一種用細胞組織學技術判定油棕幼嫩花序性別的方法與流程

本發明屬植物生物學領域，涉及一種花序性別的判定方法，具體是一種用細胞組織學技術判定油棕幼嫩花序性別的方法。

背景技術：

植物花序的性別分化是有花植物發育過程中極為重要的階段，是植物生命延續的關鍵環節，是一個復雜的形態建成過程，也是一種特殊的器官發生現象。了解植物的花序性別分化過程，包括細胞組織學特征及相關內源激素含量的變化，對于理解其發育生物學和生殖生物學特性、在生產中實現花期和性別比例調控、雜交、雜種優勢利用等具有重要意義。

油棕是重要的木本油料作物，其單位面積的產油量遙遙領先于世界上其他的油料作物，被稱為“世界油王”。油棕花序發育和性別分化過程決定能否形成優質雌、雄花序和果實，這是獲得高產優質棕櫚油的前提條件。油棕花序發育和性別分化過程可能與種植地的溫度、濕度等環境因素，以及非生物因素(如水分脅迫)、代謝因素(如碳儲量)、肥料元素種類和水平、激素水平等因素等非生物因素有關。在生產上通過調控各種因素有可能實現油棕花期和雌、雄花序性別比例調控、雜種優勢利用、組織培養以及形成優質花序和果實，以期提高油棕產量，獲得高產優質棕櫚油。因此開展油棕花序性別分化過程與外界因子之間的關系的研究非常重要。

由于油棕花序為雌雄同株異序，從花序開始發育到開放要經歷2～3年的時間(Corley，1976)，過程漫長，這顯著區別于其他大多數植物，而且花序開放后，雌花序的花序軸由大約150個小穗軸組成，而雄花序的花序軸由100～300個小穗軸組成(Jacquemard，1995)。常規油棕花序性別鑒定約在花序開放時期才能進行，時間長，不利于研究。鑒于此，提早判定雌、雄花序性別，及時了解花序性別分化過程與外界因子之間的關系，有效地縮短研究時間，加快研究進程，為進一步研究油棕花序性別分化過程與外界因子之間的關系提供基礎。

我國南方冬季的氣溫較為寒冷，本地栽培的油棕對環境具有適應性，與赤道附近栽培的油棕有顯著差別，但國內迄今沒有其花序性別分化細胞組織學研究的相關報道。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種用細胞組織學技術判定油棕幼嫩花序性別的方法，根據雌、雄花序在形態學和細胞組織學水平的差異，提早在雌雄未顯性期判定雌、雄花序性別，為進一步研究油棕花序性別分化機制與外界因子的關系提供基礎，這對于在油棕生產中實現花期和性別比例調控、提高產量等具有重要意義。

本發明的技術原理：

油棕成齡樹的各花序都處于不同的發育期，本發明的發明人以莖頂端分生組織記為0，最靠近它的花序記為N1，接著是N2、N3……，按順序依次對花序排序編號，不同的花序編號代表花序不同的發育階段。每個花序的整體長度，以及去除苞片后的長度變化規律見表1、附圖1、附圖2。每個花序的整體質量，以及去除苞片后的花序質量變化規律見表2、圖3、圖4。

表1油棕花序發育過程中長度變化情況

表2油棕花序發育過程中質量變化情況

從表1、表2以及圖1～4可以看出，N1～N44階段，花序的發育速度非常緩慢。從N45開始，花序迅速發育，花序長度和質量呈指數式顯著增長，這一時期為花序發育指數增長期(the exponential growth stage of the inflorescence,EGSI)。油棕花性別分化之初，花序開始迅速發育，進入EGSI。雌、雄花序的生長曲線大致相同，大體上雄花序的長度大于雌花序的長度。作為花序的保護性器官，苞片的長度和質量增長在花序生長中占有重要部分。去除苞片的花序的質量增長相對于苞片的質量增長有遲滯現象。隨著花序不斷發育，苞片持續生長并木質化。

研究分析表明，油棕花序的發育過程可分為雌雄未顯性期(N1～N46)和雌雄顯性期(N47～N56)兩個主要階段，其中雌雄未顯性期發育時間要比雌雄顯性期長得多，約占總時期的80％。

雌雄未顯性期：包括Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期：Ⅰ期是性別未分化期，包括N1～N26花序階段；Ⅱ期是過渡期，包括N27～N37花序階段(在N27階段，小穗軸分生組織出現；N35時小穗軸分生組織即形成花苞片原基；N36時小穗軸分生組織發育出花苞片)；Ⅲ期是性別分化期，包括N38～N46花序階段，花序發育間隔時間總長約為4.5個月，是可用細胞組織學技術判定花序性別時期，花序發育后，花序在小穗軸上依循花苞片原基生長(N38階段)→花苞片以及新的花苞片原基生長(N39、N40)→花原基分生組織形成(N41～46階段)這個順序發育分化，雄花序、雌花序在小穗軸上的相關花苞片原基數、花苞片數以及新的花苞片原基數、花原基分生組織數有著數量級的差別(根據統計，成熟雌花序每個小穗軸上長有5～30朵三基花，而成熟雄花序每個小穗軸上長有400～500朵雄花)，可以據此判定幼嫩花序性別。例如，在花原基分生組織形成階段，某一花序小穗軸上的花原基分生組織數都遠遠大于雌花序小穗軸花原基分生組織數(1個花原基分生組織將發育成1朵成熟花)，具有數量級的差別，而且處于雄花序每小穗軸花原基數目的區域，而且它們都還在生長，花原基的數目仍在增加，可判定該花序為雄花序。

本發明的發明人通過對雌雄未顯性期花序發育過程進行切片觀察(如圖5所示)：

N1階段，在葉原基下存在一簇細胞，為花序原基(圖5-1)，大小為0.3mm，是在光學顯微鏡下看到的花序發育的最早時期。此時細胞含有1個較大的細胞核。

N6階段，花序原基起始發育出先出葉原基(圖5-2)，整個花序的大小為0.85mm。此時，花序原基的中央為圓頂狀，兩側為先出葉原基。隨后，先出葉伸長(圖5-3)。

N10階段，先出葉完全包裹住花序原基，此時整個花序的大小為1.15mm；而且，花序原基兩側出現花梗苞片原基(圖5-4)。花梗苞片原基細胞繼續分裂、生長成為花梗苞片(圖5-5)。此時，先出葉出現維管化。花梗苞片繼續伸長。N14階段，花梗苞片完全包裹住花序分生組織(圖5-6)，此時花序長度為2.2mm。

當先出葉和花梗苞片包裹住花序分生組織以后，花序軸兩側出現小穗軸苞片原始細胞，此時為N15花芽階段(圖5-7)，花序長度仍為2.2mm。小穗軸苞片原始細胞繼續發育成小穗軸苞片原基、小穗軸苞片(圖5-8)。此時花梗苞片出現維管化。

隨著小穗軸苞片的生長及數目的增多，在小穗軸苞片的基部出現小穗軸分生組織(圖5-9:N27花序階段)，此時花序長度為10mm。小穗軸分生組織的細胞有較大的核質比。小穗軸分生組織的發育方式為自頂部向基部發育(圖5-10顯示：在花序軸頂部的小穗軸苞片基部已出現小穗軸分生組織，而基部的小穗軸苞片還未出現小穗軸分生組織)。小穗軸分生組織呈圓錐形(圖5-11)，圍繞花序軸呈螺旋狀排列(圖5-12)。

小穗軸分生組織繼續發育。N36階段時，小穗軸分生組織發育出花苞片，此時花序大小為26.5mm(圖5-13)。從圖5-14可以看出，頂部小穗軸的發育速度快于基部的小穗軸。

本發明的發明人通過對雌雄顯性期的雌花序發育過程進行切片觀察(如圖6所示)：

在雌花序中，小穗軸上每個花苞片下會長出一朵三基花。三基花由中間一朵有功能的雌花及其兩側的伴隨雄花組成。發育到一定階段，伴隨雄花會敗育脫落。三基花為蝎尾狀聚傘花序。

約N47階段，小穗軸分生組織形成的三基花苞片腋下出現花分生組織(圖6-1)。此時花分生組織的細胞含有1個較大的核，處于活躍狀態。花分生組織由三部分組成(圖6-2)：最外層是明顯的一層細胞(L1)，將來發育成表皮細胞；L1層下是數層活躍的等徑細胞，含有較大細胞核；等徑細胞下的區域內，細胞核質比較小，細胞中有液泡出現。花分生組織分化出小苞片1(B1)，B1腋下發育出伴隨雄花1(asf1)(圖6-3)。在B1的腋下與asf1之間出現一簇細胞，將來發育出小苞片2(B2)，B2的腋下靠近B1的位置隨后發育出伴隨雄花2(asf2)。位置排列順序為B1、asf2、B2、asf1。伴隨雄花1和伴隨雄花2之間的發育是不同步的，asf1的發育快于asf2。

N48階段，在B2的腋下與asf2之間出現一簇分生細胞(圖6-4)，這些細胞隨后發育出小苞片3(B3)，B3的腋下發育出雌花(ff)，ff在B2和B3之間。此時asf1已發育出萼片和花瓣原基，asf2的萼片原基也已出現。這種發育方式符合蝎尾狀聚傘花序的特點。

N49階段，伴隨雄花的萼片和花瓣都已出現(圖6-5)，而且部分伴隨雄花已發育出雄蕊原基(圖6-6)。雄花萼片末端的細胞液泡化。此階段時，雄花的花梗伸長，直到高于雌花。雌花的分生組織生長變大，但仍只發育出小苞片(B3)，此時的雌花小于雄花。

N51階段，雌花的分生組織開始發育，而此時伴隨雄花保持原樣(圖6-7)。隨后，雌花的生殖器官繼續發育，同時發育出雌蕊群和雄蕊群(圖6-8)。此時，雌花萼片末端的細胞液泡化。同時，伴隨雄花發育出發藥(圖6-9)。花藥的一側細胞出現液泡化，而另一側的細胞有一個較大的細胞核。

N52階段，雌花發育速度快于雄花。雌花迅速變大，而伴隨雄花大小保持不變(圖6-10)。伴隨雄花中的萼片、花瓣及花藥末端的一些細胞中積累多酚，花瓣的一些細胞空泡化。并且，花藥中出現花粉囊(圖6-11)。雌花中，心皮基部已發育出子房原基(圖6-12)。雌花萼片、花瓣末端的細胞出現液泡化現象。

N53階段，雌花繼續發育，雄花仍保持不變(圖6-13)。伴隨雄花會在花成熟前脫落。絕大多數雌花有3片萼片，3片花瓣(圖6-14，其中1、2為小苞片2、小苞片3)，但也有個別雌花有4片萼片，4片花瓣(圖6-15，其中1、2為B2、B3)；其外形和質地相同，都為淡黃色。剝去花瓣和萼片，在體視顯微鏡下觀察，可以看到雌花有3個自由心皮(圖6-16)。根據雌花橫切片可以看出，子房為3心室，每個心室都有1個胚珠(圖6-17)。在心皮的基部和末端之間有1個通道，為花柱道(圖6-18)，它是花粉管在受精之前的通道。

本發明的發明人通過對雌雄顯性期的雄花序發育過程進行切片觀察(如圖7所示)：

約N47階段，花苞片下長出花分生組織(圖7-1)。花分生組織呈圓錐形，細胞都有1個較大的核(圖7-2)。

N49階段，花分生組織一側長出萼片(圖7-3)。從此圖可以看出雄花的分生組織也可分為3層：最外層是明顯的一層細胞(L1)，將來發育成表皮細胞；L1層下是數層活躍的等徑細胞，含有較大細胞核(L2)；等徑細胞下的區域內，細胞核質比較小，細胞中有液泡出現(L3)。

N50階段，花分生組織兩側起始發育出花瓣原基(圖7-4)。此時，萼片末端的細胞出現液泡化。

N51階段，雄花的雄蕊原基開始發育(圖7-5)。此時，萼片及花瓣末端區域的細胞液泡化。N52階段，雄蕊出現(圖7-6)。N53階段，雄花中花藥出現(圖7-7)。此時，花藥的細胞都含有一個較大的細胞核，表明發育初期的花藥由分裂活躍的細胞組成。由花藥縱切圖可以看出，花藥由最外層的一層表皮和內部的同型細胞組成(圖7-8)。隨后隨著花藥的發育，表皮下出現4組孢原細胞，孢原細胞的細胞核大于表皮內部其它細胞的細胞核(圖7-9)。由雄花橫切面可看出：每朵雄花有3片萼片，3片花瓣，6個雄蕊(圖7-10)。孢原細胞通過1次平周分裂分為內外兩層，內層為造孢細胞，將來發育成小孢子母細胞，外層為初生壁細胞。

N55階段，花粉囊內出現小孢子母細胞并且開始進行減數分裂。小孢子母細胞較大，細胞質濃(圖7-11)。N56階段，小孢子母細胞開始積累胼胝質壁，并且小孢子母細胞的細胞核大(圖7-12)。此時，觀察花藥橫切面可看到其橫切面似蝶形(圖7-13)。隨后，小孢子母細胞開始進行減數分裂，第1次減數分裂后產生一個小孢子二分體(圖7-14)，第2次減數分裂后形成4個單倍體細胞，即4個小孢子。減數分裂剛完成時，4個小孢子仍然被包裹在胼胝質內，排列成四面體型(圖7-15)。后來隨著胼胝質壁的消失，4個小孢子被釋放出來(圖7-16)。剛釋放出來的小孢子形狀不規則。小孢子繼續發育，最終形成似三角形的花粉粒(圖7-17)。

發明人的研究表明，油棕雌花在性別分化前期有一個兩性期階段，由1個在中央的有功能的雌花和分別在其兩側的2個伴隨雄花組成，隨著花序的發育，伴隨雄花選擇性敗育，在開花之前脫落。而雄花在性別分化后雌蕊不生長，只保留了一個退化雌蕊，不存在兩性期階段，直接進入單性期。這種差別說明一旦進入性別分化期之后，就很難對雌、雄花的性別進行轉換，要想調控提高雌花比例，應在性別分化前采取措施，即在雌雄未顯性期的Ⅱ期(過渡期)N35階段前進行油棕花序性別調控。

本發明所采用的技術方案：

一種用細胞組織學技術判定油棕幼嫩花序性別的方法，其具體步驟如下：

1、取材

在油棕樹上選取處于雌雄未顯性期Ⅲ期(性別分化期)的花序，先去掉先出葉和花梗苞片，然后再投入到FAA固定液中。

2、脫水與透明

將固定好的花序樣品依次在30％、50％、70％、100％的乙醇中放置2～3h。然后用正丁醇作為透明劑，在其中放置40～50h，每8h換一次透明劑。

3、浸蠟與包埋

55～65℃下，在體積比為1:1的正丁醇和石蠟的混合液中放置10～15h，然后在純蠟中再浸蠟10～15h，在這期間每4h換一次純蠟。然后用KEDEE KD-M生物組織包埋機對雌雄未顯性期Ⅲ期的幼嫩花序的小穗軸進行包埋。

4、切片與烤片

將包埋好的樣品進行修塊，然后用Leica RM2235旋轉切片機進行縱向切片(小穗軸的縱向)，厚度為5～10μm。在KD-H烘片機上，40～50℃進行烤片，時間為6～10h。

5、脫蠟與染色

(1)把蠟帶切片用松節油浸泡20min；(2)更換新的松節油，浸泡蠟帶切片20min；(3)用體積比位1:1的松節油和純酒精的混合液浸泡3min；(4)純酒精浸泡3min；(5)95％酒精浸泡2min；(6)85％酒精浸泡2min；70％酒精浸泡2min；(7)50％酒精浸泡2min；(8)1％的高碘酸浸泡(當環境溫度不超過20℃，氧化5～10min；當環境溫度高時則適當減少氧化時間)；(9)流水沖洗5～10min，然后用蒸餾水浸洗；(10)Schiff試劑避光染色10～30min；(11)0.5％的偏重亞硫酸鈉浸洗兩次，每次1～2min已達到分色目的；(12)流水沖洗5～10min，蒸餾水浸洗10～20min；(13)50～60℃情況下，1％的苯胺藍黑染色10min；(14)7％醋酸快速浸泡一下去除多余染料，空氣中干燥，然后用蒸餾水洗滌；(15)純酒精浸洗3min；(16)更換新的純酒精，浸洗3min；(17)更換新的純酒精，浸洗3min；(18)用體積比為1:1的純酒精和松節油混合液浸泡3min；(19)松節油浸泡5min；(20)更換新的松節油，浸泡5min；(21)用中性樹膠進行封片。最后利用裝有LEICA DFC500鏡頭的LEICA DMLB顯微鏡對切片進行觀察并拍照，計算花苞片原基數、花苞片數以及新的花苞片原基數、花原基分生組織數。

6、油棕幼嫩花序性別的判定

油棕幼嫩花序性別的判定規則：若A>50，或B>50，或C>50，則該花序為雄花序；若A<30，或B<30，或C<30，則該花序為雌花序。

A：每個小穗軸上的花苞片原基數；

B：每個小穗軸上的花苞片數以及新的花苞片原基數；

C：每個小穗軸上的花原基分生組織數。

本發明根據油棕的雌、雄花序在形態學和細胞組織學水平的差異，利用細胞組織學技術提早在雌雄未顯性期判定雌、雄花序性別，有效地縮短研究時間，加快研究進程，為進一步研究油棕花序性別分化機制與外界因子的關系提供基礎，這對于在油棕生產中實現花期和性別比例調控、提高產量等具有重要意義。

附圖說明

圖1：油棕花序發育完整過程長度變化規律

圖2：油棕花序(去除苞片)發育完整過程長度變化規律

圖3：整個發育過程中油棕花序的質量變化規律

圖4：整個發育過程中油棕花序(去除苞片)的質量變化規律

圖5：雌雄未顯性期油棕花序發育的細胞組織學觀察和分析

圖中：1：花序原基起始發育。2：先出葉起始發育。3：先出葉生長。4：花梗苞片原基起始發育。5：花梗苞片生長。6：花梗苞片完全包裹住花序分生組織。7：小穗軸苞片原基起始。8：小穗軸苞片出現。9：小穗軸分生組織起始發育。10：小穗軸分生組織數目增多。11：小穗軸分生組織生長。12：小穗軸呈螺旋狀排列。13：花苞片起始發育。14：花苞片生長。

縮略詞：Fb，花苞片；fpb，花梗苞片；Im，花序分生組織；Ip，花序原基；p，先出葉；pbp，花梗苞片原基；pp，先出葉原基；pv，維管束原帶；rab，小穗軸苞片；rabi，小穗軸苞片原始細胞；rabp，小穗軸苞片原基；Ram，小穗軸分生組織。

圖6：雌花發育的細胞組織學觀察和分析

圖中：1：雌花分生組織起始發育。2：花分生組織生長。3：小苞片1(B1)出現。4：雌花分生組織出現。5：雌花分生組織生長。6：伴隨雄花1出現雄蕊原基。7：雌花萼片發育。8：心皮起始發育。9：伴隨雄花中花藥發育。10：三基花的排列方式。11：伴隨雄花出現花粉囊。12：子房原基出現。13：雌花生長，而雄花停止發育。14，15：花被排列。16：體視顯微鏡下觀察到的心皮。17：胚珠出現。18：花柱道的縱切圖。

縮略詞：a，花藥；asf1，伴隨雄花1；asf2，伴隨雄花2；B1，小苞片1；B2，小苞片2；B3，小苞片3；c，心皮；ff，雌花；Fm，花分生組織；o，胚珠；ovp，子房原基；pd，花梗；pe，花瓣；ps，花粉囊；pv，維管束原；s，萼片；sta，退化雄蕊；stp，雄蕊原基。

圖7：雄花發育的細胞組織學觀察和分析

圖中：1：雄花分生組織出現。2：雄花分生組織生長。3：萼片起始發育。4：花瓣起始發育。5：雄蕊原基起始發育。6：雄蕊起始發育。7：花藥起始發育。8：雄蕊的橫切面。9：孢原細胞出現。10：雄蕊的排列方式。11：小孢子母細胞出現。12：小孢子母細胞開始積累胼胝質壁。13：花藥橫切面。14：小孢子二分體出現。15：小孢子四分體出現。16：4個小孢子被釋放出來。17：花粉呈近似三角形。

縮略詞：arc，孢原細胞；con，藥隔；ep，表皮細胞；L1，L2，L3：第一、二、三層細胞；msp，小孢子母細胞；st，雄蕊。

具體實施方式

下面結合實施例，對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規條件,或按照制造廠商所建議的條件。

油棕花序從開始發育到開放要經歷2～3年的時間(Corley，1976)，過程漫長，這為油棕生產中實現花期和性別比例調控、雜種優勢利用、提高產量和育種帶來很大困難。研究表明，至少有四種不同類型的因素可能參與性別決定和分化：非生物因素(如水分脅迫)、代謝因素(如碳儲量)、激素水平和遺傳因素。在水分脅迫下有利于形成雄花序(Corley,1976)。干旱條件具有使油棕雌花雄化的作用，但其生理學和遺傳學機理仍有待闡明。有早期文獻認為油棕具有性別可塑性。

實施例

步驟1.做好田地規劃和實驗設計。

用50畝地栽培油棕試管無性系苗，油棕苗齡、品種等須整齊一致。按照生產上的栽培密度進行規劃：1畝地種10株油棕。

設計非生物因素(如水分脅迫)、代謝因素(如碳儲量)、肥料元素種類和水平、激素水平等因素對油棕苗進行實驗處理。

步驟2.取材

隨機在種植園的三個地點(呈三角形分布)分別標記為A、B、C，每個地點挑選五株油棕樹，選取油棕處于雌雄未顯性期Ⅲ期的花序，分三個階段選取：①花苞片原基生長階段；②花苞片以及新的花苞片原基生長階段；③花原基分生組織形成階段。去除相應葉片，取出花序。

步驟3.花序長度和質量的測量

選取的花序的長度直接用刻度尺依次測量。每個花序測量整體長度，并測量去除苞片后的花序長度。

較大花序的質量在油棕園用電子天平(常熟市佳衡天平儀器有限公司恒佳牌DT-1000E型，最大稱量1000g，最小稱量0.01g，檢定分度值0.01g)稱量，較小花序(N47以下)的質量用千分之一電子天平(型號：Precisa XS365M-SCS，最大稱量365g，最小稱量0.001g，檢定分度值0.001g)稱量。每個花序稱量整體質量，并稱量去除苞片后的花序質量。

將所取花序的整體長度、去除苞片后的花序長度、整體質量以及去除苞片后的花序質量與表1～表2的相應數據進行對比，觀察其吻合程度，確定所選取的花序是否為目標材料。

步驟4.油棕花序石蠟組織切片的制做和細胞組織學分析

根據實際情況，對雌雄未顯性期Ⅲ期的幼嫩花序做縱向切片進行顯微觀察。

4.1油棕花序石蠟組織切片的制做

4.1.1固定

將樣品花序先去掉先出葉和花梗苞片，然后再投入到FAA固定液中。在FAA固定液中放置至少24h，也可長期保存。

4.1.2脫水與透明

將固定好的材料依次在30％、50％、70％、100％的乙醇中放置2h。然后用正丁醇作為透明劑，在其中放置2天，每8h換一次透明劑。

4.1.3浸蠟與包埋

60℃下，在體積比為1:1的正丁醇和石蠟的混合液中放置12h，然后在純蠟中再浸蠟12h，在這期間每4h換一次純蠟。然后用KEDEE KD-M生物組織包埋機對花序的小穗軸進行包埋。

4.1.4切片與烤片

將包埋好的樣品進行修塊，然后用Leica RM2235旋轉切片機沿著小穗軸的縱向進行切片，厚度為8μm。在KD-H烘片機上，45℃進行烤片，時間為8h。

4.1.5脫蠟與染色

(1)把蠟帶切片用松節油浸泡20min；(2)更換新的松節油，浸泡蠟帶切片20min；(3)用體積比為1:1的松節油和純酒精的混合液浸泡3min；(4)純酒精浸泡3min；(5)95％酒精浸泡2min；(6)85％酒精浸泡2min；70％酒精浸泡2min；(7)50％酒精浸泡2min；(8)1％的高碘酸浸泡(當環境溫度不超過20℃，氧化7.5min；當環境溫度高時則適當減少氧化時間)；(9)流水沖洗7.5min，然后用蒸餾水浸洗；(10)Schiff試劑避光染色20min；(11)0.5％的偏重亞硫酸鈉浸洗兩次，每次1.5min已達到分色目的；(12)流水沖洗7.5min，蒸餾水浸洗15min；(13)55℃情況下，1％的苯胺藍黑染色10min；(14)7％醋酸快速浸泡一下去除多余染料，空氣中干燥，然后用蒸餾水洗滌；(15)純酒精浸洗3min；(16)更換新的純酒精，浸洗3min；(17)更換新的純酒精，浸洗3min；(18)用體積比為1:1的純酒精和松節油混合液浸泡3min；(19)松節油浸泡5min；(20)更換新的松節油，浸泡5min；(21)用中性樹膠進行封片。

步驟5.雌雄未顯性期Ⅲ期的幼嫩花序組織切片分析和性別判斷

利用裝有LEICA DFC500鏡頭的LEICA DMLB顯微鏡對切片進行觀察并拍照，計算花苞片原基數、花苞片數以及新的花苞片原基數、花原基分生組織數量，各項指標小于30個為一組，編號1；大于50個為一組，編號2，分別計算平均數，結果見表3。

表3油棕雌雄未顯性期Ⅲ期花序小穗軸上各項判定指標

上述結果表明，雄花序、雌花序每個小穗軸上的相關花苞片原基數、花苞片數以及新的花苞片原基數、花原基分生組織數顯著不同，有數量級的差別，而且花序都還在生長，在過渡到雌雄顯性期時花原基的數目仍在增加，據此可以判定在花苞片原基數、花苞片數以及新的花苞片原基數或花原基分生組織數小于30個時為雌性、大于50個時為雄性。因此，本發明利用細胞組織學技術提早在雌雄未顯性期判定雌雄花序性別，大大縮短研究時間，加快研究進程，為研究不同實驗因素和處理對于油棕花序性別調控的影響提供基礎，具有重要意義。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。