一種玉米與高粱雜交的方法與流程

本發明屬于遠緣雜交育種技術領域，尤其涉及一種玉米與高粱雜交的方法。

背景技術：

在作物改良中,常利用植物屬間的遠緣雜交,將異種植物的有用性狀向栽培種轉移。植物遠緣雜交的難易程度一般由兩親本親緣關系的遠近所決定。目前玉米已經與野生二倍體大芻草、薏米、摩擦禾、水稻等作物通過常規手段已經進行了雜交并得到了相關的材料。吉林省農科院利用花粉管通道法的方法把高粱基因組導入到玉米植株中得到一批新的種質資源，并未使用簡單的傳統授粉方法。

1985年Bernard等進行玉米與高粱雜交沒有成功。現有技術只是進行了花粉管通道法的轉基因方法的雜交，沒有進行傳統的遠緣雜交授粉。到目前為止，未見報道玉米與高粱通過常規授粉雜交成功的案例。現有技術沒有做成功主要可能和所用的親本材料的基因型、授粉方式、授粉前處理、授粉時間等因素有直接的關系。現有技術只是使用任意玉米材料和高粱材料雜交，沒有選擇到合適的基因型，同時現有技術只是直接授粉，沒有經過預處理和授粉時間的選擇。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種玉米與高粱雜交的方法，旨在解決現有技術只是使用任意玉米材料和高粱材料雜交，沒有選擇到合適的基因型，同時現有技術只是直接授粉，沒有經過預處理和授粉時間的選擇的問題。本發明擬通過該技術手段解決玉米與高粱授粉的結實問題，提高玉米結實率。

本發明是這樣實現的，一種玉米與高粱雜交的方法，所述玉米與高粱雜交的方法通過對玉米母本授粉前處理和授粉兩道程序獲得雜交種質；通過表型和分子鑒定技術對雜交后代進行鑒定，確定為真雜種；

具體包括：授粉前取玉米花粉，放入研缽中，加入去離子水，去離子水加入量是花粉的3倍，搖研磨10分鐘～30分鐘，然后倒入試管中，用干凈毛刷把研磨液體刷到花絲上；

授粉：花絲涂抹2小時～12小時后，取父本高粱花粉，把高粱花粉授予處理過花絲的玉米雌穗上。

進一步，所述玉米母本為wysc7親本材料；父本高粱花粉為s332。

進一步，對授粉后的處理過花絲的玉米雌穗和未處理的雌穗分別掛牌標記。

本發明另一目的在于提供一種上述玉米與高粱雜交的方法獲得的真雜種及其后代。

本發明解決了玉米與高粱雜交結實性不好的問題，使結實穗數提高了4倍，結實粒數提高了321倍(表1)，達到了高粱抗逆基因導入玉米中的目的(如附圖2、3)。

與現有技術相比，本發明具有以下優點：(1)至今尚未有玉米與高粱雜交成功的報道，通過授粉前處理可以獲得大量后代；(2)通過表型分析和分子鑒定技術對雜交后代進行了鑒定，利用1個標記(5號)對23個F1單株進行鑒定，有14個單株有高粱基因組片段，14個單株被確定為真雜種，比例達到60.87％。

附圖說明

圖1是本發明實施例提供的玉米與高粱雜交的方法流程圖。

圖2是本發明實施例提供的利用26對SSR標記篩選母本和父本，得到只在父本(高粱)基因組上能擴增出的標記12對圖。

圖3是本發明實施例提供的用5號標記擴增23個F1植株，14個單株可以擴增出產物，其它單株沒有擴增出結果圖。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

下面結合附圖對本發明的應用原理作詳細描述。

如圖1所示，本發明實施例提供的玉米與高粱雜交的方法，包括：

S101：授粉前處理：在授粉前取玉米(wysc7)花粉，放入研缽中，加入去離子水，去離子水加入量是花粉的3倍，搖研磨10-30分鐘，然后倒入試管中，用干凈毛刷把研磨液體刷到花絲上(保證不能竄粉)。

S102：授粉：花絲涂抹2-12小時后，取高粱花粉，把高粱(S332)花粉授予處理過花絲的玉米雌穗上，分別授粉100穗，分別掛牌標記。

下面結合附圖及具體實施例對本發明作進一步描述。

本發明基因型選擇：由于本發明使用的材料直接預處理，沒有進行選擇。由于育種材料的更新，現有的材料更加適合遠源雜交，前人沒有做成功可能是由于基因型不合適。

本發明授粉前預處理：授粉成功的第一步是要形成花粉管，遠緣雜交成功率低主要是沒有形成花粉管，所以玉米花粉中有一種酶或者什么物質促進花粉管的形成，為了使花粉失去活力，本發明使用水使花粉失去活力不能受精成功，通過研磨促進花粉中的酶或的其它促進花粉管的物質外滲，然后涂抹花絲，形成花粉管(沒有觀察花粉管形成)。

本發明的授粉時間，由于涂抹花絲后花絲帶水，如果這時授粉可能使高粱花粉破裂失活，所以本發明選擇2-12小時，在該時段授粉結實較高，超過12小時顯著降低。

本發明所用的親本材料母本是玉米wysc7，父本高粱s332，均來自***農業科學院生物技術研究中心。

經過玉米和高粱授粉后，不同處理間的玉米結實情況差異顯著。授粉前未處理的結實穗數為25個(25％)，結實總粒數是38粒種子，處理后結實穗數是100個(100％)，結實總粒數是12216粒種子(表1)。對結實的F1代種子于2016年5月種植于**********實驗基地，通過與父母本表型比較，F2代群體表現出顯著的表型分離，可以發現雜交成功。

表1不同處理下100穗玉米與高粱雜交授粉結實情況統計

實施例2.

玉米與高粱基因組重組驗證

選取26對高粱特異SSR分子標記(表2)，篩選wys7和S332的基因組DNA，選取只是在S233中能擴增出的標記作為F1中鑒定標記。DNA提取采用CTAB法。PCR反應體系見表3。

表2所用高粱SSR分子標記引物序列

表3.PCR擴增反應體系濃度及物品用量表

利用26對SSR標記篩選母本和父本，得到只在父本(高粱)基因組上能擴增出的標記12對(圖2)。用5號標記擴增23個F1植株，14個單株都可以擴增出產物，其它單株沒有擴增出結果(圖3)，表明高粱的DNA片段成功導入玉米基因組中

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。

<110> 山西省農業科學院生物技術研究中心 ；江蘇省農業科學院

<120> 一種玉米與高粱雜交的方法

<160> 26

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

GACTATAGACAGATCCGGGC CTCAATAAAGTCGGCTCCAC

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

TCGCTATCCTCACCTATCAA ATGGTTCTTGCTACTCCCAG

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

CACACAGTCGAGAGCAAAAC TGATCACTTTCGTGATCGAG

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

GCTAGCAATCAGGTCTTGGT AGAGATGTTTGGTTGGTGGT

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

TCTAGGCATTTATAAGCCCG CACGTGAGGTCCACATTTTA

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

CTACACCAGTATGCAAAGGC ATGCTAGGTCTAGCTGCCTG

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

ACCGATATCCTGAAATGTCC TGCTGACCAATCACTTCTGT

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

TCTCTAGCTAGCGCACACAC CATCCATAAGGGAGAGTTCG

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

AACACATGTGCTCAATGCTC CACATTTCTTCCCAGTAGCC

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

CCTGAGCAAAGGCAGTATTT ATATGTATGGTCCCGTCCAC

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

GTCGATGTGTGTGACCGTAT CTTTCCTCCTTGTTGTTCGT

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

AGTACCGTATGGTGATGCG GGCGATCGTGGAGTAGTAGT

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

CCGATGTTGATGGAAGAGAT TAGTCAAACACAATGTCCGC

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

GATCGCTCTCTCTCGTTTTT TGTGTGTGTGTGTGTGTGTG

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

GTGTGTGTGTCTGTCTCGCT GAGGGAGAGAGAGAGGGCT

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

TAAGAGAATCACACCTGGCA GCTGTTCACTTTTCCTCGTT

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

GAGAACAATAACGCGTGGA GAAATGGGCATATGAGATGG

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

CTGCTGCTGCTTTCTCAATA TGCATCATATCCTGATGGAG

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

GACACACAGAGACCCAGACA GTCTCTCTCTCTCTCCCGCT

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

GTGATCCGAACCTAGCAGAT GGATAGATTTTGGTTGGACG

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

AGCTTATCGATACCGTCCTG CTGTGAGACAAGACTGTCGG

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

GGTCTGGTAGAGGTTCATGG ATCCGGTAAGGTAGACCCTC

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

TATTTCACAGGGGAATCAGG TCCATTGTACTTTTAGCCCC

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

CTACGACGTACAGGCAGTTG TACCGCCTGATCTCTTCACT

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

CCTCACTATAGGGCGAATTG CAGGGTTCTTATCGCATACC

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標記引物序列

TTGGCACATGCATATACTCC ACGGCATGTCGATAAGTGTA。