一種大蒜素緩解蘋果連作障礙的方法與流程

本發明涉及一種大蒜素緩解蘋果連作障礙的方法，屬于果樹栽培學領域。

(二)

背景技術：

連作障礙是指同一作物或近緣作物連續種植以后，即使在正常管理的情況下，也會產生產量降低、品質變劣、生育狀況變差的現象。蘋果連作障礙具有普遍性，是生產中的一大難題，給果農造成巨大的經濟損失，嚴重制約了果樹生產的可持續發展。研究表明，在多數地區，與土傳真菌有關的生物因素是造成連作障礙的主要原因。化學殺菌劑熏蒸土壤一直以來都是防治連作障礙最有效的措施，但是因其污染環境，逐漸被禁止使用。因此研制環境友好型植物源熏蒸劑來防控蘋果連作障礙具有重要意義。

生物熏蒸劑既能有效的抑制和殺滅土壤中的有害病原菌，又能在土壤中快速降解。因此用生物熏蒸劑進行土壤消毒和生長期防治，沒有任何農藥殘留和污染，可以替代很多種化學農藥，從源頭上確保質量安全。大蒜是百合科蔥屬植物，研究表明大蒜素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、鏈球菌、克雷白桿菌、植物炭疽病和疫病病菌等均有明顯抑制作用，因此我們考慮將其作為一種生物熏蒸劑，探索其在蘋果連作障礙中的應用效果。目前對大蒜素的提取方法主要有：超聲波提取、溶劑振蕩萃取法、水蒸氣蒸餾法、超臨界CO₂萃取法、真空微波輔助萃取法等。但這些提取大蒜素的方法有的耗時長，有的操作復雜，并且都存在提取效率低的問題。因此，研究簡易快捷、高效環保的提取大蒜素的工藝并將所得大蒜素用于減輕蘋果連作障礙，可有利于推動蘋果產業的發展，對有效防控蘋果連作障礙具有實踐意義。

(三)

技術實現要素：

針對上述現象，本發明提供了一種大蒜素緩解蘋果連作障礙的方法；具體涉及一種高效、快捷、簡單易行的提取大蒜素的方法，并將所得大蒜素應用于緩解蘋果連作障礙。

本發明技術方案如下：

一種大蒜素緩解蘋果連作障礙的方法，是在每年蘋果連作建園時，春季栽植蘋果幼樹時，向每棵蘋果幼樹的定植穴內施用濃度為25mg/mL的大蒜素提取液；每棵幼樹的施用量為其定植穴內土壤體積比的1/8，分三次施加：第一次為春季栽植蘋果幼苗前兩周施加(3月上旬)，施用量為每棵幼樹的定植穴內土壤體積比的1/16；第二次為蘋果幼樹生長初期(6月上旬)，施用量為每棵幼樹的定植穴內土壤體積比的1/32；第三次為蘋果幼樹生長中期(7月下旬)，施用量為每棵幼樹的定植穴內土壤體積比的1/32。

所述大蒜提取液制備步驟如下：

1)大蒜去皮清洗，切成0.1～0.4cm的碎丁，室溫下放置5～15min進行酶解，使蒜氨酸向大蒜素轉化；

2)將切碎酶解好的大蒜放入快速溶劑萃取儀(ASE)中進行萃取得到萃取液；

萃取條件為：萃取溶劑為無水乙醇，壓力9.80～11.20Mpa，萃取溫度40～50℃，靜態萃取時間4～10min，循環萃取次數2～4次，沖洗體積50～70％，吹掃時間150～200s；

3)旋蒸濃縮：將步驟2)中得到的萃取液采用旋轉蒸發儀，在45℃條件下蒸發濃縮至萃取液體積比的1/20～1/10，然后以12000g速度離心，取上清液得到大蒜素提取母液，按照公式(1)計算母液濃度(單位g/mL)，4℃保存；

4)大蒜素提取母液中按體積比加入去離子水稀釋大蒜素提取母液，得到濃度為25mg/mL的大蒜素提取液。

本發明的特點及有益效果：

本發明有兩個明顯的優勢：一是短時間內極大的提高了大蒜素萃取液的提取效率；二是大蒜素提取液可顯著提高連作條件下蘋果幼苗生長發育，最終起到減輕蘋果連作障礙的效果。利用本發明提取的大蒜提取液和施用方法，經驗證，能有效提高連作條件下蘋果幼苗生長發育，降低蘋果連作土壤中尖孢鐮刀菌的數量，明顯減輕蘋果連作障礙現象。

(四)附圖說明

圖1為本發明高效快速制備大蒜素提取液及其在蘋果連作障礙中的使用方法流程圖。

圖2為實施例1中不同提取方法對大蒜素提取效率的影響。

圖2說明本發明方法即快速溶劑萃取儀ASE法制備的大蒜素提取液抑菌效果最好。

圖3為實施例2中不同提取溶劑對大蒜素提取效率的影響。

圖3說明本發明選用乙醇作為萃取溶劑，制備的大蒜素提取液抑菌效果最好。

圖4為實施例3中不同提取溫度對大蒜素提取效率的影響。

圖4說明萃取溫度為50℃時，制備的大蒜素提取液抑菌效果最好。

圖5為實施例4中不同提取時間對大蒜素提取效率的影響。

圖5說明萃取時間5min時，所得大蒜素提取液抑菌效果最好。

(五)具體實施方式

實施例1：

大蒜去皮清洗，切成0.2cm的碎丁，室溫下放置10min進行酶解，酶解好的大蒜分別用本發明的快速溶劑萃取儀法、超聲波萃取法和溶劑震蕩萃取法進行大蒜素的提取測定，每種測定方法平行提取測定3次。由圖2可以看出，本發明方法對大蒜素的提取效率顯著高于超聲波萃取法和溶劑震蕩萃取法，本方法的提取效率是超聲波萃取法的1.29倍，是溶劑震蕩萃取法的1.63倍。而且，用不同方法的提取液做抑菌試驗，發現，本發明方法制備的大蒜素提取液抑菌效果最好。

使用時將本實施例所得的大蒜素提取母液按體積比加入去離子水，獲得濃度為100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、10mg/mL的大蒜素提取液，備用。

然后稱取馬鈴薯葡萄糖瓊脂46.0g，加入1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌20min，培養基冷至45℃左右加入濃度為100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、10mg/mL的大蒜素提取液中，制得含有不同濃度的大蒜素提取液培養皿，然后放上直徑為8mm的供試病原真菌尖孢鐮刀菌菌種，以不加大蒜提取液的為對照，倒扣培養皿，封口膜密封，置于28℃恒溫培養箱中黑暗培養，10天后測量菌落擴展直徑，稱取菌絲鮮重，并計算提取物對菌絲生長的抑制率，結果見表1：

表1 大蒜提取液對菌絲生物量影響

抑菌率(％)＝(對照皿菌落直徑一處理皿菌落直徑)/對照皿菌落直徑×100％結果發現，培養10天后測量菌落直徑和鮮重，可以看出，大蒜素提取液能明顯抑制尖孢鐮刀菌菌落生長，當大蒜提取液使用濃度為100mg/mL時，抑制率達到了100％。這個抑菌試驗證明本發明方法制得的大蒜素提取液具有抑制引起蘋果連作障礙病原菌的功效。

實施例2

大蒜去皮清洗，切成0.2cm的碎丁，室溫下放置10min進行酶解，酶解好的大蒜放入快速溶劑萃取儀ASE中，分別用無水乙醇、甲醇和水作為萃取劑，在壓力為10.1Mpa，萃取溫度為50℃，靜態萃取時間為5min，循環萃取3次，沖洗體積為65％，吹掃時間為180s的條件下進行萃取。由圖3可以看出，無水乙醇對大蒜素的提取效率顯著高于甲醇和水，分別是甲醇、水提取效率的1.9倍和6.4倍。因此，本發明方法選無水乙醇作為溶劑。

使用時將本實施例所得的大蒜素提取母液按體積比加入去離子水，獲得濃度為50mg/mL、25mg/mL、10mg/mL的大蒜素提取液，備用。

2015年12月1日，將經過層積、催芽的蘋果砧木—平邑甜茶種子播種于育苗盤育苗，至幼苗長至第2片真葉時，取長勢基本一致的幼苗移栽，進行溫室試驗。試驗設4個處理，每處理10盆，每盆內裝連作土壤1kg，并定植2株幼苗。盆中連作土壤分別作如下處理：以未處理的連作土為對照(CK)；10mg/L的大蒜提取液處理的土壤(T1)；25mg/L的大蒜提取液處理的土壤(T2)；50mg/L的大蒜提取液處理的土壤(T3)。移栽幼苗前1周，每1kg連作土壤，澆灌50mL不同濃度的大蒜提取液，連作土壤對照用50mL去離子水替代。生長30天，再次各處理澆灌50mL不同濃度的大蒜素提取液，連作土壤對照用50mL去離子水替代。生長60天后，對盆栽平邑甜茶幼苗生物量及土壤中尖孢鐮刀菌數量進行了測定，結果如表2。

表2 大蒜提取液對蘋果幼苗生長及土壤中尖孢鐮刀菌數量的影響

從表2可以看出，連作土壤中添加25mg/mL的大蒜提取液，則蘋果幼苗的株高和鮮重分別提高47％和48％，土壤中的有害真菌，尖孢鐮刀菌的數量則降低了65％，施加高濃度的大蒜素提取液雖然對土壤中的病原菌滅殺效果好，但是對蘋果幼苗的生長也有抑制作用，綜合來看，連作土壤中添加25mg/mL的大蒜素提取液，效果最佳。

實施例3

大蒜去皮清洗，切成0.2cm的碎丁，室溫下放置10min進行酶解，使蒜氨酸向大蒜素轉化。將切碎酶解好的大蒜放入快速溶劑萃取儀(ASE)中，萃取溫度分別為30、40、50、60、70、80℃，用無水乙醇作為萃取劑，在壓力為10.1Mpa，靜態萃取時間為5min，循環萃取3次，沖洗體積為65％，吹掃時間為180s的條件下進行萃取，每個溫度平行提取測定3次。由圖4可以看出，萃取溫度為50℃時候，大蒜素的提取效率最高。而且，用不同溫度下的提取液做抑菌試驗，發現萃取溫度50℃所得大蒜素提取液抑菌效果最好。

使用時將本實施例所得的大蒜素提取母液按體積比加入去離子水，獲得濃度為50mg/mL、25mg/mL、10mg/mL的大蒜素提取液，備用。

2016年3月4日，將經過層積、催芽的蘋果砧木—平邑甜茶種子播種于育苗盤育苗，至幼苗長至第6片真葉時，取長勢基本一致的幼苗移栽，于山東農業大學南校區蘋果中心試驗站進行盆栽試驗。試驗設三個處理，每處理10盆，每盆內裝連作土壤6kg，并定植2株幼苗。盆中連作土壤分別作如下處理：以未處理的連作土為對照(CK)；10mg/L的大蒜提取液處理的土壤(T1)；25mg/L的大蒜提取液處理的土壤(T2)；50mg/L的大蒜提取液處理的土壤(T3)。移栽幼苗前一周，每1kg連作土壤，澆灌50mL不同濃度的大蒜提取液，連作土壤對照用50mL去離子水替代；生長一個月后，再次不同處理再次澆灌50mL處理液。正常水肥管理，生長120天后，對盆栽平邑甜茶幼苗生物量及土壤中尖孢鐮刀菌數量進行了測定，結果如表3。

表3 大蒜提取液對蘋果幼苗生長及土壤中尖孢鐮刀菌數量的影響

從表3可以看出，連作土壤中添加25mg/mL的大蒜素提取液，則蘋果幼苗的株高和鮮重分別提高51％和108％，而土壤中的有害真菌，尖孢鐮刀菌的數量則降低了42％。施加高濃度50mg/mL的大蒜素提取液雖然對土壤中的病原菌滅殺效果好，但是對蘋果幼苗的生長也有抑制作用，綜合來看，連作土壤中添加25mg/mL的大蒜素提取液，效果最佳。

實施例4

大蒜去皮清洗，切成0.2cm的碎丁，室溫下放置10min進行酶解，使蒜氨酸向大蒜素轉化。將切碎酶解好的大蒜放入快速溶劑萃取儀(ASE)中，萃取溫度分別為30、40、50、60、70、80℃，用無水乙醇作為萃取劑，在壓力為10.1Mpa，靜態萃取時間從1min到15min，循環萃取3次，沖洗體積為65％，吹掃時間為180s的條件下進行萃取，每個時間平行提取測定3次。由圖5可以看出，時間為5min時候，大蒜素的提取效率最高。而且，用不同時間的提取液做抑菌試驗，發現，本發明方法選定的時間5min所得大蒜素提取液抑菌效果最好。

使用時將本實施例所得的大蒜素提取母液按體積比加入去離子水，獲得濃度為25mg/mL的大蒜素提取液，備用。

山東省蒙陰南麻村兩畝老齡蘋果連作連作建園時，先去掉老齡樹，每畝撒施7500-8500kg充分發酵的農家肥、深翻果園，深度為40cm，撿出殘根。試驗設為2個處理，一畝地土壤使用本發明方法獲得的大蒜素提取液處理(T)；一畝地不做處理按常規種植蘋果幼苗作為對照(CK)；處理(T)操作如下：春季栽植蘋果幼苗時，挖出的每個定植穴連作土壤正常回填，幼樹定植前2周，在定植穴內澆灌穴內土壤體積1/16、濃度為25mg/mL的大蒜素提取液。幼樹生長初期，6月上旬，第二次施加濃度為25mg/mL的大蒜素提取液，施加量為定植穴內土壤體積的1/32；幼樹生長中期，7月下旬，第三次施加濃度為25mg/mL的大蒜素提取液，施加量為定植穴內土壤體積的1/32；幼樹生長期間，正常水肥管理。結果發現，用本發明方法處理土壤后，幼樹生長量比不作處理的連作土壤(對照)中幼樹增加67％。