一種蘋果樹腐爛病生防菌劑及其應用的制作方法
本發明涉及生防菌劑，具體涉及一種蘋果樹腐爛病生防菌劑及其應用。
背景技術：
蘋果樹腐爛病(valsamalimiyabeetyamada)俗稱爛皮病、臭皮病，是由黑腐皮殼屬(valsaceratosperma)引起的北方蘋果樹重要的病害。該病主要危害3年生以上的結果樹，造成樹勢衰弱、枝干枯死、死樹甚至毀園。該病癥狀主要以潰瘍型為主。潰瘍型在早春樹干、樹皮上出現紅褐色、水漬狀、微隆起、圓至長圓形病斑，質地松軟，易撕裂，手壓容易凹陷，流出黃褐色汁液，有酒糟味。后期干縮下陷，病部邊緣裂縫，有明顯的小黑點即分生孢子器，潮濕時小黑點涌出橘黃色卷須分生孢子。一般3-5月份侵染，7-8月開始發病，早春為發病高峰期。
蘋果樹腐爛病的防治一直以化學農藥防治為主，但化學農藥長期并大量的使用已經造成環境污染、生態失衡、人畜中毒及殺傷有益微生物等嚴重問題。目前生物防治越來越受到廣大研究者和果農的認可，因此開發安全性高、環境兼容性好、有效性持久的生物防治劑成為植物真菌病害綜合防治的熱點研究方向。
目前，已經公開的防治蘋果樹腐爛病的生防菌劑涉及細菌和真菌的較多，比如：
中國專利cn105331545a公開了一種防治蘋果樹腐爛病的菌株、微生物菌劑及其制備方法。所述菌株61239已于2015年7月1日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctccm2015420。生防真菌來源于自然界中，無污染、無公害、無殘留，對人畜無毒副作用，無論是對蘋果樹還是對人體、生態環境都相當的安全，可運用于蘋果樹的任何生育期，特別是休眠期，不產生任何抗性，可徹底控制和根治蘋果腐爛病。實驗證明，對蘋果樹腐爛病菌特異性強，控制效果好，平均防效在95％以上。所述菌株61239對蘋果腐爛病菌具有顯著的抑菌和殺菌活性，特別是能以蘋果樹體上的老翹皮、各個剪鋸口處死組織上的纖維素和木質素為養分，長期定殖存活于蘋果樹上，既能預防新病斑的產生，又能防止原有老疤的復發，可持久地控制蘋果腐爛病菌，從而達到徹底控制和根治蘋果腐爛病的目的。
中國專利cn105284902a公開了一種防治蘋果樹腐爛病生防菌發酵液制備方法；所述菌株sl17和sl18均為枯草芽孢桿菌，已于2015年保藏于山西省農業科學院植物保護研究所菌種庫，菌株sl17保藏編號為saasipplf17，菌株sl18保藏編號為saasipplf18。該專利對所述菌株進行液體培養并濃縮后制得發酵液藥劑及發酵液膏劑，有效防治蘋果樹腐爛病，治愈率約80％，促進傷口愈合，傷口愈合平均寬度為9.46cm2，病斑復發率為4.21％。
中國專利cn102851225a公開了一株微嗜酸寡養單胞菌及其在蘋果樹腐爛病生方劑中的應用，所述菌株bj1保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：cctccno:2011475，實驗表明，微嗜酸寡養單胞菌bj1在蘋果離體枝條防效實驗中。發酵濾液對蘋果樹腐爛病的防效達94.97％，在2-3年生蘋果樹幼樹防效實驗中也達70％以上，防效穩定，對環境友好，發酵工藝簡單，生產成本低廉；
但是，細菌和真菌產生的抑菌性生物活性物質種類少，產量低，活性低，持效期短，防病效果不理想。
放線菌對靶標菌發揮生防作用一般通過兩種途徑：在寄主體外通過抗生作用、競爭作用、捕食和重寄生作用，導致病原菌的致病性及侵染效率降低；放線菌也可在寄主植物組織內，誘發其產生抗性或者產生抑菌物質，影響病原菌的生長、繁殖，最后導致其死亡。
鏈霉菌是一種放線菌，其產生的抗生素、胞外酶等抗真菌活性物質比益生細菌和真菌所產生的活性物質種類更多、活性更強，用其孢子和菌絲制成的活細胞制劑無毒、無害、無殘留、不傷害非靶標微生物、與環境兼容性好、防病持效期長，且產孢量大、孢子抗逆性強、易于制成活細胞制劑如孢子粉劑、種衣劑、菌絲體培養物等以及便于生產和運輸保存。被廣泛應用于農業病害的生物防治。
目前，公開的防治蘋果樹腐爛病的鏈霉菌較少，比如：
中國專利cn104673723a公開了一種極長鏈霉菌株sl01(streptomyceslongissimussl01)及由該菌株制備的微生物菌劑(發酵液及發酵濾液)。該發明還公開了兩種微生物菌劑在防治蘋果樹腐爛病中的應用。采用不同處理方法涂抹菌株sl01發酵液及發酵濾液發現，離體枝條和果實的防效均達到90％，與藥劑對照甲基硫菌靈達到同一水平；2012年大田試驗中，刮病斑后涂抹sl01菌劑防治效果100％，劃線后涂抹防效為58％；2013年大田試驗中，刮病斑后涂抹sl01菌劑防治效果97.8％，超過甲基硫菌靈藥劑對照的防效(84.6％)，劃線后涂抹防效為64.4％，均可有效降低為防治蘋果樹腐爛病而大量施用化學農藥所造成的對生態環境的破壞，具有很好的生態和社會效益，開發應用前景廣闊。
中國專利cn101822272b公開了一種灰黃鏈霉菌在生物防治植物病害中的應用。該應用具體為灰黃鏈霉菌(streptomycesgriseoflavus)nmg6-3-9cgmccno.3441在生物防治植物病害中的應用。該菌株對苜蓿根腐病病原菌具有非常好的拮抗作用，能夠用于生物防治苜蓿根腐病及其它多種植物病害，在生物防治植物病害領域具有廣闊的應用前景。該發明為苜蓿根腐病的生物防治奠定基礎，進而為該病生防放線菌制劑的研制與應用提供科學依據。張清明等研究了伍卡爾鏈霉菌發酵濾液對蘋果樹腐爛病的防效達70％。
上述公開的鏈霉菌防病效果仍不很理想，且防病機理同大多數細菌和真菌一樣，主要是通過代謝產生抗生素、抗菌肽等抗菌物質產生拮抗效應抑制病原菌的生長和繁殖，防病效果不徹底，不能根治蘋果樹腐爛病。
研究表明：病原菌的細胞壁以幾丁質、纖維素為骨架，以β-1,3-葡聚糖及蛋白質為主要填充物。放線菌是抗生素的主要產生菌，生防放線菌除通過抗生素的拮抗作用抑制病原菌外，在常規誘導物的作用下，產生幾丁質酶、β-1,3-葡聚糖酶等胞外水解酶的放線菌對病原菌有抑菌作用，如果能直接以蘋果樹腐爛病病原菌菌絲體為營養進行生長、繁殖，并且誘導生防菌自身產生多種可降解病原菌細胞壁的胞外水解酶，通過協同酶溶作用使病原菌細胞崩解，不僅可直接殺死病原菌，而且可長期定殖在蘋果樹腐爛病斑處，徹底防止蘋果樹腐爛病的發生，提高防病效果，有效防止腐爛病復發。
綜上，制備一種可以直接以蘋果樹腐爛病病原菌菌絲體為營養進行生長、繁殖，同時誘導生防菌自身產生多種可降解病原菌細胞壁的胞外水解酶以提高防病效果，防止蘋果樹腐爛病復發的蘋果樹腐爛病生防菌劑是本領域技術人員的期盼。
技術實現要素：
本發明所解決的技術問題是克服現有蘋果樹腐爛病生防菌劑的缺陷，將可以直接以蘋果樹腐爛病病原菌菌絲體為營養進行生長、繁殖，同時能夠誘導自身產生多種可降解病原菌細胞壁的胞外水解酶，且可以長期定殖于蘋果樹腐爛病病斑處的微白黃鏈霉菌actin-1經固體發酵制成孢子原粉，然后與紫外保護劑、分散劑、載體等助劑科學篩選、復配，提供一種有效提高防病效果，防止蘋果樹腐爛病復發的生防菌劑。
為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案：
一種蘋果樹腐爛病生防菌劑，主要由以下重量份數的原料制備：
微白黃鏈霉菌孢子原粉53-61份，載體36-44份，紫外保護劑1-3份，分散劑0.8-1.2份；
優選地，所述蘋果樹腐爛病生防菌劑，主要由以下重量份數的原料制備：
微白黃鏈霉菌孢子原粉55-59份，載體38-42份，紫外保護劑1.5-2.5份，分散劑0.9-1.1份；
更優選地，所述蘋果樹腐爛病生防菌劑，主要由以下重量份數的原料制備：
微白黃鏈霉菌孢子原粉57份，載體40份，紫外保護劑2份，分散劑1.0份；
優選地，所述微白黃鏈霉菌孢子原粉是將微白黃鏈霉菌菌種經活化、產孢制備成孢子懸液，然后繼續液體發酵制得發酵種子液，最后將其接種于固體發酵培養基經發酵，晾干、粉碎、過篩而成；
更優選地，所述微白黃鏈霉菌孢子原粉的制備方法，包括如下步驟：
1)發酵種子液的制備：將微白黃鏈霉菌菌種劃線接種于高氏一號瓊脂培養基斜面上，28-32℃培養6-8天至產孢；然后向斜面加入5ml無菌水，用滅菌接種針將孢子刮下，加入無菌水中，震蕩混勻，調整孢子濃度為0.5-1.5×106個/ml得孢子懸液；將所述孢子懸液按接種量1％(v/v)接種到液體種子培養基中，28-32℃，180-220r/min，搖瓶培養46-50h即得發酵種子液；
2)固體發酵培養基的制備：按照固體發酵培養基配方，先用部分水將k2hpo4、mgso4·7h2o溶解，然后與其它原料混勻，分裝至滅菌袋，于121℃滅菌45min，冷卻至35℃；平鋪于長70cm，寬50cm，深5cm滅菌后的曲盤中，料層厚度1-3cm；
3)固體發酵：按體積質量比10％的接種量將步驟1)發酵種子液接種至步驟2)盛有固體發酵培養基的曲盤中；底層用滅菌的報紙覆蓋，上層用滅菌的麻包覆蓋，移入曲房；于溫度28-32℃、濕度64-66％培養22-26h后將麻包、報紙掀開，翻耙，然后依次將報紙、麻包覆蓋，每22-26h重復操作一次；同樣條件下繼續培養至94-98h后移至烘干房，于35℃晾干，粉碎、過120目篩即得微白黃鏈霉菌孢子原粉；
所述高氏一號瓊脂培養基質量組成：可溶性淀粉：20g，k2hpo4·3h2o：0.5g，nacl：0.5g，kno3：1g，mgso4·7h2o：0.5g，feso4·7h2o：0.01g，蒸餾水：1l，瓊脂：20g，ph值7.2-7.4；
所述液體種子培養基質量組成：玉米粉：10g，豆餅粉：10g，淀粉：10g，k2hpo4：0.2g，自來水：1l，ph值7.2；
所述固體發酵培養基質量組成為：棉籽皮：160g，麩皮：280g，玉米粉：120g，豆餅粉120g，碳酸鈣：10g，k2hpo4：2g，mgso4·7h2o：2g，生石灰：5g，自來水：1l，ph值7.0；
所述微白黃鏈霉菌具體為微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1，是從山東省煙臺市果園土壤中分離、純化、篩選得到的，保藏編號為cgmccno.13927，分類命名為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavus；
所述微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1生長溫度范圍為15-45℃，最適生長溫度為30℃；耐受ph值范圍為3.0-10.0，最適生長ph值為7.0；可耐受1-10％的氯化鈉溶液，生長良好，在濃度為3-5％時生長最好；能夠在多種培養基上生長；
所述微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1對蘋果樹腐爛病病原菌的抑菌率為89.82％；對貝倫格葡萄座腔菌、鏈格孢蘋果專化型、惡疫霉、櫻桃鏈格孢菌、大麗輪枝菌、櫻桃球腔菌、立枯絲核菌、灰葡萄孢霉菌、炭疽病菌、蘋果鏈格孢等多種病原菌具有較好的抑菌效果，抑菌率為76.08-87.10％，具有廣譜抑菌性；
所述微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1在以蘋果樹腐爛病病原菌菌絲體為唯一碳源的基礎培養基(液體和瓊脂)中能夠正常生長、繁殖，具有以下特性：
1)誘導自身產生多種胞外水解酶，其中幾丁質酶活性峰值為140.26u/ml；β-1,3-葡聚糖酶活性峰值為49.46u/ml；多酚氧化酶活性峰值為39.25u/ml；蛋白酶活性峰值為10.90u/ml；
2)對蘋果樹腐爛病病原菌的孢子萌發有抑制作用：無菌水對照處理，蘋果樹腐爛病病原菌孢子萌發率為98.60％，而加入微白黃鏈霉菌粗酶液處理，蘋果樹腐爛病病原菌孢子萌發率僅僅為3.60％，較對照抑制率提高96.35％；
3)對蘋果樹腐爛病病原菌菌絲體有明顯的溶解作用：與無菌水比較，72h時粗酶液處理的病原菌氣生菌絲體下陷，溶菌圈直徑可達6mm，產生明顯溶解作用。蛋白酶k溶解作用最顯著，溶解圈直徑為10mm。而無菌水對照ck未出現菌絲溶解現象，僅表現出水滴作用的壓痕；
4)對蘋果樹腐爛病病原菌有顯著的抑菌效果：能產生活性較強的抑菌物質，抑菌率可達96.7％；
所述微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1經傳30代后，對蘋果樹腐爛病病原菌及其他病原菌的抑菌活性與微白黃鏈霉菌actin-1第1代抑菌率基本一致，表明本發明所述的微白黃鏈霉菌actin-1不會隨傳代次數的增加而降低抑制活性，具有較高的遺傳穩定性。
優選地，所述載體為碳酸鈣、硅藻土、活性炭、鈣基膨潤土中的任意一種；
更優選地，所述載體為硅藻土。
優選地，所述分散劑為十二烷基硫酸鈉、可溶性淀粉、羧甲基纖維素鈉、木質素磺酸鈉中的任意一種；
更優選地，所述分散劑為可溶性淀粉。
優選地，所述紫外保護劑為腐殖酸、糊精、海藻酸鈉、甲基纖維素中的任意一種；
更優選地，所述紫外保護劑為腐殖酸。
本發明另一目的是提供上述蘋果樹腐爛病生防菌劑的制備方法，包括如下步驟：按照配方，準確稱量微白黃鏈霉菌孢子原粉、載體、紫外保護劑、分散劑，按照等量遞增法混合均勻即得蘋果樹腐爛病生防菌劑。
上述方法制備的生防菌劑菌活量為6.2-6.9×1012cfu/g。
本發明還提供上述蘋果樹腐爛病生防菌劑在防治蘋果樹腐爛病方面的應用。
經田間蘋果樹腐爛病病斑的刮除治療試驗，試驗結果表明微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1可有效防止蘋果樹腐爛病復發，防治效果為100％，復發率為0，且可以長期定殖于已經治愈的蘋果樹腐爛病病斑處，發揮長期的生物防治作用。
有益效果：
1.本發明生防菌劑中微白黃鏈霉菌actin-1可以以蘋果樹腐爛病病原菌菌絲體為營養進行生長、繁殖，利于生防菌在蘋果樹腐爛病斑處長期定殖，發揮長期的生物防治作用，同時誘導自身產生多種胞外細胞壁水解酶，通過協同酶溶作用使病原菌細胞崩解，并且能夠產生較強的抗菌活性物質，對蘋果樹腐爛病病原菌生長產生抑制作用，多種機制共同作用阻止蘋果樹腐爛病病原菌的生長、繁殖，大大提高了對蘋果樹腐爛病的生防效果。
2.本發明生防菌劑中微白黃鏈霉菌actin-1對蘋果樹腐爛病病原菌的抑菌率為89.82％；對貝倫格葡萄座腔菌、鏈格孢蘋果專化型、惡疫霉、櫻桃鏈格孢菌、大麗輪枝菌、櫻桃球腔菌、立枯絲核菌、灰葡萄孢霉菌、炭疽病菌、蘋果鏈格孢等多種病原菌具有較好的抑菌效果，抑菌率為76.08-87.10％，具有廣譜抑菌性；
3.本發明生防菌劑中微白黃鏈霉菌actin-1耐受溫度高，可以在45℃的條件下保持良好的生長狀態，說明微白黃鏈霉菌actin-1不僅在發酵過程中可以保持較強的菌種活力，另一方面也可以說明，其生防菌劑在應用于病原菌的防治過程中，不僅在常溫條件下可以保持顯著的抑菌效果，而且可以在高溫天氣，仍然保持良好的菌株活力以及抑菌效力，具有較強的耐候性。
4.本發明生防菌劑中微白黃鏈霉菌actin-1具有耐酸性和耐堿性，在ph值3.0-10酸堿范圍內，仍然呈現良好的生長狀態，不僅在發酵過程中可以保持較強的菌種活力，在生防菌劑應用于病原菌的防治過程中，也可以抵抗外界不同的酸堿環境，同時保持較高的抑菌活力，耐酸堿性強。
5.本發明生防菌劑中微白黃鏈霉菌actin-1經傳30代后，對蘋果樹腐爛病病原菌及其他病原菌的抑菌活性與微白黃鏈霉菌actin-1第1代抑菌率基本一致，表明微白黃鏈霉菌actin-1不會隨傳代次數的增加而降低抑制活性，具有較高的遺傳穩定性。
6.本發明生防菌劑中微白黃鏈霉菌actin-1發酵活力高，通過液體發酵種子液和固體發酵及助劑的選擇最終獲得菌活量為6.2-6.9×1012cfu/g的生防菌劑，在蘋果樹腐爛病應用上防治效果達100％，復發率為零，同時該菌還可促進病斑傷口愈傷組織的愈合。再分離實驗表明微白黃鏈霉菌actin-1成功在蘋果樹腐爛病病斑出長期定殖，且定殖率很高。
本發明生防菌劑具有防治效果好(抑菌率高)、效率高(徹底降解病原菌細胞)、復發率低(病斑處定殖能力強)、適應環境能力強(耐高溫、耐酸堿性強)、穩定強(遺傳穩定性強)、不易產生抗藥性等多重優點，是生物防治的首選，對提高蘋果樹腐爛病等果蔬病原菌的防治效果、防止病原菌復發、保護環境具有重要意義。
附圖說明
圖1實施例9對照組正常菌絲鏡檢圖；
圖2實施例9處理組變異菌絲鏡檢圖；
圖3生防菌劑治愈蘋果樹腐爛病病斑4年后的蘋果樹腐爛病病斑愈合效果圖。
具體實施方式
下面通過具體的實施方案敘述本發明。除非特別說明，本發明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的范圍，本發明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發明的保護范圍。
實施例1
一種蘋果樹腐爛病生防菌劑，主要由以下重量份數的原料制備：微白黃鏈霉菌孢子原粉57份，載體40份，紫外保護劑2份，分散劑1.0份；
所述微白黃鏈霉菌孢子原粉的制備方法，包括如下步驟：
1)發酵種子液的制備：將微白黃鏈霉菌菌種劃線接種于高氏一號瓊脂培養基斜面上，30℃培養7天至產孢；然后向斜面加入5ml無菌水，用滅菌接種針將孢子刮下，加入無菌水中，震蕩混勻，調整孢子濃度為1×106個/ml得孢子懸液；將所述孢子懸液按接種量1％(v/v)接種到液體種子培養基中，30℃，200r/min，搖瓶培養48h即得發酵種子液；
2)固體發酵培養基的制備：按照固體發酵培養基配方，先用部分水將k2hpo4、mgso4·7h2o溶解，然后與其它原料混勻，分裝至滅菌袋，于121℃滅菌45min，冷卻至35℃；平鋪于長70cm，寬50cm，深5cm滅菌后的曲盤中，料層厚度2cm；
3)固體發酵：按體積質量比10％的接種量將步驟1)發酵種子液接種至步驟2)盛有固體發酵培養基的曲盤中；底層用滅菌的報紙覆蓋，上層用滅菌的麻包覆蓋，移入曲房；于溫度30℃、濕度65％培養24h后將麻包、報紙掀開，翻耙，然后依次將報紙、麻包覆蓋，每24h重復操作一次；同樣條件下繼續培養培養至96h后移至烘干房，于35℃晾干，粉碎、過120目篩即得微白黃鏈霉菌孢子原粉；
所述高氏一號瓊脂培養基質量組成：可溶性淀粉：20g，k2hpo4·3h2o：0.5g，nacl：0.5g，kno3：1g，mgso4·7h2o：0.5g，feso4·7h2o：0.01g，蒸餾水：1l，瓊脂：20g，ph值7.3；
所述液體種子培養基質量組成：玉米粉：10g，豆餅粉：10g，淀粉：10g，k2hpo4：0.2g，自來水：1l，ph值7.2；
所述固體發酵培養基質量組成為：棉籽皮：160g，麩皮：280g，玉米粉：120g，豆餅粉120g，碳酸鈣：10g，k2hpo4：2g，mgso4·7h2o：2g，生石灰：5g，自來水：1l，ph值7.0；
所述微白黃鏈霉菌具體為微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1，保藏編號為cgmccno.13927，分類命名為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavus；
所述載體為硅藻土；
所述分散劑為可溶性淀粉；
所述紫外保護劑為腐殖酸；
制備方法，包括如下步驟：按照配方，準確稱量微白黃鏈霉菌孢子原粉、載體、紫外保護劑、分散劑，按照等量遞增法混合均勻即得蘋果樹腐爛病生防菌劑。
上述方法制備的生防菌劑菌活量為6.9×1012cfu/g。
實施例2
一種蘋果樹腐爛病生防菌劑，主要由以下重量份數的原料制備：微白黃鏈霉菌孢子原粉55份，載體38份，紫外保護劑1.5份，分散劑0.9份；
所述微白黃鏈霉菌孢子原粉的制備方法，包括如下步驟：
1)發酵種子液的制備：將微白黃鏈霉菌菌種劃線接種于高氏一號瓊脂培養基斜面上，28℃培養6天至產孢；然后向斜面加入5ml無菌水，用滅菌接種針將孢子刮下，加入無菌水中，震蕩混勻，調整孢子濃度為1.5×106個/ml得孢子懸液；將所述孢子懸液按接種量1％(v/v)接種到液體種子培養基中，28℃，180r/min，搖瓶培養46h即得發酵種子液；
2)固體發酵培養基的制備：按照固體發酵培養基配方，先用部分水將k2hpo4、mgso4·7h2o溶解，然后與其它原料混勻，分裝至滅菌袋，于121℃滅菌45min，冷卻至35℃；平鋪于長70cm，寬50cm，深5cm滅菌后的曲盤中，料層厚度1cm；
3)固體發酵：按體積質量比10％的接種量將步驟1)發酵種子液接種至步驟2)盛有固體發酵培養基的曲盤中；底層用滅菌的報紙覆蓋，上層用滅菌的麻包覆蓋，移入曲房；于溫度28℃、濕度64％培養22h后將麻包、報紙掀開，翻耙，然后依次將報紙、麻包覆蓋，每22h重復操作一次；同樣條件下繼續培養至94h后移至烘干房，于35℃晾干，粉碎、過120目篩即得微白黃鏈霉菌孢子原粉；
所述高氏一號瓊脂培養基、液體種子培養基、固體發酵培養基質量組成同實施例1；
所述微白黃鏈霉菌具體為微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1，保藏編號為cgmccno.13927，分類命名為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavus；
所述載體為碳酸鈣；
所述分散劑為十二烷基硫酸鈉；
所述紫外保護劑為海藻酸鈉；
制備方法同實施例1；
上述方法制備的生防菌劑菌活量為6.8×1012cfu/g。
實施例3
一種蘋果樹腐爛病生防菌劑，主要由以下重量份數的原料制備：微白黃鏈霉菌孢子原粉59份，載體42份，紫外保護劑2.5份，分散劑1.1份；
所述微白黃鏈霉菌孢子原粉的制備方法，包括如下步驟：
1)發酵種子液的制備：將微白黃鏈霉菌菌種劃線接種于高氏一號瓊脂培養基斜面上，32℃培養8天至產孢；然后向斜面加入5ml無菌水，用滅菌接種針將孢子刮下，加入無菌水中，震蕩混勻，調整孢子濃度為0.5×106個/ml得孢子懸液；將所述孢子懸液按接種量1％(v/v)接種到液體種子培養基中，32℃，220r/min，搖瓶培養50h即得發酵種子液；
2)固體發酵培養基的制備：按照固體發酵培養基配方，先用部分水將k2hpo4、mgso4·7h2o溶解，然后與其它原料混勻，分裝6個滅菌袋進行121℃滅菌45min，冷卻至35℃；平鋪于長70cm，寬50cm，深5cm滅菌后的曲盤中，料層厚度3cm；
3)固體發酵：按體積質量比10％的接種量將步驟1)發酵種子液接種至步驟2)盛有固體發酵培養基的曲盤中；底層用滅菌的報紙覆蓋，上層用滅菌的麻包覆蓋，移入曲房；于溫度32℃、濕度66％培養26h后將麻包、報紙掀開，翻耙，然后依次將報紙、麻包覆蓋，每26h重復操作一次；同樣條件下繼續培養至98h后移至烘干房，于35℃晾干，粉碎、過120目篩即得微白黃鏈霉菌孢子原粉；
所述高氏一號瓊脂培養基、液體種子培養基、固體發酵培養基質量組成同實施例1；
所述微白黃鏈霉菌具體為微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1，保藏編號為cgmccno.13927，分類命名為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavus；
所述載體為活性炭；
所述分散劑為羧甲基纖維素鈉；
所述紫外保護劑為糊精；
制備方法同實施例1；
上述方法制備的生防菌劑菌活量為6.6×1012cfu/g。
實施例4
一種蘋果樹腐爛病生防菌劑，主要由以下重量份數的原料制備：微白黃鏈霉菌孢子原粉53份，載體36份，紫外保護劑1份，分散劑0.8份；
所述微白黃鏈霉菌孢子原粉的制備方法，包括如下步驟：
1)發酵種子液的制備：將微白黃鏈霉菌菌種劃線接種于高氏一號瓊脂培養基斜面上，28℃培養8天至產孢；然后向斜面加入5ml無菌水，用滅菌接種針將孢子刮下，加入無菌水中，震蕩混勻，調整孢子濃度為0.5×106個/ml得孢子懸液；將所述孢子懸液按接種量1％(v/v)接種到液體種子培養基中，32℃，180r/min，搖瓶培養50h即得發酵種子液；
2)固體發酵培養基的制備：按照固體發酵培養基配方，先用部分水將k2hpo4、mgso4·7h2o溶解，然后與其它原料混勻，分裝至滅菌袋，于121℃滅菌45min，冷卻至35℃；平鋪于長70cm，寬50cm，深5cm滅菌后的曲盤中，料層厚度1cm；
3)固體發酵：按體積質量比10％的接種量將步驟1)發酵種子液接種至步驟2)盛有固體發酵培養基的曲盤中；底層用滅菌的報紙覆蓋，上層用滅菌的麻包覆蓋，移入曲房；于溫度28℃、濕度66％培養26h后將麻包、報紙掀開，翻耙，然后依次將報紙、麻包覆蓋，每22h重復操作一次；同樣條件下繼續培養至98h后移至烘干房，于35℃晾干，粉碎、過120目篩即得微白黃鏈霉菌孢子原粉；
所述高氏一號瓊脂培養基、液體種子培養基、固體發酵培養基質量組成同實施例1；
所述微白黃鏈霉菌具體為微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1，保藏編號為cgmccno.13927，分類命名為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavus；
所述載體為鈣基膨潤土；
所述分散劑為木質素磺酸鈉；
所述紫外保護劑為甲基纖維素；
制備方法同實施例1；
上述方法制備的生防菌劑菌活量為6.4×1012cfu/g。
實施例5
一種蘋果樹腐爛病生防菌劑，主要由以下重量份數的原料制備：微白黃鏈霉菌孢子原粉61份，載體44份，紫外保護劑3份，分散劑1.2份；
所述微白黃鏈霉菌孢子原粉的制備方法，包括如下步驟：
1)發酵種子液的制備：將微白黃鏈霉菌菌種劃線接種于高氏一號瓊脂培養基斜面上，32℃培養6天至產孢；然后向斜面加入5ml無菌水，用滅菌接種針將孢子刮下，加入無菌水中，震蕩混勻，調整孢子濃度為0.5×106個/ml得孢子懸液；將所述孢子懸液按接種量1％(v/v)接種到液體種子培養基中，32℃，180r/min，搖瓶培養50h即得發酵種子液；
2)固體發酵培養基的制備：按照固體發酵培養基配方，先用部分水將k2hpo4、mgso4·7h2o溶解，然后與其它原料混勻，分裝至滅菌袋，于121℃滅菌45min，冷卻至35℃；平鋪于長70cm，寬50cm，深5cm滅菌后的曲盤中，料層厚度3cm；
3)固體發酵：按體積質量比10％的接種量將步驟1)發酵種子液接種至步驟2)盛有固體發酵培養基的曲盤中；底層用滅菌的報紙覆蓋，上層用滅菌的麻包覆蓋，移入曲房；于溫度32℃、濕度64％培養22h后將麻包、報紙掀開，翻耙，然后依次將報紙、麻包覆蓋，每26h重復操作一次；同樣條件下繼續培養至94h后移至烘干房，于35℃晾干，粉碎、過120目篩即得微白黃鏈霉菌孢子原粉；
所述高氏一號瓊脂培養基、液體種子培養基、固體發酵培養基質量組成同實施例1；
所述微白黃鏈霉菌具體為微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1，保藏編號為cgmccno.13927，分類命名為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavus；
所述載體為硅藻土；
所述分散劑為可溶性淀粉；
所述紫外保護劑為海藻酸鈉；
制備方法同實施例1；
上述方法制備的生防菌劑菌活量為6.5×1012cfu/g。
實施例6
一種蘋果樹腐爛病生防菌劑，主要由以下重量份數的原料制備：微白黃鏈霉菌孢子原粉56份，載體40份，紫外保護劑3份，分散劑1.0份；
所述微白黃鏈霉菌孢子原粉的制備方法同實施例1；
所述高氏一號瓊脂培養基、液體種子培養基、固體發酵培養基質量組成同實施例1；
所述微白黃鏈霉菌具體為微白黃鏈霉菌(streptomycesalbidoflavus)actin-1，保藏編號為cgmccno.13927，分類命名為微白黃鏈霉菌streptomycesalbidoflavus；
所述載體、紫外保護劑、分散劑為本領域常規市售產品；
制備方法同實施例1；
上述方法制備的生防菌劑菌活量為6.2×1012cfu/g。
實施例7微白黃鏈霉菌actin-1生長溫度及耐酸堿試驗
微白黃鏈霉菌actin-1孢子懸液的制備：將微白黃鏈霉菌actin-1劃線接種于高氏一號瓊脂培養基斜面上，30℃培養7天至產孢；加入5ml無菌水，用滅菌接種針將孢子刮入無菌水中，震蕩混勻，調整孢子濃度為1×106個/ml得到孢子懸液。
1.生長溫度試驗
配制2216e液體培養基，分裝于48個500ml三角瓶中，100ml/瓶，121℃滅菌30min，備用；將上述孢子懸液按照5‰(v/v)接種于其中的36個三角瓶中，作為處理組，不接種的12個三角瓶作為對照組，按照0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃溫度梯度分組，每組3個處理1個對照進行恒溫培養，培養條件200rpm震蕩培養5天，觀察并記錄各溫度下微白黃鏈霉菌actin-1的生長情況。結果見表7。
2.耐酸堿性試驗
用稀hcl或naoh溶液將2216e液體培養基調節成不同ph值(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)，每個ph值2216e液體培養基分裝4個500ml三角瓶中，100ml/瓶，于121℃滅菌30min。將上述孢子懸液按5‰(v/v)分別接種到上述裝有不同ph值的2216e液體培養基中。每個ph值液體培養基接種3個，設為處理組，1個不接種，設為對照組，全部于30℃，200rpm震蕩培養5天，記錄各ph值下微白黃鏈霉菌actin-1生長情況。結果見表1。
表1微白黃鏈霉菌actin-1生長溫度及耐酸堿結果
注：“+”代表生長，“-”代表不生長，“++”代表生長良好，“+++”代表生長茂盛。
由表1可以看出，微白黃鏈霉菌actin-1具有較強的耐熱性，可以在45℃的條件生長，由此說明，微白黃鏈霉菌actin-1不僅在常溫條件下可以保持顯著的抑菌效果，而且可以在高溫的天氣，仍然保持良好的菌株活力以及抑菌效力。
微白黃鏈霉菌actin-1具有耐酸性以及極強的耐堿性，在ph值3.0-10.0的酸堿脅迫下，能夠生長，說明微白黃鏈霉菌actin-1不僅在發酵過程中可以保持較強的菌種活力，而且在生防菌劑應用于病原菌的防治過程中，也可以抵抗外界不同的酸堿環境，從而保持較高的抑菌活力。
實施例8微白黃鏈霉菌actin-1廣譜抑菌性驗證及遺傳穩定性試驗：
進行微白黃鏈霉菌actin-1對蘋果樹腐爛病病原菌(蘋果黑腐皮殼菌)、蘋果斑點落葉病病原菌(鏈格孢蘋果專化型)等11株病原菌的抑菌實驗，具體操作步驟如下：
1)將微白黃鏈霉菌actin-1劃線接種于高氏一號瓊脂培養基平板，于30℃培養5天；將蘋果樹腐爛病病原菌點接于pda培養基平板，于28℃培養7天；獲得活化微白黃鏈霉菌actin-1和活化病原菌；
2)對峙實驗二：在直徑90mm的pda培養基平板背面畫十字，以十字交叉點為平板圓心，在十字線上距圓心25mm處3個點分別接種3個6mm的活化微白黃鏈霉菌actin-1菌餅作為處理組，第4個點不接菌作為對照組；在圓心處接種1個6mm的活化病原菌菌餅；分別置于30℃培養7天，分別統計對照病原菌半徑和處理病原菌半徑，計算抑菌率。
抑菌率(％)＝(對照病原菌半徑mm-處理病原菌半徑mm)/對照病原菌半徑mm×100。
將微白黃鏈霉菌actin-1進行傳代培養，并測定第10代菌、第20代菌和第30代菌對蘋果樹腐爛病病原菌(蘋果黑腐皮殼菌)及貝倫格葡萄座腔菌、鏈格孢蘋果專化型、惡疫霉、櫻桃鏈格孢菌、大麗輪枝菌、櫻桃球腔菌、立枯絲核菌、灰葡萄孢霉菌、炭疽病菌、蘋果鏈格孢等其他10種病害病原菌的抑菌率，結果見表2，實驗方法同上。
表2微白黃鏈霉菌actin-1不同傳代菌株對11種病原菌的抑菌率
可以看出，微白黃鏈霉菌actin-1不僅對蘋果樹腐爛病病原菌有很強的抑制能力，對貝倫格葡萄座腔菌、鏈格孢蘋果專化型、惡疫霉、櫻桃鏈格孢菌、大麗輪枝菌、櫻桃球腔菌、立枯絲核菌、灰葡萄孢霉菌、炭疽病菌、蘋果鏈格孢等10種果蔬病原菌的抑制能力也很強，具有廣譜抑菌性。
經傳代10代、20代、30代的微白黃鏈菌菌株actin-1對11種病原菌的抑菌率與第一代相比幾乎沒有降低，表明本發明所述的微白黃鏈霉菌actin-1不會隨傳代次數的增加而降低對上述病原菌的抑制活性，具有較高的遺傳穩定性。
實施例9微白黃鏈霉菌actin-1對蘋果樹腐爛病病原菌菌絲的影響
挑取實施例8中微白黃鏈霉菌actin-1對蘋果樹腐爛病病原菌對峙實驗二平板處理組邊緣菌絲及空白對照組菌絲進行40倍鏡檢，鏡檢結果分別見圖2和圖1，鏡檢結果表明處理組菌絲不正常的分支增多，菌絲頂端膨大分支變異，菌絲頂端或中間有泡囊產生，還有部分菌絲扭曲集結的現象，說明微白黃鏈霉菌actin-1既能抑制蘋果樹腐爛病病原菌孢子的萌發也能使病原菌菌絲變異從而抑制病原菌菌絲生長。
實施例10微白黃鏈霉菌actin-1對蘋果樹腐爛病病原菌菌絲體的利用及誘導產酶研究
(1)蘋果樹腐爛病病原菌菌絲體的制備：將蘋果樹腐爛病病原菌點接于pda培養基平板，28℃培養7天獲得活化病原菌；挑取所述活化病原菌菌絲，接種到裝有100ml察氏液體培養基的500ml搖瓶中，30℃、160rpm搖床振蕩培養10天。用滅菌的雙層紗布過濾收集菌絲體，用去離子水沖洗5-10次至無殘留培養液，45℃烘干，研磨至細粉狀，過60目篩即得；
所述pda培養基質量組成為：馬鈴薯(200g)濾液：1l，葡萄糖：20g，瓊脂：20g，ph值自然；
所述察氏液體培養基質量組成：nan03：3g，k2hpo4：1g，mgso4·7h2o：0.5g，kcl：0.5g，feso4·7h2o：0.01g，蔗糖：30g，蒸餾水：1l，ph值自然；
(2)粗酶液的制備方法為：
將微白黃鏈霉菌actin-1劃線接種于高氏一號瓊脂培養基平板，30℃培養7天獲得活化鏈霉菌；并用接種環接種一環到裝有100ml的液體培養基a、b、c、d的500ml三角瓶中，每種培養基設3個重復，30℃、160rpm搖床培養，在第3、5、7和9天于超凈臺上用無菌吸管吸出20ml培養液，將少量無菌脫脂棉置于漏斗底部過濾孢子，濾液于4000rpm離心5min，上清液即為粗酶液；
所述基礎液體培養基a質量組成為：蘋果樹腐爛病病原菌菌絲體：10g，k2hpo4·3h2o：0.5g，kno3：1g，mgso4·7h2o0.5g，feso4·7h2o：10mg，蒸餾水：1l，ph值自然；
所述基礎液體培養基b質量組成為：膠體幾丁質：10g，k2hpo4·3h2o：0.5g，kno3：1g，mgso4·7h2o0.5g，feso4·7h2o：10mg，蒸餾水：1l，ph值自然；
所述基礎液體培養基c質量組成為：淀粉：10g，k2hpo4·3h2o：0.5g，kno3：1g，mgso4·7h2o0.5g，feso4·7h2o：10mg，蒸餾水：1l，ph值自然；
所述基礎液體培養基d質量組成為：酵母菌粉：10g，k2hpo4·3h2o：0.5g，kno3：1g，mgso4·7h2o0.5g，feso4·7h2o：10mg，蒸餾水：1l，ph值自然；
所需說明的是：基礎液體培養基a所制備的粗酶液測定胞外幾丁質酶(chitinase)、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucosidase)、多酚氧化酶(ppo)及蛋白酶(protease)活性；基礎液體培養基b制備的粗酶液測定以膠體幾丁質作為幾丁質酶誘導時所產生的幾丁質酶活性；基礎液體培養基c制備的粗酶液測定以淀粉作為β-1,3-葡聚糖酶和多酚氧化酶誘導物時產生的β-1,3-葡聚糖酶和多酚氧化酶活性；基礎液體培養基d制備的粗酶液以酵母菌粉作為蛋白酶誘導物時產生的蛋白酶活性；
a.幾丁質酶活性測定：取1ml粗酶液，加1ml10g/l的膠體幾丁質，混勻后置于37℃恒溫水浴中水解3h，沸水浴中煮5min終止反應，反應液于4000rpm離心5min，取1ml上清液或稀釋液用dns法測定水解液中n-乙酰氨基葡萄糖含量。
將37℃時1ml酶液在1h內水解幾丁質產生1μgn-乙酰氨基葡萄糖的幾丁質酶活性定義為1u。
結果：基礎液體培養基a中添加蘋果樹腐爛病病原菌菌絲體作為唯一碳能源時，微白黃鏈霉菌actin-1培養液中可檢出幾丁質酶活性，酶活較高。不同培養時間微白黃鏈霉菌actin-1粗酶液的幾丁質酶活性不同，隨培養時間增加，幾丁質酶活性增加，第5天，酶活達峰值，為140.26u/ml，達酶活性峰值后隨培養時間增加酶活性降低；在基礎液體培養基b中以膠體幾丁質為誘導時酶活也是第5天達峰值，為120.47u/ml，低于病原菌菌絲體的粗酶液的幾丁質酶活性。
b.β-1,3-葡聚糖酶活性測定：取0.5ml粗酶液，加入0.5ml10g/l的昆布多糖，混勻后置于45℃恒溫水浴中水解30min。將水解液置于沸水浴中5min終止反應。取1ml水解液或稀釋液用dns法測定水解液中葡萄糖含量。
將45℃時1ml酶液在1min內水解昆布多糖產生1μg葡萄糖的β-1,3-葡聚糖酶活性定義為1u。
結果：基礎液體培養基a中添加蘋果樹腐爛病病原菌菌絲體作為唯一碳能源時，微白黃鏈霉菌actin-1培養液中可檢出β-1,3-葡聚糖酶活性，酶活較高。酶活性隨著培養時間增加而增加，在第7天時酶活達到峰值49.46u/ml，達到峰值后隨著培養時間增加，酶活降低；當基礎液體培養基c中以淀粉為誘導物時，酶活峰值比以菌絲體為碳源時稍高，達50.25u/ml。
c.多酚氧化酶活性測定：取0.02mol/l的鄰苯二酚溶液3ml、0.1mol/l的醋酸鹽緩沖液(ph值4.8)3ml、粗酶液1ml加入到試管中，充分搖勻，于30℃恒溫水浴中水解10min，在400nm波長下測定吸光度值，以每分od值變化0.01定義為1u；
結果：基礎液體培養基a中添加蘋果樹腐爛病病原菌菌絲體作為唯一碳能源時，微白黃鏈霉菌actin-1粗酶液中可檢出多酚氧化酶活性。酶活性隨培養時間增加而增高，第7天時酶活性達峰值39.25u/ml，達峰值后隨培養時間增加酶活降低。當基礎液體培養基c中以淀粉為誘導物時,第5天多酚氧化酶的活性達峰值，為24.91u/ml，低于菌絲體為唯一碳源時的多酚氧化酶活性。
d.蛋白酶活測定：福林試劑法，將1ml粗酶液40℃1min水解酪蛋白產生1μg酪氨酸的蛋白酶活性定義為1u。
結果：基礎培養基a中添加蘋果樹腐爛病病原菌菌絲體作為唯一碳氮能源時,微白黃鏈霉菌actin-1培養液中可檢出蛋白酶活性。培養第7天時的酶活性為10.90u/ml，表明蘋果樹腐爛病病原菌絲體對微白黃鏈霉菌actin-1的蛋白酶合成有誘導作用。微白黃鏈霉菌actin-1在基礎培養基d中以酵母粉作為碳氮能源時蛋白酶活性第7天達峰值，為9.90um/l，與以病原菌菌絲體誘導產生的蛋白酶活性差異不大。
表3微白黃鏈霉菌actin-14種水解酶峰值活性(u/ml)
(3)微白黃鏈霉菌actin-1粗酶液在皿內對病原菌氣生菌絲的溶解作用：
將蘋果樹腐爛病病原菌點接于pda培養基平板，28℃培養7天，用無菌水洗脫、刮取孢子和菌絲于裝有攪拌子的三角瓶中，得到含蘋果樹腐爛病病原菌孢子和菌絲的懸液，震蕩、磁力攪拌使孢子充分分散，過濾除去菌絲得孢子懸液，用無菌水稀釋使孢子含量為1×107個/ml得蘋果樹腐爛病病原菌孢子懸液；將其均勻涂布于pda平板上，28℃下培養8天，待平皿培養基表面均勻長滿氣生菌絲后，用微量移液器分別吸取50μl步驟(2)中用基礎液體培養基a所制備的第3天、5天、7天和9天的微白黃鏈霉菌actin-1的粗酶液，以點滴方式滴加于平皿內氣生菌絲表面，同時以10mg/l的蛋白酶k及無菌水為對照，30℃培養72h，觀察病原菌氣生菌絲溶解現象。
結果：微白黃鏈霉菌actin-1對蘋果樹腐爛病病原菌菌絲有明顯的溶解作用，與無菌水比較，72h時觀察，粗酶液處理的病原菌氣生菌絲體下陷，溶菌圈直徑可達6mm，產生明顯溶解作用。蛋白酶k溶解作用最顯著，溶解圈直徑為10mm。而無菌水對照ck未出現菌絲溶解現象，僅表現出水滴作用的壓痕。說明微白黃鏈霉菌actin-1在蘋果樹腐爛病病原菌菌絲體誘導下合成水解酶以及蛋白酶都參與了溶解病原菌的作用。
(4)微白黃鏈霉菌actin-1粗酶液對蘋果樹腐爛病病原菌孢子萌發的影響
蘋果樹腐爛病病原菌孢子懸液的制備：同步驟(3)；
孢子萌發實驗：取步驟(2)中用基礎液體培養基a培養7天所制備的微白黃鏈霉菌actin-1的粗酶液2ml按照1:4(v/v)的比例與無菌水混合，同時接入100μl上述蘋果樹腐爛病病原菌孢子懸液，以無菌水為對照，30℃避光培養18h后，取50μl萌發懸液在40倍鏡下觀察孢子萌發情況，并按公式計算萌發率及抑制率；
萌發率(％)＝萌發孢子數/總孢子數×100
抑制率(％)＝(對照萌發率-處理萌發率)/對照萌發率×100
結果：基礎液體培養基a培養7天所制備的微白黃鏈霉菌actin-1的粗酶液對蘋果樹腐爛病病原菌的孢子萌發有抑制作用。無菌水對照處理，蘋果樹腐爛病病原菌孢子萌發率為98.60％，而加入微白黃鏈霉菌actin-1粗酶液處理的蘋果樹腐爛病病原菌孢子萌發率僅僅為3.60％，較對照抑制率提高96.35％；
(5)蘋果樹腐爛病病原菌菌絲體添加量對微白黃鏈霉菌actin-1產抑菌活性物質的影響
將基礎液體培養基a中蘋果樹腐爛病病原菌菌絲體量分別設置為5g/l、10g/l、20g/l三個濃度處理，將微白黃鏈霉菌actin-1分別接種到裝有100ml上述三個濃度液體培養的500ml三角瓶中，30℃、160rpm搖床培養7天，發酵液用無菌0.22μm濾膜過濾器過濾獲得無菌濾液。將無菌濾液按照10％(v/v)比例與冷卻至50℃左右的pda培養基進行混合，以10％(v/v)無菌水為對照，制成平板，于平板中央接種6mm蘋果樹腐爛病病原菌菌餅，每種處理3個重復，7天后，計算抑菌率。
抑菌率％＝(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-6mm)
結果：如表4所示不同菌絲體用量時的抑菌率均在培養第7天時最高。分別為52.1％，83.4％和96.7％。隨著菌絲體量增加抑菌率提高。說明菌絲體可誘導微白黃鏈霉菌actin-1抑菌物質的產生。
表4不同菌絲體添加量無菌液抑菌率(％)
結論：以蘋果樹腐爛病病原菌菌絲體為唯一碳源時，可誘導微白黃鏈霉菌actin-1同步合成幾丁質酶、β-1,3-葡聚糖酶、多酚氧化酶以及蛋白酶等真菌細胞壁溶解酶；大大提高了微白黃鏈霉菌actin-1對蘋果樹腐爛病的防治效果；微白黃鏈霉菌actin-1粗酶液對蘋果樹腐爛病病原菌菌絲有溶解作用。以蘋果樹腐爛病病原菌菌絲體為碳源時微白黃鏈霉菌actin-1能產生活性較強的抑菌物質，抑菌率可達96.7％。
可知，在蘋果樹腐爛病病灶處施用微白黃鏈霉菌actin-1生防菌劑時,當蘋果樹腐爛病病原菌菌絲體與微白黃鏈霉菌actin-1接觸，微白黃鏈霉菌actin-1會以其為碳源生長，并誘導合成多種胞外細胞壁水解酶，通過協同酶溶作用是病原菌細胞崩解，同時產生抗菌活性物質對蘋果樹腐爛病菌生長產生抑制作用，兩種機制共同作用組織蘋果樹腐爛病病原菌的繁殖，提高微白黃鏈霉菌actin-1對蘋果樹腐爛病的生防效果。
實施例11實驗室內蘋果樹離體枝條生防實驗
(1)離體枝條實驗方法：
微白黃鏈霉菌actin-1培養濾液的制備方法：
培養濾液制備：接種5％(v/v)微白黃鏈霉菌actin-1孢子懸液，制備方法同實施例2，于盛有50ml高氏一號液體培養基的250ml三角瓶中，30℃、180rpm搖床震蕩培養8天。發酵結束后，先將發酵液4000rpm離心后，上層發酵清液經定性濾紙粗濾，再用裝有直徑為0.45μm濾膜的砂芯過濾器抽濾，最后再用裝有直徑為0.22μm濾膜的無菌細菌濾器過濾，即得到培養濾液，裝入滅菌三角瓶中于4℃冰箱保藏備用。
微白黃鏈霉菌actin-1菌餅和培養濾液對蘋果樹腐爛病的防治效果-離體枝條實驗；
采集試驗田1-2年生富士蘋果枝條，剪取40cm長、粗細一致的枝段，用75％乙醇進行表面消毒，然后用滅菌水沖洗干凈，兩端用濕潤的脫脂棉保濕。用直徑6mm的打孔器燒紅后打孔，每個枝條2個孔，作為接種點：
實驗1(預防保護作用)：向上述接種點接種微白黃鏈霉菌actin-1菌餅，以接種空白培養基pda為陰性對照，兩天后去除菌餅并接種旺盛生長的蘋果樹腐爛病菌菌餅，該處理設為處理1；向上述接種點涂抹培養濾液，以涂抹無菌水作為陰性對照，涂抹0.5g/l的苯醚甲環唑溶液作為陽性對照(向接種孔中先涂抹100μl，室溫晾干，再涂抹100μl，室溫晾干)，晾干后當天接種旺盛生長的蘋果樹腐爛病菌菌餅，該處理設為處理2；每個枝條2個接種點，每處理設置3個重復，每個處理組6個接種點，上述接種點用保鮮膜保濕72h，于25℃恒溫培養箱中培養3-14天，觀察蘋果樹腐爛病的發生情況，測量病斑大小，計算病斑面積和防治效果，見表4。
實驗2(治理作用)：向上述接種點接種旺盛生長的蘋果樹腐爛病菌菌餅，保鮮膜保濕2天后，去掉腐爛病菌菌餅，然后接種微白黃鏈霉菌actin-1菌餅，以接種空白培養基pda為陰性對照，該處理設為處理1；向上述接種點接種旺盛生長的蘋果樹腐爛病菌菌餅，保鮮膜保濕2天后，去掉腐爛病菌菌餅，涂抹培養濾液，以涂抹無菌水作為陰性對照，涂抹0.5g/l的苯醚甲環唑溶液作為陽性對照(向接種孔中先涂抹100μl，室溫晾干，再涂抹100μl，室溫晾干)每個枝條2個接種點，每處理設置3個重復，每個處理6個接種點，。上述接種點用保鮮膜保濕72h，于25℃恒溫培養箱中培養3-14天，觀察蘋果樹腐爛病的發生情況，測量病斑大小，計算病斑面積和防治效果。見表5。
病斑面積＝1/4×π×長徑×短徑
防治效果(％)＝[(對照病斑面積－菌餅面積)－(處理病斑面積－菌餅面積)]/(對照病斑面積－菌餅面積)×100
表4.微白黃鏈霉菌actin-1對離體枝條蘋果樹腐爛病的保護作用
注：同一列數據后標不同小寫字母表示處理間差異達到5％顯著水平；
表5.微白黃鏈霉菌actin-1對離體枝條蘋果樹腐爛病的治療作用
注：同一列數據后標不同小寫字母表示處理間差異達到5％顯著水平；
可以看出，預防保護作用菌餅和培養濾液防效差異不大，均可達95％以上，菌餅防效為95.50％，培養濾液為95.12％。治療效果二者相近，菌餅對蘋果樹腐爛病離體枝條治療效果達86.05％，培養濾液治療效果達83.48％，與化學藥劑苯醚甲環唑效果相當。
實施例12本發明生防菌劑對蘋果樹腐爛病的防治作用-田間實驗
田間試驗設計：共4個處理，取本發明實施例1制備的，按照生防菌劑:凈土(m/m)＝1:1、生防菌劑:凈土(m/m)＝1:5、生防菌劑:凈土(m/m)＝1:10復配，設為處理組；對照組僅僅為凈土。試驗地點在陜西省寶雞市千陽縣陜西楓丹百麗蘋果園進行，試樹品種為5年生“富士”。
(1)通過田間實驗，驗證微白黃鏈霉菌對蘋果樹腐爛病的保護和治療效果
預防保護作用：5年生，長勢相近的富士蘋果樹，主枝上用6mm打孔器打孔造成新鮮傷口2cm2，將以上4種處理微白黃鏈霉菌actin-1生防菌劑用適量水和成泥狀，貼到傷口出處，菌泥的厚度為1.5cm左右，用保鮮膜包裹保濕，3天后，接種旺盛生長的蘋果樹腐爛病菌餅，用保鮮膜包裹保濕，7天后，除去保鮮膜。每處理3個重復，每重復6棵樹。4周后觀測腐爛病的發病情況，計算發病率、病斑面積和防治效果；結果如表6。
治療作用：5年生、長勢相近的富士蘋果樹，主枝上用6mm打孔器打孔造成新鮮傷口2cm2，接種旺盛生長的蘋果樹腐爛病菌餅，用保鮮膜包裹保濕，3天后，去除腐爛病病原菌菌餅，將以上4種處理的微白黃鏈霉菌actin-1生防菌劑用適量水和成泥狀，貼到傷口出處菌泥的厚度為1.5cm左右，用保鮮膜包裹保濕，7天后，除去保鮮膜。每處理3個重復，每重復6棵樹。4周后觀測腐爛病的發病情況，計算發病率、病斑面積和治療效果；結果如表7。
發病率(％)＝病株樹/總株數
病斑面積＝1/4×π×長徑×短徑
防治效果(％)＝[(對照病斑面積－菌餅面積)－(處理病斑面積－菌餅面積)]/(對照病斑面積－菌餅面積)×100
表6田間微白黃鏈霉菌對蘋果樹腐爛病的保護作用
注：同一列數據后標不同小寫字母表示處理間差異達到5％顯著水平；
表7田間微白黃鏈霉菌對蘋果樹腐爛病的治療作用
注：同一列數據后標不同小寫字母表示處理間差異達到5％顯著水平；
田間保護效果顯示，微白黃鏈霉菌actin-1生防菌劑與凈土以比例1：1和1:5混合作用時，只有一棵樹染病，預防效果顯著，當比例為1:10時，病株樹增加1棵，效果也較好。治療效果顯示，微白黃鏈霉菌actin-1生防菌劑與凈土以比例1：1和1:5混合作用時，蘋果樹發病率為16.67％，防治效果分別達87.80％和87.60％，治療果顯著，當比例為1:10時，防治效果略低，但是也達到95.23％，于對照相比，效果顯著；說明微白黃鏈霉菌actin-1可有效抑制腐爛病菌的侵入和擴展，對蘋果樹腐爛病田間防治作用極為明顯。
需要說明的是本發明實施例2-6所制備的生防菌劑同樣具有上述效果，各實施例之間效果差異性不大。
實施例13通過田間實驗微白黃鏈霉菌對蘋果樹腐爛病病斑的愈合效果
田間腐爛病樹病斑的刮除治療實驗：將病斑部位及其周圍1cm健康部位用刮刀刮至韌皮部，然后將實施例1制備的生防菌劑與凈土1:1混合均勻，用水和成泥狀，貼到腐爛病疤處，菌泥的厚度為1.5cm，后裹上黑色塑料薄膜保濕，3棵/組，共9棵，同時以凈土和泥作為對照，3棵/組，共9棵，開始每個月進行一次調查，后期半年或一年進行一次調查。記錄病斑復發情況并測量愈傷組織的寬度，計算防治效果，結果見表8。
防治效果(％)＝(對照復發率-處理復發率)/對照復發率×100
半年后觀察18塊病斑，對照組9塊全部復發，且病斑面積隨時間延長增大，處理組沒有復發病斑，防效達100％。處理組平均傷組織寬6.36cm，兩年后愈傷組織寬10.23cm，四年后，愈傷組織17.3cm，且沒有復發，見圖3；說明微白黃鏈霉菌actin-1生防菌劑對蘋果樹腐爛病的治療效果有效且持久；
表8微白黃鏈霉菌對田間蘋果樹腐爛病病斑的愈傷效果
注：同一列數據后標不同小寫字母表示處理間差異達到5％顯著水平；
需要說明的是本發明實施例2-6所制備的生防菌劑同樣具有上述效果，各實施例之間效果差異性不大。
實施例14微白黃鏈霉菌actin-1定殖能力檢測
將實施例13處理組的9棵蘋果樹半年后愈傷組織邊緣皮剝取下來，帶回實驗室保濕，分離培養，結果9株樹上均分離到streptomycesalbidoflavusactin-1，說明該菌可以定殖于蘋果樹干，且定殖率很高，能長期發揮防治作用。
具體操作如下：取回的蘋果樹腐爛病愈傷組織樹皮用自來水沖洗干凈，剪成0.25cm2小塊，置于75％酒精中浸泡30s，再用4％次氯酸鈉表面消毒3.5min后，放入滅菌水中沖洗4次，每次至少1min，用滅菌濾紙吸干多余水分后，每4個小塊用滅菌研磨器研磨，再用無菌水稀釋涂布于高氏一號瓊脂培養基中，每個組織3個重復，30℃培養3-10天。以最后一次沖洗的滅菌水涂布于高氏一號培養基上，驗證組織表面消毒情況。
結果：9棵蘋果樹均分離到鏈霉菌，將對分離得到的鏈霉菌進行形態學和分子鑒定，并與streptomycesalbidoflavusactin-1進行序列比對，最終得到的鏈霉菌與actin-1序列同源性均為100％，可知，分離得到的鏈霉菌是微白黃鏈霉菌actin-1。
可知，本發明所用微白黃鏈霉菌不僅實驗室內對蘋果樹腐爛病防治效果較好，田間防治效果及愈傷效果均較為理想，可應用于腐爛病多發的地區蘋果果園。
需要說明的是本發明實施例2-6所制備的生防菌劑同樣具有上述效果，各實施例之間效果差異性不大。
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