一、技術領域
本發明屬于病蟲害防治技術領域，具體涉及一種利用醋酸棉酚去除番茄植株中番茄黃化曲葉病毒的方法。
二、技術背景
番茄黃化曲葉病毒(tomatoyellowleafcurlvirus，tylcv)屬雙生病毒科(geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(begomovirus)病毒，為單鏈環狀dna病毒，是煙粉虱傳播的最重要的植物病毒。煙粉虱入侵性強，在世界各地現已普遍發生，也因此帶來番茄黃化曲葉病毒病在亞洲、非洲、美洲等地區多個國家的流行，在我國番茄黃化曲葉病已蔓延到江蘇、浙江、云南等大多數省份，造成番茄大面積減產和品質下降。除危害番茄外，番茄黃化曲葉病毒還侵染辣椒、煙草和南瓜等多種植物。
對于植物體對番茄黃化曲葉病的防控，主要采取利用抗病蟲品種、通過化學或物理手段控制煙粉虱數量、用病毒拮抗劑控制病毒等手段，而關于病毒拮抗劑，通常通過抑制病毒侵染、抑制病毒增殖和轉運、抑制病毒癥狀表達、誘導植物抗病性等達到控制病毒病的目的，對于植物體內已經存在的病毒如何清除，尚未見相關研究報道。
棉酚(gossypol)是錦葵科植物草棉、樹棉或陸地棉成熟種子、根皮等中提取的一種多元酚類物質，為棉屬植物體內所特有的次生物質。已發現棉酚與棉花抗蟲特性有關聯，還發現棉酚在醫學上具有抗癌、避孕和抗病毒等作用。棉酚是否可以清除植物體內的病毒？國內外還未見研究報道。研究棉酚對番茄植株中番茄黃化曲葉病毒的影響，以期望發掘一種對植物體內病毒進行有效去除的活性物質，從而能實現病毒病的治療，在植物病毒病防控方面發揮作用。
三、
技術實現要素：
1、發明目的
提供一種理想的番茄植株中番茄黃化曲葉病毒去除方法，能安全去除部分番茄植株內番茄黃化曲葉病毒，也可降低一些番茄植株中植物病毒的含量，此將為番茄黃化曲葉病的治療打開了通道。
2、技術方案
本發明為一種番茄植株中植物病毒的去除方法，其特征在于利用醋酸棉酚去除番茄植株中番茄黃化曲葉病毒的方法。
3、有益效果
本發明的方法與現有技術相比，產生以下有益效果：(1)與常規的病毒拮抗劑通過抑制病毒增殖等控制番茄黃化曲葉病相比，本發明通過有效去除番茄植株中植物病毒來控制病毒病，可實現病毒病的直接治療；(2)與化學藥劑防治病毒病相比，本發明利用醋酸棉酚進行控制，可切實提高病毒病控制的無公害控制水平，有效減少環境污染。
四、具體實施方式
本發明的實施例是采用室內測定的方法。
測定方法如下：
1、番茄植株上接種病毒
帶毒煙粉虱接入健康番茄植株苗，每10盆即10株苗為一個重復(放在同一養蟲籠內)，接入剛羽化且攜帶番茄黃化曲葉病毒的煙粉虱30頭，在接蟲7天后，將煙粉虱移出，番茄植株用于后面的處理。
2、醋酸棉酚處理番茄苗
灌根處理經煙粉虱傳毒的番茄苗，處理分3種，分別為200mg/l醋酸棉酚處理、發病清水對照(即接入帶毒煙粉虱)和未發病清水對照(即未接入帶毒煙粉虱發病)，每株苗灌根處理用20ml藥液或清水。灌根處理后，將苗放在養蟲籠中，相同處理每10株(盆)苗放一養蟲籠。每處理重復4組共40株苗，每株苗均進行編號。番茄苗用于觀察生長和發病狀況以及病毒的定性和定量檢測。實驗在放有植物生長燈的室內進行，溫度為27℃，每天光照時間為14h。
3、番茄植株dna的提取
分別在處理前、處理后不同時間進行取樣，每次每處理取每株上部葉片各一片，放入冰箱-20℃內，用于番茄黃化曲葉病毒的檢測。病毒的定性分析樣品按單株葉片單獨進行dna提取，在處理后一個月和兩個月分別取樣；定量檢測按每重復即10株為一組進行dna提取，分別在處理后6周和10周進行取樣。
dna提取：在1.5ml的離心管中加入樣品和20μl的dna堿裂解液(50mmol/ltris-hcl(ph8.0)，20mmol/lnacl，1mmol/ledta，1％sds)，充分研磨。加1μl蛋白酶k(20mg/ml)，離心30秒，60℃水浴1小時，追加1μl蛋白酶k，離心30s，繼續水浴2小時，加178μl的雙蒸水，100℃水浴5min，滅活蛋白酶k。取100μl提取液于另一離心管中，加2倍體積的預冷無水乙醇，充分混勻，4℃冰箱沉淀過夜后4℃13000rpm離心10分鐘，倒出乙醇，晾干后加20μl的雙蒸水溶解dna，-20℃保存。
4、番茄植株中番茄黃化曲葉病毒的定性檢測
定性檢測番茄黃化曲葉病毒的特異性引物為：
tv_p833(5’-ggtctacacgcttacgccttatt-3’)
paty_r(5’-ttccatccgaacattcaggcagc-3’)
擴增片段大約為800bp左右。pcr的反應體系為10μl，包含5μlmix(100mmkcl，20mmtris-hcl，3mmmgcl2，400μmdntps，溴酚藍)，0.2μltaq酶(5u/μl)，0.5μl引物tv_p833，0.5μl引物paty_r，3.2μlh2o，0.6μldna模板。pcr參數為：95℃預變性5min，94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環，循環結束后72℃延伸20min。pcr產物進行電泳和克隆測序，明確其病毒種類。記錄各處理攜帶病毒的番茄植株數，計算病毒攜帶率。
5、番茄植株中番茄黃化曲葉病毒的定量檢測
番茄黃化曲葉病毒基因組1462(+)至1601(-)片段的拷貝數通過abistepone熒光定量pcr儀來測定，用于擴增番茄黃化曲葉病毒基因組1462(+)至1601(-)片段的引物為：
(yg3)5’-gagttcccctgtgcgtgaa-3’
(yg5)5’-ctgttcgcaagtatcaatcaaggt-3’
反應體系為：
擴增程序：52℃2min，95℃1min，40個循環：95℃r5s，60℃30s，72℃。
6、數據分析
用統計分析軟件spss17.0對番茄植株中番茄黃化曲葉病毒感染率和含量均采用t檢驗法進行處理與對照間的差異顯著性分析。
五、實施效果：
1、醋酸棉酚對番茄植株內番茄黃化曲葉病毒感染率的影響
對醋酸棉酚處理番茄植株中番茄黃化曲葉病毒感染率的分析表明，在處理前，醋酸棉酚和對照組番茄苗的番茄黃化曲葉病毒感染率分別為92.5％和90％，無顯著差異(t＝0.40，p＝0.7049)；處理一個月后，醋酸棉酚和對照組番茄黃化曲葉病毒感染率分別為75％和87.5％，處理組也未顯著高于對照組(t＝1.56，p＝0.1708)；處理兩個月后，處理組病毒感染率進一步下降，醋酸棉酚處理組感染率為52.5％，而此時對照組番茄黃化曲葉病毒感染率高達97.5％，處理組顯著低于對照組(t＝12.73，p＜0.0001)，表明醋酸棉酚處理有效去除了部分番茄植株內番茄黃化曲葉病毒。
2、醋酸棉酚對番茄植株中番茄黃化曲葉病毒含量的影響
對醋酸棉酚處理番茄植株中番茄黃化曲葉病毒含量的分析表明，處理6周后，棉酚處理組番茄植株內番茄黃化曲葉病毒含量顯著低于對照組(t＝4.331，p＝0.0049)；處理10周后，病毒量仍顯著低于對照(t＝3.4654，p＝0.0257)，表明醋酸棉酚處理有效降低了番茄植株內番茄黃化曲葉病毒的含量。