MACF1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型的構建及應用的制作方法

本發明屬于生物醫學領域，特別涉及一種macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型的構建及應用。

背景技術：

成骨細胞(osteoblast，ob)是骨形成和修復的主要功能細胞。成骨細胞能合成、分泌膠原與糖蛋白形成骨基質，并促進基質礦化形成骨組織；同時，成骨細胞還參與破骨細胞性骨吸收的調控作用，維持骨的代謝平衡。因此，成骨細胞的功能狀態與骨骼生長、塑造、再造有著極其密切的聯系。任何抑制成骨細胞生成和分化，促進其凋亡的因素均可使骨形成降低，骨再建失衡，導致骨量減少。成骨細胞成骨是一個受多基因調控的復雜過程，目前仍有許多相關機制尚未被闡明。

微管微絲交聯因子1(macf1)是一種新型的細胞骨架交聯分子。作為骨架交聯蛋白超家族成員之一，它既能與微管連接，也能與微絲相連，而且能選擇性地限制自身與微絲微管之間的相互作用，在協調細胞的發育及維持組織的完整性中具有重要作用。已有研究發現：macf1在前成骨細胞內廣泛表達，并與纖維型肌動蛋白和微管部分共定位，在成骨細胞響應力學環境刺激時，這種共定位分布會發生改變(qianar,etal.[j].bioelectromagnetics,2009oct.30(7):545–555)；低表達macf1的前成骨細胞增殖和分化功能受到抑制(hulf,etal.[j].bmbrep.2015oct.48(10):583-588.)。

這些結果證明了macf1參與成骨細胞分化過程，在骨形成過程中可能具有重要作用。目前關于macf1對骨形成抑制作用的研究僅限于細胞水平，常用的模型例如在前成骨細胞系mc3t3-e1中使macf1低表達的穩定細胞株(騫愛榮等.抑制小鼠macf1基因表達的shrna序列及其應用[p].北京:cn104531700a,20150422.)等。然而細胞水平的實驗并不能完全反應體內的真實情況，需要進行體內實驗驗證。因此，本領域急需一種動物模型，以便在動物水平上研究macf1基因在成骨細胞中的功能及其在骨形成過程中的作用。

技術實現要素：

為了克服現有技術的不足，本發明提供一種macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型的構建及應用。本發明利用cre-loxp系統，通過macf1^fl/fl小鼠與成骨細胞特異性表達cre重組酶的sp7-cre轉基因小鼠交配，獲得成骨細胞特異性敲除macf1的小鼠模型(sp7-cre；macf1^fl/fl)。所述模型因macf1基因的條件性敲除造成小鼠骨形成能力降低。該模型可以用于研究macf1基因在成骨細胞中的功能及其在骨形成過程中的作用，同時還可以作為骨質疏松癥及其它骨形成相關疾病發病/發生機制研究的動物模型，并用于篩選預防、治療或改善此類疾病的藥物。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案：一種macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型的構建方法，其特點是包括以下步驟：

步驟一、選用macf1^fl/+小鼠自交，擴繁獲得純合子macf1^fl/fl小鼠；

步驟二、將獲得的macf1^fl/fl小鼠與sp7-cre轉基因小鼠交配，獲得半敲sp7-cre；macf1^fl/+小鼠；

步驟三、選用sp7-cre轉基因小鼠與spf級c57bl/6j小鼠交配，獲得sp7-cre轉基因小鼠。

步驟四、將獲得的半敲sp7-cre；macf1^fl/+小鼠自交，獲得macf1基因在成骨細胞中條件性敲除小鼠模型，即全敲sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠。

其中，所述步驟一、二所得到的小鼠利用特異性引物通過pcr方法進行基因型的鑒定。

步驟一所得到的小鼠基因型鑒定的引物為：

macf1-ap179：5'-aaagaaacggaaatactggcc-3'；

macf1-ap180：5'-gcagcttaattctgccaaattc-3'。

步驟二所得到的小鼠基因型鑒定的引物為：

sp7-icre-wt-f：5'-taccagaagcgaccacttgagc-3'；

icre-mut-r：5'-gcacacagacaggagcatcttc-3'。

所述步驟三、四所得到的小鼠通過雙重pcr方法篩選鑒定，基因型鑒定所用的引物為：

macf1-ap179：5'-aaagaaacggaaatactggcc-3'；

macf1-ap180：5'-gcagcttaattctgccaaattc-3'

和

sp7-icre-wt-f：5'-taccagaagcgaccacttgagc-3'；

icre-mut-r：5'-gcacacagacaggagcatcttc-3'。

一種macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型的應用，其特點是：

其一，macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型作為研究macf1基因在成骨細胞中的功能及其在骨形成過程中的作用的動物模型。包括以下內容中的一種或幾種：

(1)對macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型與對比動物的成骨細胞的增殖、分化和礦化能力進行檢測；

(2)對macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型與對比動物的成骨細胞成骨分化過程中的標記基因的表達進行檢測；

(3)采用qrt-pcr技術對macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型與對比動物的骨組織成骨分化相關基因的表達進行檢測；

(4)采用鈣黃綠素雙標法對macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型與對比動物的骨形成速率進行檢測；

(5)利用micro-ct掃描對macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型與對比動物的骨密度及骨組織微結構進行分析。

其二，macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型作為研究骨質疏松癥及其它骨形成相關疾病發病/發生機制的動物模型。macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型可自發的產生骨形成相關疾病的表型特征。

其三，macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型作為篩選預防、治療或改善骨質疏松癥及其它骨形成相關疾病的藥物的動物模型。其包括以下步驟：

(1)給macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型施用待篩選的測試藥物；

(2)檢測macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型中的骨密度及骨組織微結構，并與對照組進行比較。

本發明的有益效果是：本發明利用cre-loxp系統，通過macf1^fl/fl小鼠與成骨細胞特異性表達cre重組酶的sp7-cre轉基因小鼠交配，獲得成骨細胞特異性敲除macf1的小鼠模型(sp7-cre；macf1^fl/fl)。所述模型因macf1基因的條件性敲除造成小鼠骨形成能力降低。該模型可以用于研究macf1基因在成骨細胞中的功能及其在骨形成過程中的作用，同時還可以作為骨質疏松癥及其它骨形成相關疾病發病/發生機制研究的動物模型，并用于篩選預防、治療或改善此類疾病的藥物。

首次建立了macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型；

運用該模型可在體內驗證macf1基因在成骨細胞中的功能及其在骨形成過程中的作用；

為骨質疏松癥及其它骨形成相關疾病發病/發生機制的研究及預防、治療或改善此類疾病的藥物的篩選提供一個可信的動物模型。

因此，macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型將具有廣闊的應用前景。

下面結合附圖和具體實施方式對本發明作詳細說明。

附圖說明

圖1是本發明實施例1中macf1基因條件性敲除小鼠模型的構建策略示意圖；

圖2是本發明實施例1中最初引入的macf1^fl/+小鼠的pcr基因型鑒定結果圖；

圖3是本發明實施例1中最初引入的sp7-cre小鼠的pcr基因型鑒定結果圖；

圖4是本發明實施例1中最終獲得的sp7-cre；macf1^fl/fl(cko)小鼠的pcr基因型鑒定結果圖；

圖5是本發明實施例2中對cko小鼠的成骨細胞中macf1的表達鑒定結果圖；

圖6是本發明實施例3中對cko小鼠的成骨細胞中相關成骨基因的表達鑒定結果圖；

圖7是本發明實施例4中利用microct對cko小鼠股骨進行骨密度掃描的結果圖；

圖8是本發明實施例4中利用鈣黃綠素雙標法檢測cko小鼠的骨形成速率的結果圖。

具體實施方式

以下實施例參照圖1-8。

實施例1：構建macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型。

1.1實驗動物。

macf1^fl/+小鼠與sp7-cre轉基因小鼠的飼養。

macf1^fl/+小鼠與sp7-cre轉基因小鼠經隔離觀察未見異常后進入飼養區，飼養按照spf動物飼養標準執行，實驗操作嚴格按照spf動物管理相關規定進行。

1.2macf1^fl/+小鼠基因型鑒定

剪取小鼠腳趾，提取macf1^fl/+小鼠基因組dna，采用引物進行小鼠基因型鑒定；以小鼠macf1基因序列為模板，具體設計引物序列如下：

ap179：5’-aaagaaacggaaatactggcc-3’；

ap180：5'-gcagcttaattctgccaaattc-3’。

參照圖2，pcr鑒定結果顯示擴增出700bp和750bp兩條帶，證明為雜合子macf1^fl/+小鼠。

1.3sp7-cre轉基因小鼠基因型鑒定。

剪取小鼠腳趾，提取sp7-cre轉基因小鼠基因組dna，采用引物進行小鼠基因型鑒定；根據cre基因序列為模板引物序列具體設計如下：

sp7-icre-wt-f：5'-taccagaagcgaccacttgagc-3'；

icre-mut-r：5'-gcacacagacaggagcatcttc-3'。

參照圖3，pcr鑒定結果顯示擴增得一條445bp的條帶，證明為sp7-cre轉基因小鼠。

1.4參照圖1，構建macf1基因在成骨細胞中條件性敲除純合子小鼠模型。

(1)選用macf1^fl/+小鼠自交，獲得純合子macf1^fl/fl小鼠。

(2)選用sp7-cre轉基因小鼠與spf級c57bl/6j小鼠交配，獲得sp7-cre轉基因小鼠。

(3)將獲得的macf1^fl/fl小鼠與sp7-cre轉基因小鼠交配，獲得macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的雜合子小鼠，即半敲sp7-cre；macf1^fl/+小鼠；再利用sp7-cre；macf1^fl/+小鼠進行自交，獲得macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的純合子小鼠，即全敲sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠，其基因型通過雙重pcr方法篩選鑒定。參照圖4，分別獲得750bp和445bp兩個條帶，表明獲得了全敲sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠。

(4)將獲得的sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠與macf1^fl/fl小鼠進行交配，獲得更多的sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠與macf1^fl/fl小鼠，然后對7-9天齡子代小鼠剪腳趾提取基因組dna，用雙重pcr篩選鑒定基因型，理論上產生的后代有1/2的macf1^fl/fl子鼠和1/2的sp7-cre；macf1^fl/fl子鼠。子鼠基因型確定后，用于macf1基因在成骨細胞中條件性敲除小鼠模型的表型鑒定。

實施例2：檢測條件性敲除的小鼠模型的成骨細胞中macf1的表達情況。

取新生小鼠顱骨成骨細胞，并提取其rna進行sybrgreenreal-timequantitativepcr(簡稱qrt-pcr)，檢測macf1在mrna水平的表達情況，以驗證macf1在macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型的成骨細胞中低表達，從而確定動物模型構建成功。

參照圖5，macf1在sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠的成骨細胞中的表達量顯著低于macf1^fl/fl小鼠，說明macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型構建成功。

實施例3：成骨細胞中敲除macf1對小鼠成骨細胞中相關成骨基因表達的影響。

取新生小鼠顱骨成骨細胞，提取其rna進行qrt-pcr，檢測成骨分化標志基因(alp、runx2、col-i、ocn)的表達情況。

參照圖6，結果表明，與macf1^fl/fl小鼠相比，sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠成骨細胞中相關成骨基因的表達量均顯著降低，說明在成骨細胞中敲除macf1降低了成骨細胞的分化能力。

實施例4：macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型表型的鑒定

發現macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠股骨骨小梁結構稀疏、骨形成能力降低。

4.1成骨細胞中敲除macf1對小鼠股骨發育的影響。

選取3月齡的sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠和macf1^fl/fl小鼠，取血處死后，剝離取出股骨，去除骨表面的軟組織，用70％乙醇固定后，采用小動物micro-ct掃描，獲取數據后，用siemensinveonresearchworkplace軟件進行三維重建處理。

參照圖7，與macf1^fl/fl小鼠相比，sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠的股骨骨組織骨小梁數量明顯減少。說明在成骨細胞中敲除macf1降低了小鼠骨密度，并改變了骨組織微結構。

4.2成骨細胞中敲除macf1對小鼠骨形成能力的影響。

選取3月齡的sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠和macf1^fl/fl小鼠，分別于處死前10天和3天進行腹腔注射鈣黃綠素(25mg/kg)。取脛骨，40％乙醇固定，樹脂包埋，選擇10μm脛骨樹脂切片浸泡于乙酸乙二醇乙醚溶液中避光脫脂過夜；無水乙醇漂洗后避光室溫晾干，中性樹膠封片；熒光顯微鏡495nm波長下進行雙標觀察、測量，形態計量。

參照圖8，與macf1^fl/fl小鼠相比，sp7-cre；macf1^fl/fl小鼠的骨形成速率明顯降低，說明在成骨細胞中敲除macf1使小鼠的骨形成能力降低。

sequencelisting

<110>西北工業大學

<120>macf1基因在成骨細胞中條件性敲除的小鼠模型的構建及應用

<130>說明書，權利要求書

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aaagaaacggaaatactggcc21

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gcagcttaattctgccaaattc22

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

taccagaagcgaccacttgagc22

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gcacacagacaggagcatcttc22

序列表

1