本發明涉及食品安全領域，具體涉及一種通過紅茶菌消減枸杞中有機磷農藥毒死蜱殘留的方法。
背景技術：
：枸杞是我國西北地區的主要栽培經濟植物，是適合于經濟林、水土保持林、生態林等的多用途樹種。西北地區因其獨特的高海拔、強光照的地理特點及土壤和氣候條件，特別適合枸杞生長，出產的枸杞鮮果玲瓏剔透，紅艷欲滴，狀似紅寶石，色紅粒大，籽少、肉厚、糖分高，大小均勻，品質優良，頗受市場歡迎。枸杞作為西北地區特色產業，發展日趨壯大。由于西北地區生態多樣性較低，病蟲害天敵未能形成強大種群，故隨著種植規模不斷擴大，病蟲害日益增多，農藥施用必不可少。農藥的實際利用率往往很低，因為能夠真正用于殺蟲、殺菌的農藥只占所用農藥量的10％～20％，而大量過剩農藥則直接落于土壤中，或以微粒形式融于空氣中。因此，枸杞產品中農藥殘留成為食品安全隱患，并直接降低枸杞產品品質和枸杞產業效益。有機磷農藥有品種多、藥效高、應用范圍廣、成本低等優點，在我國是用量最多、范圍最廣的農藥，使用量占農藥總量的80％～90％。毒死蜱(Chlorpyrifos)是一種高效、廣譜、中等毒性的有機磷類殺蟲劑，具有良好的觸殺、胃毒和熏蒸作用，廣泛用于防治多種作物上的螟蟲、粘蟲、介殼蟲、蚜蟲、棉鈴蟲、薊馬、葉蟬和螨類等害蟲。隨著高效高毒農藥(如甲胺磷、水胺硫磷等)的禁用，毒死蜱逐漸代替高效高毒農藥，使用范圍越來越廣，用量越來越大，并已成為防治枸杞病蟲害的重要農藥。因此，消減毒死蜱在枸杞產品中的殘留對于提升枸杞品質和保障食品安全具有重要意義。微生物降解法以其作用溫和、降解產物對環境污染小等優點成為消減農藥殘留的有效策略。酯酶由于其底物適應的廣泛性，對有機磷、有機氯、菊酯、氨基甲酸酯等類農藥均有降解作用。許多微生物均能產生酯酶，將具有產酯酶活性的酵母、醋酸菌和乳酸菌共生培養成微生態穩定的紅茶菌，可望開拓出食品級安全、降解效率高且能夠持久起作用的農藥殘留消減策略。技術實現要素：本發明提供一種通過紅茶菌消減枸杞中有機磷農藥殘留的方法，將紅茶菌發酵液噴施到結果期的枸杞植株上以及土壤中，發揮紅茶菌所產酯酶降解有機磷農藥毒死蜱殘留的效力。一種通過紅茶菌消減枸杞中有機磷農藥殘留的方法，包括以下步驟：1)將SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165分別制成菌懸液；2)將SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌懸液、AcetobacterspCICC20441菌懸液和LactobacillusplantarumCICC23165菌懸液混合加入含蔗糖的茶汁中，靜置培養，形成菌膜后即為紅茶菌發酵成熟，得到紅茶菌發酵液；3)有機磷農藥毒死蜱施藥后，將紅茶菌發酵液噴灑到結果期的枸杞植株上以及土壤中，從而消減枸杞中有機磷農藥毒死蜱殘留。本發明中，SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165三者共生而長成紅茶菌過程中，所產酯酶活力持續增長，形成菌膜后，紅茶菌發酵成熟，酯酶持久維持高活力。本發明中，紅茶菌產生對人體無害而對有機磷農藥毒死蜱具有降解作用的酯酶，能夠消減毒死蜱殘留。步驟1)中，SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165采用現有技術，來自中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)，地址：北京市朝陽區酒仙橋中路24號院6號樓；菌種保持編號分別為CICC33068、CICC20441和CICC23165。將SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165分別制成菌懸液，包括：出發密度均為106～107cfu/mL，接種量均為1％～5％，將SaccharomycescerevisiaeCICC33068接種至YPD液體培養基，將AcetobacterspCICC20441接種至AC液體培養基，將LactobacillusplantarumCICC23165接種至MRS液體培養基，均在33℃～39℃振蕩培養20～28h，至菌液密度為108～109cfu/mL的菌懸液。所述的接種量是指移入種子液的體積和接種后培養液體積的比例。進一步優選，將SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165分別制成菌懸液，包括：出發密度均為106～107cfu/mL，接種量均為2％～3％，將SaccharomycescerevisiaeCICC33068接種至YPD液體培養基，將AcetobacterspCICC20441接種至AC液體培養基，將LactobacillusplantarumCICC23165接種至MRS液體培養基，均在33℃～39℃振蕩培養20～28h，至菌液密度為108～109cfu/mL的菌懸液。所述的YPD液體培養基，以1L計，包括以下組分：該培養基的pH值調節至6.5～7.5。所述的AC液體培養基，以1L計，包括以下組分：該培養基的pH值調節至6.4～7.2。所述的MRS培養基，以1L計，包括以下組分：該培養基的pH值調節至6.0～6.6。進一步優選，所述的YPD液體培養基，以1L計，包括以下組分：該培養基的pH值調節至6.5～7.5。所述的AC液體培養基，以1L計，包括以下組分：該培養基的pH值調節至6.4～7.2。所述的MRS培養基，以1L計，包括以下組分：該培養基的pH值調節至6.0～6.6。步驟2)中，所述的含蔗糖的茶汁的制備包括：將紅茶茶葉添加到沸水中，煮沸后過濾，得到茶汁，茶汁中加入蔗糖溶解，滅菌，冷卻后，得到含蔗糖的茶汁。所述的紅茶茶葉的質量與沸水的體積之比為0.5g～2g：100mL，進一步優選，所述的紅茶茶葉的質量與沸水的體積之比為1g：100mL，即將紅茶茶葉以1％的濃度添加到沸水中。所述的蔗糖的質量與茶汁的體積為30g～80g：1L，所述的蔗糖的質量與茶汁的體積為50g：1L，即茶汁中按50g/L的濃度加入蔗糖溶解。將SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌懸液、AcetobacterspCICC20441菌懸液和LactobacillusplantarumCICC23165菌懸液按照體積比1：1：1混合加入含蔗糖的茶汁中。所述的靜置培養為在20～30℃靜置培養10天～20天。所述的SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌懸液與含蔗糖的茶汁的體積比為1～3：100。所述的AcetobacterspCICC20441菌懸液與含蔗糖的茶汁的體積比為1～3：100。所述的LactobacillusplantarumCICC23165菌懸液與含蔗糖的茶汁的體積比為1～3：100。進一步優選，所述的SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌懸液與含蔗糖的茶汁的體積比為2：100。所述的AcetobacterspCICC20441菌懸液與含蔗糖的茶汁的體積比為2：100。所述的LactobacillusplantarumCICC23165菌懸液與含蔗糖的茶汁的體積比為2：100。步驟3)中，所述的紅茶菌發酵液的噴灑量與結果期的枸杞植株的數目之比4～6升：9株，所述的結果期的枸杞植株在土地上的密集程度為7～11株枸杞/16米2土地。進一步優選，所述的紅茶菌發酵液的噴灑量與結果期的枸杞植株的數目之比5升：9株，所述的結果期的枸杞植株在土地上的密集程度為9株枸杞/16米2土地。與現有技術相比，本發明具有如下優點：本發明通過混合培養，使SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165三者共生而長成微生態穩定的紅茶菌，有機磷農藥毒死蜱施藥后，將紅茶菌發酵液噴灑到結果期的枸杞植株上以及土壤中，發酵液中的酯酶發揮對有機磷農藥毒死蜱殘留的降解作用，發酵液中的紅茶菌在枸杞植株和土壤中定殖并繼續自然發酵，持久產生酯酶。紅茶菌產生對人體無害而對有機磷農藥毒死蜱具有降解作用的酯酶，能夠消減毒死蜱殘留。具體實施方式實施例11)SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165的出發密度為106～107cfu/mL，分別接種至液體培養基(YPD培養基：蛋白胨20.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖20.0g，水定容至1000mL；該培養基的pH值調節至6.5。AC培養基：酵母膏10.0g，葡萄糖10.0g，碳酸鈣20.0g，水定容至1000mL；該培養基的pH值調節至6.4。MRS培養基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，葡萄糖20.0g，乙酸鈉5.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸鎂0.5g，硫酸錳0.2g，吐溫801.0mL，水定容至1000mL；該培養基的pH值調節至6.0。)中，接種量為1％，37℃振蕩培養24h，得到菌懸液，菌液密度分別為108～109cfu/mL。SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165采用現有技術，來自中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)，地址：北京市朝陽區酒仙橋中路24號院6號樓；菌種保持編號分別為CICC33068、CICC20441和CICC23165。2)將紅茶茶葉以1％的濃度(w/v，即茶葉的質量與沸水的體積之比為1g；100mL)添加到沸水中，煮沸5min后八層紗布過濾，得到茶汁，茶汁中按50g/L的濃度加入蔗糖溶解，121℃滅菌20min，冷卻至室溫25℃后，得到含蔗糖的茶汁，分別按照占茶汁1％(v/v)的比例，同時接入108～109cfu/mL的SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌懸液、AcetobacterspCICC20441菌懸液和LactobacillusplantarumCICC23165菌懸液，室溫25℃靜置培養10d，三者共生而長成紅茶菌過程中，所產酯酶活力持續增長，形成菌膜后，紅茶菌發酵成熟，酯酶持久維持高活力。在枸杞結果期，有機磷農藥毒死蜱施藥后，按照4升/9株枸杞16米2土地的用量噴灑紅茶菌發酵液，紅茶菌通過其磷酸酯酶活力降解毒死蜱。紅茶菌在發酵過程中，隨著其酯酶活力增長，降解毒死蜱的效力越大。酯酶活力在土壤中持久留存，意味著紅茶菌在土壤中定殖。3)經過步驟1)和步驟2)的處理后(1d之后)，枸杞和土壤中毒死蜱開始被降解(見表1)。毒死蜱測定：按照GB/T23200-2008，采用氣相色譜-質譜法。酯酶活力測定：以p-硝基苯月桂酸鹽(p-nitrophenyllaurate，p-NPL)為底物，測定p-NPL的水解度，以每分鐘水解1μmolp-NPL為1個酯酶活力單位，具體技術細節參照“Fucinosetal.JBiotechnol,2005,117,233-241.”。表1(試驗：紅茶菌噴施；對照：等量茶汁噴施)毒死蜱濃度(mg/kg)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(試驗)0.1450.1120.0960.0770.0450.0290.023根周土壤(試驗)0.2650.2130.1860.1440.0870.0490.028枸杞(對照)0.1390.1240.1030.0970.0860.0680.055根周土壤(對照)0.2780.2550.2180.1850.1650.1560.137磷酸酯酶活力(U/g)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(試驗)36.535.733.837.032.229.831.5根周土壤(試驗)39.944.346.544.640.939.542.7枸杞(對照)2.22.52.32.92.72.62.8根周土壤(對照)6.07.37.07.48.47.87.7試驗中，通過紅茶菌噴施，6天后，枸杞上毒死蜱降解率達到84.1％，土壤中毒死蜱降解率達到89.4％，分別比對照高23.7和38.7個百分點，說明紅茶菌對毒死蜱降解有明顯促進作用。表1還顯示，紅茶菌噴施后，枸杞上和土壤中酯酶活力極顯著地高于對照且保持穩定，說明紅茶菌通過產生酯酶而發揮對毒死蜱降解有明顯促進作用。實施例21)SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165的出發密度為106～107cfu/mL，分別接種至液體培養基(YPD培養基：蛋白胨20.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖20.0g，水定容至1000mL；該培養基的pH值調節至7.5。AC培養基：酵母膏10.0g，葡萄糖10.0g，碳酸鈣20.0g，水定容至1000mL；該培養基的pH值調節至7.2。MRS培養基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，葡萄糖20.0g，乙酸鈉5.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸鎂0.5g，硫酸錳0.2g，吐溫801.0mL，水定容至1000mL；該培養基的pH值調節至6.6)中，接種量為5％，37℃振蕩培養24h，得到菌懸液，菌液密度分別為108～109cfu/mL。SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165采用現有技術，來自中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)，地址：北京市朝陽區酒仙橋中路24號院6號樓；菌種保持編號分別為CICC33068、CICC20441和CICC23165。2)將茶葉以1％的濃度(w/v，即茶葉的質量與沸水的體積之比為1g；100mL)添加到沸水中，煮沸5min后八層紗布過濾，茶汁中按50g/L的濃度加入蔗糖溶解，121℃滅菌20min，冷卻至室溫25℃后，分別按照占茶汁3％(v/v)的比例，同時接入108～109cfu/mL的SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌懸液、AcetobacterspCICC20441菌懸液和LactobacillusplantarumCICC23165菌懸液，室溫25℃靜置培養10d以上，三者共生而長成紅茶菌過程中，所產酯酶活力持續增長，形成菌膜后，紅茶菌發酵成熟，酯酶持久維持高活力。在枸杞結果期，有機磷農藥毒死蜱施藥后，按照6升/9株枸杞16米2土地的用量噴灑紅茶菌發酵液，紅茶菌通過其酯酶活力降解毒死蜱。紅茶菌在發酵過程中，隨著其酯酶活力增長，降解毒死蜱的效力越大。酯酶活力在土壤中持久留存，意味著紅茶菌在土壤中定殖。3)經過步驟1)和步驟2)的處理后(1d之后)，枸杞和土壤中毒死蜱開始被降解(見表2)。毒死蜱測定與酯酶活力測定同實施例1。表2(試驗：紅茶菌噴施；對照：等量茶汁噴施)毒死蜱濃度(mg/kg)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(試驗)0.1560.1210.0950.0820.0560.0300.021根周土壤(試驗)0.2250.1730.1440.1200.0830.0450.025枸杞(對照)0.1400.1250.1060.0900.0780.0650.053根周土壤(對照)0.2680.2400.2060.1760.1590.1450.133磷酸酯酶活力(U/g)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(試驗)44.545.643.038.333.533.832.5根周土壤(試驗)42.040.547.739.643.639.342.5枸杞(對照)3.23.43.94.32.92.92.6根周土壤(對照)7.57.86.66.46.46.56.8試驗中，通過紅茶菌噴施，6天后，枸杞上毒死蜱降解率達到86.5％，土壤中毒死蜱降解率達到88.9％，分別比對照降低24.4和38.5個百分點，說明紅茶菌對毒死蜱降解有明顯促進作用。表2還顯示，紅茶菌噴施后，枸杞上和土壤中酯酶活力極顯著地高于對照且保持穩定，說明紅茶菌通過產生酯酶而發揮對毒死蜱降解有明顯促進作用。實施例31)SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165的出發密度為106～107cfu/mL，分別接種至液體培養基(YPD培養基：蛋白胨20.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖20.0g，水定容至1000mL；該培養基的pH值調節至7.0。AC培養基：酵母膏10.0g，葡萄糖10.0g，碳酸鈣20.0g，水定容至1000mL；該培養基的pH值調節至6.8。MRS培養基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，葡萄糖20.0g，乙酸鈉5.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸鎂0.5g，硫酸錳0.2g，吐溫801.0mL，水定容至1000mL；該培養基的pH值調節至6.3)中，接種量為2％，37℃振蕩培養24h，得到菌懸液，菌液密度分別為108～109cfu/mL。SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165采用現有技術，來自中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)，地址：北京市朝陽區酒仙橋中路24號院6號樓；菌種保持編號分別為CICC33068、CICC20441和CICC23165。2)將茶葉以1％的濃度(w/v，即茶葉的質量與沸水的體積之比為1g；100mL)添加到沸水中，煮沸5min后八層紗布過濾，茶汁中按50g/L的濃度加入蔗糖溶解，121℃滅菌20min，冷卻至室溫25℃后，分別按照占茶汁2％(v/v)的比例，同時接入108～109cfu/mL的SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌懸液、AcetobacterspCICC20441菌懸液和LactobacillusplantarumCICC23165菌懸液，室溫25℃靜置培養10d以上，三者共生而長成紅茶菌過程中，所產酯酶活力持續增長，形成菌膜后，紅茶菌發酵成熟，酯酶持久維持高活力。在枸杞結果期，有機磷農藥毒死蜱施藥后，按照5升/9株枸杞16米2土地的用量噴灑紅茶菌發酵液，紅茶菌通過其酯酶活力降解毒死蜱。紅茶菌在發酵過程中，隨著其酯酶活力增長，降解毒死蜱的效力越大。酯酶活力在土壤中持久留存，意味著紅茶菌在土壤中定殖。3)經過步驟1)和步驟2)的處理后(1d之后)，枸杞和土壤中毒死蜱開始被降解(見表3)。毒死蜱測定與酯酶活力測定同實施例1。表3(試驗：紅茶菌噴施；對照：等量茶汁噴施)毒死蜱濃度(mg/kg)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(試驗)0.1440.1090.1030.0850.0600.0380.010根周土壤(試驗)0.2350.1880.1550.1180.0800.0530.015枸杞(對照)0.1320.1150.0960.0820.0730.0610.059根周土壤(對照)0.2550.2330.2030.1800.1560.1420.138磷酸酯酶活力(U/g)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(試驗)34.835.533.038.735.532.537.3根周土壤(試驗)40.542.244.538.543.043.742.6枸杞(對照)4.34.04.92.73.33.03.6根周土壤(對照)6.56.76.97.47.46.57.8試驗中，通過紅茶菌噴施，6天后，枸杞上毒死蜱降解率達到93.1％，土壤中毒死蜱降解率達到90.6％，分別比對照降低27.8和44.7個百分點，說明紅茶菌對毒死蜱降解有明顯促進作用。表3還顯示，紅茶菌噴施后，枸杞上和土壤中酯酶活力極顯著地高于對照且保持穩定，說明紅茶菌通過產生酯酶而發揮對毒死蜱降解有明顯促進作用。實施例41)SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165的出發密度為106～107cfu/mL，分別接種至液體培養基(YPD培養基：蛋白胨20.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖20.0g，水定容至1000mL；該培養基的pH值調節至7.0。AC培養基：酵母膏10.0g，葡萄糖10.0g，碳酸鈣20.0g，水定容至1000mL；該培養基的pH值調節至6.8。MRS培養基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，葡萄糖20.0g，乙酸鈉5.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸鎂0.5g，硫酸錳0.2g，吐溫801.0mL，水定容至1000mL；該培養基的pH值調節至6.3)中，接種量為3％，37℃振蕩培養24h，得到菌懸液，菌液密度分別為108～109cfu/mL。SaccharomycescerevisiaeCICC33068、AcetobacterspCICC20441和LactobacillusplantarumCICC23165采用現有技術，來自中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)，地址：北京市朝陽區酒仙橋中路24號院6號樓；菌種保持編號分別為CICC33068、CICC20441和CICC23165。2)將茶葉以1％的濃度(w/v，即茶葉的質量與沸水的體積之比為1g；100mL)添加到沸水中，煮沸5min后八層紗布過濾，茶汁中按50g/L的濃度加入蔗糖溶解，121℃滅菌20min，冷卻至室溫25℃后，分別按照占茶汁2％(v/v)的比例，同時接入108～109cfu/mL的SaccharomycescerevisiaeCICC33068菌懸液、AcetobacterspCICC20441菌懸液和LactobacillusplantarumCICC23165菌懸液，室溫25℃靜置培養10d以上，三者共生而長成紅茶菌過程中，所產酯酶活力持續增長，形成菌膜后，紅茶菌發酵成熟，酯酶持久維持高活力。在枸杞結果期，有機磷農藥毒死蜱施藥后，按照5升/9株枸杞16米2土地的用量噴灑紅茶菌發酵液，紅茶菌通過其酯酶活力降解毒死蜱。紅茶菌在發酵過程中，隨著其酯酶活力增長，降解毒死蜱的效力越大。酯酶活力在土壤中持久留存，意味著紅茶菌在土壤中定殖。3)經過步驟1)和步驟2)的處理后(1d之后)，枸杞和土壤中毒死蜱開始被降解(見表4)。毒死蜱測定與酯酶活力測定同實施例1。表4(試驗：紅茶菌噴施；對照：等量茶汁噴施)毒死蜱濃度(mg/kg)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(試驗)0.1290.0880.0720.0600.0480.0330.010根周土壤(試驗)0.2440.1950.1600.1240.0980.0630.023枸杞(對照)0.1420.1270.1180.0930.0880.0670.055根周土壤(對照)0.2590.2300.1920.1740.1590.1480.135磷酸酯酶活力(U/g)0d1d2d3d4d5d6d枸杞(試驗)33.635.033.938.935.337.537.0根周土壤(試驗)43.642.944.647.938.540.541.1枸杞(對照)4.24.65.34.74.35.04.6根周土壤(對照)6.86.96.37.57.27.17.5試驗中，通過紅茶菌噴施，6天后，枸杞上毒死蜱降解率達到92.2％，土壤中毒死蜱降解率達到90.6％，分別比對照降低30.9和42.7個百分點，說明紅茶菌對毒死蜱降解有明顯促進作用。表4還顯示，紅茶菌噴施后，枸杞上和土壤中酯酶活力極顯著地高于對照且保持穩定，說明紅茶菌通過產生酯酶而發揮對毒死蜱降解有明顯促進作用。當前第1頁1 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