本發明涉及到虎杖植物技術領域，尤其是一種虎杖愈傷組織低溫處理植株技術。
背景技術：
虎杖為蓼科植物，虎杖（PoLygonum cuspidatum Sieb.et zuce）干燥根莖及根。主產江蘇、浙江、廣東、廣西、四川、貴州。春秋季采挖，除去殘莖及須根，洗凈泥土，切段成切片，曬干。根莖或根呈圓粒形段塊片，有分支，稍彎曲，長短不一。外表面棕褐色，有明顯縱皺紋，須根和總狀須根痕。質堅硬，折斷面棕黃色，纖維性。斷面皮部薄，棕褐色。主要成份：含蒽西昆類衍生物，并以游離型為主，其中有大黃素，大黃素甲醚，大黃酚等。還含有大黃素-8-葡萄糖苷，大黃素甲醚-8-葡萄糖苷，還含有茂三酚、茂三酚苷、多聚糖、縮合鞣質等。功用主治：活血去瘀，利濕退黃，清熱解毒，止咳化痰。用于瘀血閉經，痛經，關節腫痛，跌打損傷，濕熱黃疸，帶下，毒蛇咬傷，外用的制成油膏等。隨著生物技術的發展，超低溫保存植物愈傷組織技術已日趨完善，愈傷組織用液氮超低溫保存后，其生理代謝、分化能力下降和基因特異性喪失等問題可得到控制，可以作為一種長期穩定保存種質資源和工業化，免去了不必要的人力、物力、財物浪費。以超低溫冷凍方法保存的愈傷組織可在其后很長時間里根據人們的需要將其取出并用于生產，從而有效地保護了珍稀植物的種質資源。至今為止，尚未見有關虎杖愈傷組織超低溫保的報道，這嚴重制約了虎杖種質資源的保存。因此，非常有必要建立虎杖離體超低溫保存技術體系，為科學研究提供了極大幫助。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種虎杖愈傷組織低溫處理植株技術，本發明經過愈傷組織誘導、預培養、裝載、脫水、冷凍、洗滌、再培養及再生等過程實現了虎杖愈傷組織超低溫保存，從而實現本發明的目的。
本發明的技術解決方案是這樣的，一種虎杖愈傷組織低溫處理植株技術，其特征在于包括以下工藝步驟：
（1）外植體的處理：選取當年收飽滿的虎杖種子，以洗潔精水刷洗，置于自來水中沖洗32min后置于清水中浸泡13h，再轉入125mg/mL的赤霉素溶液中浸泡16h，然后在超凈工作臺中以75%乙醇溶液浸泡32s，無菌水沖洗6次，再用含有0.06%吐溫-20的0.6%升汞溶液消毒11min，無菌水沖洗6次后用無菌濾紙吸干表面的水分后備用；
（2）愈傷組織誘導：用無菌解剖刀在經步驟（1）處理后的種子上割刀造成傷口后接種到誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，接種后在26℃條件下進行全暗培養直至形成愈傷組織；
（3）預培養：將步驟（2）得到的長勢良好的愈傷組織轉接至預培養基中進行預培養，接種后在6℃條件下培養6天后檢測細胞存活率；
（4）裝載處理：將經步驟（3）處理后存活的愈傷組織切成2cm左右大小，放入12mL冷凍管后加62%玻璃化保護劑PVS2在室溫下裝載處理42min；
（5）脫水及冷凍：將經步驟（4）處理后的愈傷組織轉至預冷至1℃的100%的玻璃化保護劑PVS2中在6℃處理62min后將冷凍管投入液氮中冷凍處理；
（6）化凍及洗滌：愈傷組織在液氮中保存26h后，取出冷凍管，在42℃水浴中化凍，化凍過程中不斷振蕩冷凍管，使管內愈傷組織和保護劑受熱均勻,然后用含1.2mol/L的MS培養液在室溫下洗滌6次，每次12min；
（7）再培養：將經化凍后的愈傷組織用無菌水沖洗9次后立即轉移至繼代培養基中進行增殖培養。接種后先在29℃條件下全暗培養22天，然后每天光照18小時，光照強度為3200lx，培養溫度為29℃的條件下培養；
（8）芽誘導：將步驟（7）培養至22天的長勢良好的愈傷組織轉接至分化培養基中進行不定芽誘導，接種后先在29℃條件下全暗培養6天，然后每天光照18小時，光照強度為1800lx，培養溫度為29℃的條件下培養直至形成不定芽；
（9）生根培養：當叢生芽長至3.6cm高時，將叢生苗切割成單苗接種至生根培養基中進行生根培養，接種后先在29℃條件下全暗培養5天，然后每天光照18小時，光照強度為1800lx，培養溫度為29℃的條件下培養直至長出根；
（10）試管苗移栽：當小苗長出的新根系長達3.6cm，并且長出側根，苗高6cm以上時，將培養瓶瓶蓋打開并置于自然光照下煉苗8天后，將試管苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基，盡量不傷害根部，栽入由黃沙土和火碳泥（1：1）混合成的基質并定植于大田中。
步驟（2）所述的誘導培養基為：MS+ 6mg/L 2,4-D+ 2.5mg/L 6-BA+ 1.5mg/L KT+3.8%蔗糖+0.6%瓊脂+0.2%活性炭，pH值為5.9。
步驟（3）所述的預培養基為：MS+3.5mg/L6-BA+3.2mg/L NAA+5.5%DMSO+3.6%蔗糖+0.55%瓊脂+0.2%活性炭，pH值為5.9。
步驟（4）所述的玻璃化保護劑PVS2為：32%甘油+16%乙二醇+16%DMSO+0.5mol/L的蔗糖。
步驟（5）所述的繼代培養基為：MS+3.2mg/L6-BA+1.2mg/LNAA+3.6%蔗糖+0.6%瓊脂+0.2%活性炭，pH值為5.9。
步驟（8）所述的分化培養基為：MS+0.6mg/LNAA+2.5mg/L6-BA+3.6%蔗糖+0.55%瓊脂+0.2%活性炭，pH值為5.9。
步驟（9）所述的生根培養基為：1/2MS+0.6mg/L6-BA+1.2mg/L NAA+2.6%蔗糖+0.65%瓊脂+0.2%活性炭，pH值為5.9。
本發明的優點是:以虎杖種子誘導得到的愈傷組織為材料建立了虎杖離體低溫保存技術體系，從而有效地保護了虎杖優良種質資源。本發明經過愈傷組織誘導、預培養、裝載、脫水、冷凍、洗滌、再培養及再生等過程實現了虎杖愈傷組織超低溫保存，可作為一種長期穩定保存種質資源的方法，降低保存經濟成本，有效地保護了珍稀的種質資源。
具體實施方式
下面實施例是對本發明的進一步說明。
實施例：
（1）外植體的處理：選取當年收飽滿的虎杖種子，以洗潔精水輕輕刷洗，自來水沖洗12min后清水中浸泡9h，再轉入52mg/mL的赤霉素溶液中浸泡12h，然后在超凈工作臺中以75%乙醇溶液浸泡12s，無菌水沖洗5次，再用含有0.01%吐溫-20的0.1%升汞溶液消毒6min，無菌水沖洗4次后用無菌濾紙吸干表面的水分后備用。
（2）愈傷組織誘導：用無菌解剖刀在經步驟（1）處理后的種子上割刀造成傷口后接種到誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，接種后在26℃條件下進行全暗培養直至形成愈傷組織。所述的誘導培養基為：MS+ 5mg/L 2,4-D+ 2mg/L 6-BA+ 0.6mg/L KT+3.0%蔗糖+0.6%瓊脂+0.06%活性炭，pH值為5.9。
（3）預培養：將步驟（2）得到的4周齡的長勢良好的愈傷組織轉接至預培養基中進行預培養，接種后在1℃條件下培養2天后檢測細胞存活率。所述的預培養基為：MS+1.2mg/L 6-BA+1.2mg/L NAA+1.2%DMSO+2.25%蔗糖+0.35%瓊脂+0.2%活性炭，pH值為5.9。
（4）裝載處理：將經步驟（3）處理后存活的愈傷組織切成2cm左右大小，放入12mL冷凍管后加55%玻璃化保護劑PVS2在室溫下裝載處理22min。所述的玻璃化保護劑PVS2為：32%甘油+16%乙二醇+16%DMSO+0.5mol/L的蔗糖。
（5）脫水及冷凍：將經步驟（4）處理后的愈傷組織轉至預冷至1℃的100%的玻璃化保護劑PVS2中在2℃處理20min后將冷凍管投入液氮中冷凍處理。
（6）化凍及洗滌：愈傷組織在液氮中保存26h后，取出冷凍管，在39℃水浴中化凍，化凍過程中不斷振蕩冷凍管，使管內愈傷組織和保護劑受熱均勻。然后用含0.6mol/L的MS培養液在室溫下洗滌4次，每次12min。
（7）再培養：將經化凍后的愈傷組織用無菌水沖洗6次后立即轉移至繼代培養基中進行增殖培養。接種后先在26℃條件下全暗培養22天，然后每天光照15小時，光照強度為3200lx，培養溫度為26℃的條件下培養。所述的繼代培養基為：MS+0.6mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+3.3%蔗糖+0.55%瓊脂+0.2%活性炭，pH值為5.9。
（8）芽誘導：將步驟（7）培養至15天的長勢良好的愈傷組織轉接至分化培養基中進行不定芽誘導，接種后先在26℃條件下全暗培養3天，然后每天光照18小時，光照強度為1800lx，培養溫度為26℃的條件下培養直至形成不定芽。所述的分化培養基為：MS+0.6mg/L NAA+2.2mg/L 6-BA+3.35%蔗糖+0.35%瓊脂+0.06%活性炭，pH值為5.9。
（9）生根培養：當叢生芽長至3.8cm高時，將叢生苗切割成單苗接種至生根培養基中進行生根培養，接種后先在26℃條件下全暗培養3天，然后每天光照15小時，光照強度為3200lx，培養溫度為26℃的條件下培養直至長出根。所述的生根培養基為：1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.6mg/L NAA+2.6%蔗糖+0.8%瓊脂+0.2%活性炭，pH值為5.9。
（10）試管苗移栽：當小苗長出的新根系長達4cm，并且長出側根，苗高6cm以上時，將培養瓶瓶蓋打開自然光照下煉苗6天后，將試管苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基，盡量不傷害根部，栽入由黃沙土和火碳泥（1：1）混合成的基質并定植于大田中。