本發明涉及一種微量植株水溶物化感潛力評價生物測定方法，屬生物測定技術領域。
背景技術：
生物間的相生相克現象自古就為人類所認識，并在農業生產中應用以安排作物的輪作倒茬。1996年國際化感協會(International Allelopathy Society)將化感作用定義為：生物個體通過向環境釋放化合物影響其周圍其他生物生長發育的作用。植物向環境釋放化學物質有有機和無機，其形式包括：根系分泌、揮發性氣體、淋溶性物質等。植物化感作用是植物對環境適應的一種化學表現形式，植物根、莖、葉等器官或組織向環境釋放“化感物質”影響其他植物的作用，也是植物自身防御或抗逆能力的表現形式。
利用植物體在生態系統中的這種自身防御或抗逆能力，可以減少化學農藥的使用，減少生產成本投入，降低環境壓力，化感潛力的發掘與利用是一種資源節約、環境友好的有害生物控制途徑。植物化感作用已成為當今生物科學研究的一個重要方向，也是促進農業可持續發展的重要組成部分。篩選和評價植物化感作用潛力是化感作用研究的第一步，需要采用簡單、快速、準確的生物測定方法進行篩選評價。1985年以來，國內外的科學家研究報道了許多化感作用潛力的生物測定方法，如水培測定1、階梯測試法2、國際水稻研究所的稗草遲播法3、日本科學家的瓊脂根箱法4和三明治法5、植株水浸提液法6、7、 澳大利亞科學家的瓊脂共培養法8、根系分泌物法9等。其中三明治法、植株水浸提液法以植物地上部分或地下部分等不同組織的水提取液對供試生物生長、發育的影響進行化感潛力評價。植物的根莖葉等不同組織器官是次生代謝物質合成的重要部位，供體植物的次生代謝物/化感物質一般都儲存在植物細胞中，以結合態存在，通過生物酶或環境脅迫而分解并從植物的特定部位如根、莖等組織釋放出來而產生生物活性。三明治法、植株水浸提液法的測定結果反映了植物體所含有的水溶性物質的生物活性，也代表植物淋溶物質進入環境后對其它植物的影響作用。對于種子來源有限、種子萌發不整齊、培養困難的材料，植株水浸提液法極具優勢和不可替代性，并被較廣泛應用的化感潛力評價的生測方法，而且具有操作方便、快速、可大批量操作的特點。然而，對于稀有植物、數量少、材料獲得有限的情況，水浸提液的方法則不可行，而且如果對大量植株浸提液的無菌處理、儲存將增加試驗成本，此外，由于不同濃度的水浸提液滲透勢差異，對生測結果產生影響10，因此，現有的植株水浸提液生物測定法存在如下缺陷和局限性：(1)不易獲得生物材料化感潛力評價，(2)植株水浸提液在環境中易受到微生物影響的技術問題，(3)水浸提液不同濃度滲透勢對受體植物生長影響。
本發明是針對不同植物化感作用潛力評價生物測定的需要，根據植物幼苗生長根尖吸收的特性，提供足夠的溫、光、水條件，排除不同種植物共同生長的種間競爭，既反應植株水溶性物質的生物活性又最大限度控制微生物干擾，通過改進現有的常用的生物測定方法而發明的生物測定方法。
參考文獻
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技術實現要素：
本發明的目的在于克服現有技術之不足，而提供一種快速、可靠、能大批量操作的微量植株水溶物化感潛力評價生物測定方法。
本發明的微量植株水溶物化感潛力評價生物測定方法，是在現有植株水浸提液化感潛力評價生物測定方法基礎上的改進。改進后的微量植株水溶物化感潛力評價生物測定方法，其具體步驟如下:
(1)培養基制備
用水配制以質量分數計的濃度為≥6％的瓊脂液，將配制好的瓊脂 液在120℃、0.1MPa滅菌20min倒入圓形和方形培養皿中待用；
(2)供體植物A的培養及水浸提液準備
所述的供體植物A種子充分吸水后放在培養皿并置于25℃或28℃的培養室中催芽48小時，然后播種于裝入土壤的小盆中，并置于25℃或28℃、12小時光/暗條件的溫室種植20-30天，剪取地上部分，用質量分數為3-6％次氯酸鈉進行表面消毒5min，然后用無菌水清洗2-3次至無味，用滅菌的吸水紙吸出多余水分，將供體植物A用剪刀剪成1-2cm長的小段，放入無菌容器內，按供體植物A與滅菌水的質量體積比＝1:5-10加入滅菌水封蓋，4℃搖床提取24小時，用注射器吸取浸提液，采用0.2μm滅菌過濾膜過濾獲得20％-10％的無菌植株水浸提液，4℃冰箱保存備用；
(3)受體植物B的種子表面消毒和萌發
所述的受體植物B的種子表面消毒是用質量分數為3-6％次氯酸鈉對受體植物B進行種子表面消毒10min，然后用無菌水清洗2-3次至無味，然后將受體植物B播種于上述1準備的圓形培養皿的培養基中、無菌條件萌發至露白備用；
(4)受體植物B的播種與培養
在上述步驟1中的方形培養皿背面的中部用直尺劃線，將步驟3中萌發至露白的受體植物B播種至培養皿中，按培養皿背部所劃線整齊播種，每皿15-20粒，封蓋后將該培養皿放置在25℃或28℃的培養室內，12小時光/暗培養3-5天，根部向下垂直培養，根生長至0.5-1cm長度最佳，剔除生長不好的植株，每一培養皿中保留10-15 株。
(5)受體植物B的生長量測定值
在上述步驟(2)制備的植株水浸提液中，加無菌水稀釋配置成體積百分百比為20％、10％、5％、2.5％濃度的浸提液，用微量移液器取浸提液處理上述步驟4中受體植物B的根尖部分，每植株5-10ul，待處理部位表明無液體則培養皿再次封蓋放回培養室培養2-3天，測量受體植物B的主根長度，并以受體植物B的生長量測定值作為生長影響評價的參數；
(6)對照處理
將上述步驟(4)受體植物B的根尖采用無菌水代替植株水浸提液處理，處理方法、培養條件和時間同上述步驟(5)所述；從培養皿中取出受體植物B測量主根長度，并以對照的生長量測定值作為生長影響評價的參數；
(7)植物浸提液化感潛力的計算
植物浸提液化感潛力的計算公式為IR＝(1-Tr/ck)×100，其中Tr表示受體植物B的生長量測定值，ck表示對照植物的生長量測定值，IR表示供體植物A對受體植物B的影響作用，當IR＜0時，表示供體植物A對受體植物B的作用為刺激生長；當IR＞0時，表示供體植物A對受體植物B具有抑制作用；當IR＝0時，表示供體植物A對受體植物B沒有活性或表示兩種植物間無化感作用存在。
與現有技術相比，本發明的有益效果是：
1、采用6％的瓊脂水溶液，作為一種介質其狀態接近固體能夠垂 直放置，有利于受體植物在其表面生長，同時提供供植物生長需要的水分和方便處理操作；
2、所有操作在無菌條件下，植株水浸提液也采用0.2μm滅菌過濾膜進行過濾滅菌，最大限度地控制了微生物的污染以及微生物對化感物質的分解作用；
3、根據植物幼苗生長根系吸收的特性，采用供體植物浸提液微量處理受體植物根尖，對供體植物的需要量極少，又充分反應供體植物提取液對受體的作用，同時免除了植株水浸提液法測定中需要進行滲透壓調節的過程。
4、排除了植物浸提液需要較大量的供體植物組織，直接反應植物體水溶性物質對其他生物的影響作用，具有微量準確的特點，非常適于實驗室的植物種質資源的大量篩選評價工作。
5、是一種有效、經濟、快速、準確、能大批量操作的的實驗室植物淋溶物化感潛力評價方法。
具體實施方式
以下結合實施例對本發明作進一步的說明。
實施例1：
試驗材料為水稻和稗草，其中水稻是供體植物分別采用以下5個品種：已報道的非化感品種Lemont、已報道的化感品種PI312777、Koukesumochi、Dongjingbyeo和K21；受體植物為稗草。試驗重復3次。
本實施例步驟如下：
1、培養基制備，用水配制以質量分數計的濃度為6％的瓊脂培養基，120℃、0.1MPa滅菌20min后分別倒入圓形和方形培養皿中待用；
2、供體植物為上述提及的5種水稻，將水稻種子充分吸水后放在培養皿并置于28℃的培養箱中催芽48小時，然后播種于裝入土壤的小盆中，并置于28℃、12小時光/暗條件的溫室種植20天，剪水稻地上部分，用質量分數為3％次氯酸鈉對水稻地上部分進行表面消毒5min，然后用無菌水清洗3次，用滅菌的吸水紙吸出多余水分，用剪刀剪成1cm或2cm長的小段，放入經滅菌的10ml試管中，1g水稻材料加入5ml滅菌蒸餾水，封口，4℃浸提24小時后用注射器吸取浸提液，采用0.2μm滅菌過濾膜過濾滅菌后獲得的含量為20％的植株水浸提液，4℃冰箱保存備用；
3、受體植物為稗草，將稗草種子用質量分數為6％次氯酸鈉表面消毒，滅菌水清洗后均勻播種在上述1準備的圓形培養皿中，無菌條件萌發至露白；
4、在步驟1的方形培養皿背面中部用直尺劃線，步驟3中萌發至露白的稗草播種在培養皿中，按培養皿背部所劃線整齊排列，根部向下，每皿20粒，封蓋后將該培養皿放置在28℃的培養室內，12小時光/暗垂直培養3天，剔除生長不好的植株，保留主根長0.5-1cm長的植株，每一培養皿留15株稗草；
5、將步驟2制備的植株水浸提液，加無菌水稀釋而配置成體積百分比為20％、10％、5％三個濃度梯度的浸提液，用微量移液器取 浸提液分別處理步驟4的受體植物稗草的根尖部分，每植株10ul，待處理部位干后將培養皿再次封蓋放回培養室培養3天，測量稗草的主根長度，以稗草的主根長度測量值作為生長影響評價的參數；
6、植物浸提液化感潛力的計算，植物浸提液化感潛力的計算公式為IR＝(1-Tr/ck)×100，其中Tr表示處理組受體植物稗草的生長量測定值，ck表示對照組稗草的生長量測定值，IR表示供體植物水稻對受體植物稗草的影響作用，當IR＜0時，表示供體植物水稻對受體植物稗草的作用為刺激生長；當IR＞0時，表示供體植物水稻對受體植物稗草具有抑制作用；當IR＝0時，表示供體植物水稻對受體植物稗草沒有活性或表示兩種植物間無化感作用存在。
表1本發明方法中水稻浸提液對稗草的化感潛力評價結果
實施例2：
試驗材料為水稻和萵苣，其中水稻是供體植物分別采用以下3個品種：已報道的非化感品種Lemont、已報道的化感品種PI312777和Koukesumochi；受體植物為萵苣。試驗重復3次。
本實施例步驟如下：
1、培養基制備，用水配制以質量分數計的濃度為6％的瓊脂培養基，普通高壓滅菌后分別倒入圓形和方形培養皿中待用；
2、供體植物為上述提及的3種水稻，將水稻種子充分吸水后放在培養皿并置于25℃的培養箱中催芽48小時，然后播種于裝入土壤的小盆中，并置于25℃、12小時光/暗條件的溫室種植30天，剪水稻地上部分，用質量分數為6％次氯酸鈉對不同品種水稻地上部分進行表面消毒5min，然后用無菌水清洗3次，用滅菌的吸水紙吸出多余水分，用剪刀剪成1cm或2cm長的小段，放入經滅菌的10ml試管中，1g水稻材料加入5ml滅菌蒸餾水，封口，4℃浸提24小時后用注射器吸取浸提液，采用0.2μm滅菌過濾膜過濾滅菌后獲得的含量為20％的植株水浸提液，4℃冰箱保存備用；
3、受體植物為萵苣，用質量分數為3％次氯酸鈉將萵苣種子進行表面消毒，滅菌水清洗至無味后均勻播種在上述1準備的圓形培養皿中無菌條件下萌發出芽；
4、在步驟1的方形培養皿背面中部用直尺劃線，步驟3中已萌發萵苣播種在培養皿中，按培養皿背部所劃線整齊排列，根部向下，每皿15粒，封蓋后將該培養皿放置在25℃的培養室內，12小時光/暗垂直培養2天，剔除生長不好的植株，每一培養皿中保留根長0.5-1.0cm的萵苣10株；
5、將步驟2制備的植株水浸提液，加無菌水稀釋而配置成體積百分比為10％、5％、2.5％三個濃度梯度的浸提液，用微量移液器取浸提液分別處理步驟4的受體植物萵苣根尖部分，每植株5ul，待處 理部位干后培養皿再次封蓋放回培養室培養2天，測量萵苣的主根長度，以萵苣的主根長度測量值作為生長影響評價的參數；
6、植物浸提液化感潛力的計算，植物浸提液化感潛力的計算公式為IR＝(1-Tr/ck)×100，其中Tr表示處理組萵苣的生長量測定值，ck表示對照組萵苣的生長量測定值，IR表示供體植物水稻對萵苣的影響作用，當IR＜0時，表示供體植物水稻對受體植物萵苣的作用為刺激生長；當IR＞0時，表示供體植物水稻對受體植物萵苣具有抑制作用；當IR＝0時，表示供體植物水稻對受體植物萵苣沒有活性或表示兩種植物間無化感作用存在。
表2本發明方法中水稻浸提液對萵苣的化感潛力評價結果
發明人將本發明方法中水稻浸提液對受體植物稗草、萵苣的抑制作用結果與現有植株水浸提液法(供體植物同實施例1，受體材料為萵苣)的化感潛力評價結果(見表3)相比較，得出如下結果：
表3水稻水浸提液法對萵苣化感潛力評價結果
植株水浸提液法與本發明方法的測定結果具有較高的一致性。植株水浸提液法提取液采用普通過濾，不同濃度的水浸提液進行受體材料培養前需要調節滲透勢為一致，以排除對受體植物生長的影響，此外這種方法在培養過程中也極易受微生物污染而干擾、影響測定結果。
本發明采用6％的瓊脂作為培養基質，為供體植物種子萌發、生長提供了足夠的水分，有助于植物的生長；培養皿垂直放置可以使植物生長在培養基的表面，方便處理操作。本發明所有操作在無菌條件下進行，最大限度地控制了微生物的干擾以及微生物可能對化感物質的分解作用。此外，由于直接處理受體植物生長點(根尖)，所需要的水浸提液的量極少，既簡化了操作提高效率又節約成本。