]5、建立良好的組培快繁體系，為今后利用植物生物技術對牛角瓜進行新品種培育、遺傳改良等研宄工作奠定基礎。
【具體實施方式】
[0021]下面通過【具體實施方式】對本發明作進一步闡述，實施例將幫助更好地理解本發明，但本發明并不僅僅局限于下述實施例。
[0022]這種牛角瓜組織培養的方法，該方法包括如下步驟:
[0023]1、培養基及培養條件:種子萌發、不定芽誘導、不定芽增殖增殖、不定芽生根誘導基本培養基均為MS培養基，蔗糖用量為25?30g/L，凝固劑為瓊脂粉，用量為8?9g/L，PVP用量為0.1?0.5g/L，培養基pH分裝前調整為5.6?5.8 ;種子萌發培養基為MS或1/2MS培養基；不定芽誘導培養基為MS+6-BA 3.0?5.0mg/L+NAA 0.05?0.2mg/L+PVP 0.1?0.5g/L ;不定芽增殖培養基為 MS+6-BA 1.0 ?3.0mg/L+NAA 0.05 ?0.2mg/L+PVP 0.1 ?0.5g/L ;生根培養基為 MS+IBA O ?0.5mg/L+PVP 0.1 ?0.5g/L 或 1/2MS+IBA O ?0.5mg/L+PVP 0.1?0.5g/L;種子萌發、不定芽誘導及增殖、不定芽生根培養條件為，培養溫度25±2°C，光照時間為12?16h/d，光照強度為40?60 μ.mo I.πΓ2.s'
[0024]2、外植體的處理與消毒:選取牛角瓜種子作為起始材料，將收集到的去掉種毛的牛角瓜種子經過溫水浸種2h后，選擇沉積在容器底部的種子作為外植體，挑選好的外植體用洗潔精溶液清洗20min，期間不斷輕輕攪拌，然后流水沖洗經干凈種子表面殘留的洗潔精清洗溶液，在已經過消毒的超凈工作臺上將清洗干凈的牛角瓜種子轉移至無菌錐形瓶中，用70?75%酒精浸泡60s，期間不斷輕輕晃動錐形瓶，去除附著在牛角瓜種子表面氣泡，倒出75%酒精，再用0.1% HgCl2溶液浸泡種子6?lOmin，或用有效氯濃度為1% NaClO溶液浸泡種子20?30min，浸泡期間不斷輕輕晃動錐形瓶，去除附著在牛角瓜種子表面氣泡，倒出0.1 % HgCl2溶液或I % NaClO溶液，用無菌水清洗經過表面消毒處理的種子4?5次，處理后的種子用少量無菌水浸泡、備用。
[0025]3、種子萌發:在超凈工作臺上，將經過表面消毒的牛角瓜種子轉移至無菌接種盤中，用無菌濾紙吸干種子表面水分，接種于種子萌發培養基MS或1/2MS培養基中進行種子萌發，培養溫度25±2°C，光照時間為12?16h/d，光照強度為40?60 μ.mo I.πΓ2.s—1。
[0026]4、不定芽誘導:將種子萌獲得的2?3cm高的無菌苗在無菌工作臺上以每個腋(頂)芽為I個單位，切成Icm左右的小段，接種到不定芽誘導培養基MS+6-BA 3.0?5.0mg/L+NAA 0.05?0.2mg/L+PVP 0.1?0.5g/L中，進行不定芽的誘導，培養溫度25±2°C，光照時間為12?16h/d，光照強度為40?60 μ.mo I.πΓ2.s'
[0027]5、不定芽增殖:在無菌工作臺上，將誘導獲得的簇生、I?2cm高的不定芽從基部以2?3個連體不定芽為接種單位進行分離，接種于不定芽增殖培養基中增殖，不定芽增殖培養基為 MS+6-BA 1.0 ?3.0mg/L+NAA 0.05 ?0.2mg/L+PVP 0.1 ?0.5g/L，培養溫度25±2°C，光照時間為12?16h/d，光照強度為40?60 μ.mo I.πΓ2.s'
[0028]6、不定芽生根誘導:在無菌工作臺上，將高生長到3?4cm的叢生不定芽從基部切開成單個，接入生根培養基中進行不定根的誘導，生根培養基為MS+IBA 0.01?0.5mg/L+PVP0.1 ?0.5g/L 或 1/2MS+IBA 0.01 ?0.5mg/L+PVP 0.1 ?0.5g/L，培養溫度 25±2°C，光照時間為12?16h/d，光照強度為40?60 μ.mo I.τα2.s'
[0029]7、組培苗馴化及移栽:不定芽基部長出4?6條2?3cm的不定根后，將生根苗移至溫室，散射光培養5d后打開瓶蓋，再培養I?2d，將牛角瓜生根植株小心從培養瓶中取出，用自來水洗凈組培苗表面的培養基，將牛角瓜組培苗，栽入基質中，保濕90 %以上培養15d，然后在溫室中正常培養。
【權利要求】
1.一種牛角瓜組織培養的方法，其特征在于:該方法包括如下步驟: 1)、外植體的選取及處理:選取牛角瓜種子作為起始材料，從牛角瓜果實中將種子取出，去除種子表面纖維之后經過浸種2h后，選擇沉在容器底部的種子作為組培用外植體； 2)、種子萌發:在超凈工作臺上，將經過表面消毒的牛角瓜種子轉移至無菌接種盤中，用無菌濾紙吸去外植體表面水分，接種于種子萌發培養基MS或1/2MS培養基中進行種子萌發，培養溫度25±2°C，光照時間為12?16h/d，光照強度為40?60 μ.mo I.m 2.s S 3)不定芽誘導:在無菌工作臺上，由種子萌發獲得的無菌苗從腋芽下方每兩個芽為一個單位切段，帶芽莖段接種于不定芽誘導培養基進行不定芽的誘導，不定芽誘導培養基為MS+6-BA 3.0 ?5.0mg/L+NAA 0.05 ?0.2mg/L+PVP 0.1 ?0.5g/L 中，進行不定芽的誘導，培養溫度25±2°C，光照時間為12?16h/d，光照強度為40?60 μ.mo I.m_2.s—1; 4)不定芽增殖:在無菌工作臺上，將誘導獲得的I?2cm高的叢生不定芽從基部以2?3個連在一起的不定芽為一個接種單元分離，將分離材料接種于不定芽增殖培養基中增殖，不定芽增殖培養基為 MS+6-BA 1.0 ?3.0mg/L+NAA 0.05 ?0.2mg/L+PVP 0.1 ?0.5g/L，培養溫度25±2°C，光照時間為12?16h/d，光照強度為40?60 μ.mo I.m 2.s S 5)、不定芽生根誘導:將高生長到3?4cm的叢生不定芽從基部單個分離，接入生根培養基中進行不定根的誘導，生根培養基為MS+IBA 0.01?0.5mg/L+PVP 0.1?0.5g/L或1/2MS+IBA 0.01 ?0.5mg/L+PVP 0.1 ?0.5g/L，培養溫度 25±2°C，光照時間為 12 ?16h/d，光照強度為 40 ?60 μ.mo I.m2.s_1； 6)、組培苗馴化及移栽:叢生不定芽基部長出4?6條2?3cm的不定根后，將生根苗移至溫室，散射光培養3?5d后再打開瓶蓋培養I?2d，將牛角瓜組培苗小心從培養瓶中連根取出，用自來水洗凈組培苗表面的培養基，然后在通風陰涼處稍晾干組培苗表面水分后將牛角瓜組培苗，栽入基質中，保濕90%以上培養15d，然后在溫室中正常培養； 種子萌發、不定芽誘導及增殖、不定芽生根誘導基本培養基均為MS培養基，蔗糖用量為25?40g/L，凝固劑為瓊脂粉，用量為8?9g/L，PVP用量為0.1?0.5g/L，培養基pH分裝前調整為5.6?5.8 ;種子萌發培養基為MS或1/2MS培養基；不定芽誘導培養基為MS+6-BA3.0 ?5.0mg/L+NAA 0.05 ?0.2mg/L+PVP 0.1 ?0.5g/L ;不定芽增殖培養基為 MS+6-BA1.0 ?3.0mg/L+NAA 0.05 ?0.2mg/L+PVP 0.1 ?0.5g/L ;生根培養基為 MS+IBA 0.01 ?0.5mg/L+PVP 0.1 ?0.5g/L 或 1/2MS+IBA 0.01 ?0.5mg/L+PVP 0.1 ?0.5g/L ;種子萌發、不定芽誘導及增殖、不定芽生根培養條件為，培養溫度25±2°C，光照時間為12?16h/d，光照強度為40?60 μ.mo I.m 2.s、
2.根據權利要求1所述的牛角瓜組織培養的方法，其特征在于:起始外植體的選擇及處理、種子萌發、不定芽誘導、不定芽增殖、生根誘導、移栽前馴化過程及移栽后保濕90%以上培養15d。
【文檔編號】A01H4/00GK104488710SQ201410729059
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月4日 優先權日:2014年12月4日
【發明者】陳志 , 呂永平, 汪一婷, 牟豪杰, 周迪江, 陳劍平 申請人:浙江省農業科學院