本發明屬于干細胞領域，涉及腫瘤干細胞的凍存，具體涉及一種乳腺癌干細胞凍存保護劑及制成的凍存保護試劑盒。
背景技術：
申請人同日申請了“一種從乳腺癌細胞株中富集乳腺癌干細胞的試劑、試劑盒”，該申請提供的試劑能有效從人乳腺癌MCF-7細胞系中便捷、高效地富集得到乳腺癌干細胞，細胞球形成周期短(由現有技術的7天縮短至3天且形成效率顯著提高)、微球體細胞中CD44+CD24-/low分子標記的腫瘤細胞和SP細胞含量高(均由現有技術的10％以下提高到50％以上)，可以開發成試劑盒提高科研工作者富集乳腺癌干細胞的效率。
本申請是為了解決另一個問題：富集到的乳腺癌干細胞如何凍存以最大限度的保留其乳腺癌干細胞特性？研究者不可能每次需要用乳腺癌干細胞時都重新進行乳腺癌細胞的培養、富集，通常都需要根據實驗進度對乳腺癌干細胞進行凍存、復蘇后繼續傳代使用。乳腺癌干細胞的凍存方法關乎到復蘇后的乳腺癌干細胞所能傳代的次數以及特性保持。
申請人對現有技術進行了檢索，未發現專用于乳腺癌干細胞的凍存保護劑。考慮到乳腺癌干細胞也是一種干細胞，而現有技術對干細胞的凍存保護劑研究較多。
冷凍保存的目的是在液氮的低溫環境下減緩細胞的代謝活動并維持生命。在細胞懸液的冷凍過程中，冰晶的形成是導致細胞死亡的主要原因之一。避免冰晶的形成就要保持冷卻速率緩慢，以使凍存保護劑逐漸進入細胞內部形成濃度梯度。當冷卻持續進行時，細胞內的水分在凍存劑的滲透壓力下逐步流出細胞，當細胞內的凍存劑濃度達到最大時細胞就會完全脫水皺縮達到最佳凍存狀態。如果凍存速率太快就不能讓細胞內的水分完全出胞，從而導致細胞內的冰晶形成而對細胞造成損傷。但凍存液對細胞有一定毒性作用，凍存速率過低會導致細胞在凍存液中暴露的時間過長而導致細胞受毒。由凍存保護劑造成的細胞毒性和細胞內冰晶造成細胞損傷這兩種凍存傷害已被廣泛認同。
除了冷凍速率，冷凍保護劑也是減小凍存損傷需要考慮的重要因素之一。冷凍保護劑根據穿過細胞膜的能力被分為滲透性保護劑和非滲透保護劑。滲透性冷凍保護劑有二甲基亞砜、丙三醇、乙二醇、丙二醇、甲醇、乙醇、丙醇、甲酰胺等，主要作用是防止細胞內冰晶形成、避免高濃度凍存劑的毒性和使細胞在耐受度內脫水。滲透性保護劑的保護能力是由許多小分子構成的高溶解度的水溶性復合物，在高濃度下能夠降低水的冰點，因此在冷凍過程中降低了大量冰晶的形成。非滲透性冷凍保護劑有海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、聚合物羥乙基淀粉和聚乙烯吡咯烷酮，它們能夠在較低的濃度下保護細胞，但要求更高的冷凍速率。如聚合物羥乙基淀粉不能滲入導致細胞外的濃度增大，在低溫下形成反滲透而脫水起到保護作用。換言之，非滲透性冷凍保護劑集中在細胞外導致細胞脫水主要是在冷凍的初始階段。海藻糖的保護作用是和脂膜之間的相互作用，在凍存和復蘇的過程中保持了蛋白質的穩定性，而且能夠形成玻璃化基質抑制細胞內冰晶產生。但即便是非滲透性的保護劑，也是能引起細胞損傷的。
以間充質干細胞的凍存研究為例。為比較凍存率、冷凍保護劑和凍存時間對MSCs的影響，研究者們做了大量的研究。早在1997年，有研究將人骨髓MSCs用10％的DMSO在1℃/min到-80℃后凍存在液氮中，24h復蘇后傳代到15代依然保持成骨分化的能力[Growth kinetics,self-renewal,and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation.J Cell Biochem.1997Feb；64(2):278-94.]。隨后，有研究用10％的DMSO將從人骨髓中分離得到MSCs在1℃/min降至-70℃后在液氮中保存7d，和未凍存的MSCs相比在增殖速率和成骨分化能力上沒有顯著的差異[Characterisation of cryopreserved cells freshly isolated from human bone marrow.Cryo Letters.2006Jan-Feb；27(1):17-28.]。有研究將人臍帶血MSCs用10％DMSO和10％FBS的凍存液凍存在-70℃后在液氮中保存，用臺盼藍染色的方法得到保存了5a的存活率為80％±10％，凍存2a的為89％±5％，并且復蘇后仍有成纖維的形態，并能鑒測到CD73、CD90和CD105表面抗原，用茜素紅染色鈣沉積和阿爾新藍染色蛋白聚糖的方法表明復蘇后的MSCs仍保持成骨和成軟骨的的分化能力[C-2012:Post-thaw characterization of cord blood-derived mesenchymal stromal cells cryopreserved for up to five years.Cryobiology,2014,69(3):519]。這些研究的重點都是在MSCs凍存后的最高細胞存活率和功能，最大化保證凍存后的MSCs和最新分離出來的MSCs表現相同特性。
遺憾的是，現有技術中這些針對干細胞的凍存保護劑并不能很好地適用于乳腺癌干細胞的凍存，難以有效保持乳腺癌干細胞凍存前的生物學特性。
技術實現要素：
本發明旨在提供一種乳腺癌干細胞凍存保護劑及由此制成的凍存保護試劑盒，以有效減少凍存對乳腺癌干細胞的損傷。
技術方案公布如下：
一種乳腺癌干細胞凍存保護劑，用于凍存保護MCF-7乳腺癌干細胞，由無血清培養基凍干粉和胎牛血清FBS組成；所述無血清培養基凍干粉由如下方法制備：在DMEM/F12培養液中添加常規生長因子、加蘭他敏和石蒜堿，常規生長因子包括重組人表皮生長因子EGF、牛血清白蛋白BSA、胰島素和B27，配制成EGF濃度為15-25g/L、BSA濃度為3-5g/L、胰島素濃度為4-6mg/L、濃度為1.5-2.5％、加蘭他敏濃度為50-100nmol/L、石蒜堿濃度為50-100nmol/L的培養液，于37℃、5％CO2條件下搖床保存20-28h，冷凍干燥。
優選地，所述無血清凍干粉濃度為60-90g/L。
優選地，所述的乳腺癌干細胞凍存保護劑由無血清培養基凍干粉和胎牛血清FBS組成，無血清凍干粉濃度為75g/L；所述無血清培養基凍干粉由如下方法制備：在DMEM/F12培養液中添加常規生長因子、加蘭他敏和石蒜堿配制成EGF濃度為20g/L、BSA濃度為4g/L、胰島素濃度為5mg/L、濃度為2％、加蘭他敏濃度為75nmol/L、石蒜堿濃度為75nmol/L的培養液，于37℃、5％CO2條件下搖床保存24h，冷凍干燥。
一種乳腺癌干細胞凍存保護試劑盒，與胎牛血清FBS配合用于凍存保護MCF-7乳腺癌干細胞，包括分裝的無血清培養基凍干粉，無血清培養基凍干粉由如下方法制備：在DMEM/F12培養液中添加常規生長因子、加蘭他敏和石蒜堿配制成EGF濃度為20g/L、BSA濃度為4g/L、胰島素濃度為5mg/L、濃度為2％、加蘭他敏濃度為75nmol/L、石蒜堿濃度為75nmol/L的培養液，于37℃、5％CO2條件下搖床保存24h，冷凍干燥。
優選地，所述的乳腺癌干細胞凍存保護試劑盒還包括干燥劑或防腐劑或抗氧化劑。
發明效果：
本發明提供的凍存保護劑是在MCF-7乳腺癌干細胞富集培養基的基礎上設計而成，能有效減少凍存對乳腺癌干細胞的損傷，復蘇后的細胞存活率高，致瘤能力強，與凍存前無顯著差異，顯著優于現有技術。基于此制備的試劑盒有助于促進該凍存保護劑的商品化和標準化，為科研工作者提供便利。
具體實施方式
下面結合具體實施例介紹本發明的技術方案。下述實施例中未特別強調的實驗材料均為常規實驗材料，無特別要求，都是本領域技術人員容易獲得的常規材料。
實施例1：不同凍存保護劑對乳腺癌干細胞凍存復蘇后存活率和致瘤性的影響
1、實驗材料
MCF-7乳腺癌干細胞富集用含血清培養基：DMEM/F12培養液中加入10％的胎牛血清FBS和雙抗、加蘭他敏和石蒜堿共150nmol/L，二者摩爾比為1:1。1L培養基加入10ml青霉素-鏈霉素溶液(100×雙抗，北京雷根生物技術有限公司)。
MCF-7乳腺癌干細胞富集用無血清培養基：DMEM/F12培養液中加入雙抗(濃度同上)、重組人表皮生長因子EGF 20g/L、牛血清白蛋白BSA4g/L、胰島素5mg/L、B272％(1L培養基加20ml 50X B27)、加蘭他敏和石蒜堿共150nmol/L，二者摩爾比為1:1。
MCF-7乳腺癌干細胞傳代用無血清培養基：DMEM/F12培養液中加入雙抗(濃度同上)、重組人表皮生長因子EGF 20g/L、牛血清白蛋白BSA4g/L、胰島素5mg/L、B272％(1L培養基加20ml 50X B27)，無需添加加蘭他敏和石蒜堿。
本發明凍存保護劑：由無血清培養基凍干粉和胎牛血清FBS組成，無血清凍干粉濃度為75g/L；所述無血清培養基凍干粉由如下方法制備：在DMEM/F12培養液中添加常規生長因子、加蘭他敏和石蒜堿配制成EGF濃度為20g/L、BSA濃度為4g/L、胰島素濃度為5mg/L、濃度為2％、加蘭他敏濃度為75nmol/L、石蒜堿濃度為75nmol/L的培養液，于37℃、5％CO2條件下搖床保存24h，冷凍干燥。
對比凍存保護劑：基于DMSO的標準凍存液，由10％DMSO和90％胎牛血清FBS組成。
2、實驗方法
(1)貼壁培養MCF-7細胞系
MCF-7細胞系在上述MCF-7乳腺癌干細胞富集用含血清培養基中于37℃、5％CO2的細胞培養箱內培養，貼壁后當細胞增殖至85％左右時，處于對數生長期，用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化、離心、重懸后傳代。
(2)微球體培養(MCF-7乳腺癌干細胞富集)
取第2代處于對數生長期的MCF-7細胞用上述MCF-7乳腺癌干細胞富集用無血清培養基重懸細胞以2×104/mL接種至塑料培養瓶中于37℃、5％CO2的細胞培養箱內培養每2-3天更換1次培養液，第3、5、7天計數其中的微球體數目、大小，并計算微球體形成效率。其中，微球體形成效率＝微球體數目/接種細胞數×100％。定義≥60μm的球體為微球體。把25cm2的培養瓶底面分割成25個等面積的小格，隨機選取15個小格，計數≥60μm的微球體的數量。
(3)MCF-7乳腺癌干細胞凍存
實驗組：配制0.05％trypsin-0.53mmol/L EDTA-4Na的干細胞消化液；消化第3天微球體并吹打；鏡下見大多數單細胞形成時終止消化，1500r/min離心6min，吸棄上清；加入本發明凍存保護劑，吸吹均勻，細胞濃度調整至1×106個/mL，分裝于凍存管中，標記凍存日期。按照非程序化凍存法凍存(-4℃，1h；置厚壁泡沫中于-80℃保存)。
對照組：配制0.05％trypsin-0.53mmol/L EDTA-4Na的干細胞消化液；消化第3天微球體并吹打；鏡下見大多數單細胞形成時終止消化，1500r/min離心6min，吸棄上清；加入對比凍存保護劑，吸吹均勻，細胞濃度調整至1×106個/mL，分裝于凍存管中，標記凍存日期。按照非程序化凍存法凍存(-4℃，1h；置厚壁泡沫中于-80℃保存)。
(4)復蘇方法
將凍存1周的細胞置于60℃恒溫水浴箱中，0.5min內快速復蘇。融化后迅速移入離心管中，加入DMEM/F12培養基，吹吸均勻，以1000r/min離心5min，棄去上清。重復1次。
(5)復蘇后的細胞存活率測定
將復蘇細胞用臺盼藍染色后，利用血細胞計數板計數細胞，測定臺盼藍拒染率，并與冷凍前相比較，計算細胞存活率：細胞存活率＝(1-臺盼藍染色細胞數/總細胞數)×100％。
(6)致瘤性測定
A、凍存前致瘤性測定用細胞懸液的制備：
第3天微球體單細胞懸液的制備：配制0.05％trypsin-0.53mmol/L EDTA-4Na的干細胞消化液；消化微球體并吹打；鏡下見大多數單細胞形成時終止消化，1500r/min離心6min，吸棄上清；加入DMEM/F12培養液重懸制成濃度2×102/ml、2×104/ml、2×106/ml單細胞懸液。
B、實驗組凍存后致瘤性測定用細胞懸液的制備：
將復蘇細胞以1×105/mL接種至上述MCF-7乳腺癌干細胞傳代用無血清培養基于37℃、5％CO2的培養箱內培養48小時后將其消化加入DMEM/F12培養液重懸制成濃度2×102/ml、2×104/ml、2×106/ml單細胞懸液。
C、對照組凍存后致瘤性測定用細胞懸液的制備：
將復蘇細胞以1×105/mL接種至上述MCF-7乳腺癌干細胞傳代用無血清培養基于37℃、5％CO2的培養箱內培養48小時后將其消化加入DMEM/F12培養液重懸制成濃度2×102/ml、2×104/ml、2×106/ml單細胞懸液。
將上述單細胞懸液分別接種于小鼠左、右背部皮下，每部位接種0.2ml。觀察接種后8周的腫瘤生長情況。
3、實驗結果
(1)細胞存活率
實驗組細胞存活率為(96.4±4.9)％；對照組細胞存活率為(77.8±4.2)％。
由此可見，與現有技術中基于DMSO的標準凍存液相比，本發明提供的凍存保護劑具有更為優異的保護效果，能最大限度避免乳腺癌干細胞在凍存過程中的死亡。
(2)致瘤性
8周后各組成瘤情況如下表(√代表成瘤；×代表未成瘤)：
由此可見，與現有技術中基于DMSO的標準凍存液相比，本發明提供的凍存保護劑具有更為優異的保護效果，能最大限度保護乳腺癌干細胞的致瘤性。
實施例2：凍存保護試劑盒
一種乳腺癌干細胞凍存保護試劑盒，與胎牛血清FBS配合用于凍存保護MCF-7乳腺癌干細胞，包括分裝的無血清培養基凍干粉，無血清培養基凍干粉由如下方法制備：在DMEM/F12培養液中添加常規生長因子、加蘭他敏和石蒜堿配制成EGF濃度為20g/L、BSA濃度為4g/L、胰島素濃度為5mg/L、濃度為2％、加蘭他敏濃度為75nmol/L、石蒜堿濃度為75nmol/L的培養液，于37℃、5％CO2條件下搖床保存24h，冷凍干燥。
試劑盒中還可以設有分包裝的硅膠干燥劑或防腐劑或抗氧化劑等。
本發明提供的凍存保護劑是在MCF-7乳腺癌干細胞富集培養基的基礎上設計而成，能有效減少凍存對乳腺癌干細胞的損傷，復蘇后的細胞存活率高，致瘤能力強，與凍存前無顯著差異，顯著優于現有技術。基于此制備的試劑盒有助于促進該凍存保護劑的商品化和標準化，為科研工作者提供便利。
上述具體實施例僅用于解釋本發明的技術方案，本領域技術人員應當明白，本發明的保護范圍并不受限于上述具體實施例。