一種研究獨角金內酯調控油菜根系生長的方法與流程

本發明屬于農業生物技術領域，更具體涉及一種研究獨角金內酯調控油菜根系生長的方法，優化油菜種子萌發條件，通過分析不同濃度獨腳金內酯對油菜根系生長的影響，篩選出最適合的處理濃度，以此處理不同來源的自然群體種子，篩選根系生長對獨腳金內酯敏感和不敏感的突變體。該發明首次研究了獨腳金內酯對油菜生長的影響，為植物激素敏感差異材料的篩選提供了技術和方法參考。

背景技術：

作物產量生理是通過兩個生理過程形成的，即吸收作用和光合作用(劉曉冰等，2010)。作物地上部有效分枝、葉片等形成冠層，影響光能的吸收和同化物的分配(hammeretal.,2009；brunel-muguetetal.,2013)；根系是土壤系統最重要的生物學成分，是影響產量形成的重要器官，根系形態決定植株獲取土壤資源的能力。作物群體要維持地上莖、葉、花、果等器官所需要的水分和養分，必須有強大的根系和龐大的吸收面積(楊建昌，2011)。油菜是我國主要的油料作物，冬前營養體的生長對春后產量緊密相關。本專利的目標是(1)獲得新材料用于高產機理和育種研究；(2)獲得加速油菜苗期營養體生長，特別是形成發達的根系，促進油菜高產的研究方法。

植物激素具有用量少，見效快的特點，對植株生長發育、器官建成、產量形成等具有重要的作用。獨角金內酯(strigolactones,sls)是一種產生于植物根部的類胡蘿卜素衍生物,具有刺激寄生植物種子萌發和促進叢枝菌根真菌菌絲分枝的作用(xieetal.,2010；fooandreid,2013)。科學家通過對擬南芥和水稻等模式植物的研究，發現獨角金內酯通過抑制側芽的生長在株型建成中發揮關鍵調控作用(gemez-roldanetal.,2008；elizabethetal.,2009；jiaoetal.,2010)，獨角金內酯也調控根系發育和構型(kapulniketal.,2014)，通過信號轉導協調地上和地下部植株生長(koltai2011；koltaiandbeveridge,2013)。

前期研究存在兩個問題：其一，與水稻、擬南芥等模式植物相比，油菜是異源四倍體，得到突變體比較困難；其二，國內外缺乏獨腳金內酯調控油菜生長的技術資料，尚沒有和本專利相似的創造突變體的技術或文獻。本團隊成員經過4年的研究，獲得了獨腳金內酯調控油菜生長的技術資料，優化了水培條件下油菜根系生長對獨角金內酯響應的最適合濃度，并篩選了遺傳背景豐富的油菜自然群體，獲得了突變體材料，所以，該技術具有獨創性，先進性，為后續遺傳學、生理學、分子生物學研究提供了材料基礎，也為作物新材料選育提供了新途徑。

技術實現要素：

本發明的目的是在于提供了一種研究獨角金內酯調控油菜根系生長的方法，方法易行，操作簡便，包括油菜種子前處理，霍格蘭營養液培養條件的優化，獨腳金內酯對油菜生長特性影響分析，濃度優化，根系生長敏感和不敏感材料的篩選。和土壤栽培相比，水培方法更方便研究植株的形態，特別是對根系無損傷，可進行掃描分析其生長動態，利用該技術篩選出根系生長對獨角金內酯敏感性不同的材料，為后續生理生化、分子生物學和育種學研究奠定了基礎。

為了實現上述的目的，本發明通過以下技術方案來實現：

其技術構思是：具體操作分三步：水培條件和獨腳金內酯濃度優化，篩選根系生長對獨腳金內酯不敏感材料，新材料驗證。每一過程都有清楚詳細的步驟，提高了篩選效率和成功率。

一種研究獨角金內酯調控油菜根系生長的方法，其步驟是：

(1)水培條件和獨腳金內酯濃度優化：

a：選用中雙11和中油雜12油菜種子，在70％(體積比，以下相同)乙醇中浸泡10－15分鐘后用蒸餾水沖洗5－7次；

b：種子均勻擺放在鋪有2－3層濕濾紙的培養皿上，于22℃恒溫生長箱中催芽2－3天，設置16小時光照，8小時黑暗處理，保持濾紙濕潤；

c：取直徑約10厘米的塑料杯裝滿蒸餾水，杯口覆蓋、固定紗布并浸濕在水中，在紗布上均勻擺放催芽后的油菜籽，每個塑料杯擺放約50粒，3天后當下胚軸長約2厘米時，取生長整齊的菜苗固定在泡沫板上，每板24株苗，種植3盆即3次重復，于1/2霍格蘭營養液中培養15天左右，每5－7天更換一次營養液；

d：配制0－18μm共7個濃度獨腳金內酯溶液，油菜處理7天，每天取3株樣品測定植株干鮮重，用根系掃描儀掃描根系生長指標，如側根數目，側根長度、根系表面積和體積,掃描儀型號為winrhizo2009software(regentcompany,canada)；

(2)根系生長對獨角金內酯不敏感材料篩選：

a：300份油菜自然群體材料種子分別消毒、催芽，3天后每份材料種植6盆，每盆24株，在1/2霍格蘭營養液中培養15天；

b：配制濃度為0.1-0.2μm獨腳金內酯溶液，每份材料均在0μm和0.1-0.2μm獨腳金內酯中生長，6盆材料分為2組，每組3盆(3個重復)；

c：由于生長7天后植株形態差異最大，每個重復取10株，測定根系形態指標，地上部和根系干鮮重，根據0.1－0.2μm獨腳金內酯和0μm(對照)處理組指標的差值確定對獨腳金內酯敏感植株。

(3)根系生長差異材料的驗證：

選取兩種處理下根系差異最明顯和無差異材料各5-10份，用相同的處理進一步驗證，選取極端材料。配制組合和f2群體，進行遺傳學和育種學研究。該技術為新材料的選育提供了技術參考，也為植物激素調控研究建立了可靠的試驗方法。

所述的獨腳金內酯(strigolactone,sl)最初是從棉花中分離鑒定出的獨腳金(strigaspp.)種子萌發的信號物質。

本發明闡明了不同濃度獨腳金內酯對油菜生長特別是根系形態的影響；優選出調控油菜根系生長的最適濃度；篩選出對獨腳金內酯極度敏感和不敏感的油菜材料。

本技術發明，與土壤培養相比，能實現植株生長的實時監控和觀察，特別是結合根系掃描技術，獲得油菜根系形態指標數據；采用該技術實現植株生長條件精細調控，植株生長整齊，減少試驗誤差和工作量，準確篩選到根系生長差異材料。

本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果：

(1)本發明中油菜水培方法和激素處理方法是本人及研究團隊近年來的研究結果，有別于土培等試驗方法，具有穩定性好，便于操作等特點，便于觀察根系和地上部植株的生長，植物激素處理后易于吸收，減少試驗誤差。

(2)本發明中的獨角金內酯為近年來的研究熱點，油菜是異源四倍體，與水稻、擬南芥等模式植物相比難以獲得突變體，本發明獲得材料可用于進行后續遺傳學、育種學研究，發展了植物激素調控作物生長理論研究成果。

(3)獨腳金內酯能抑制擬南芥根系生長，本研究結果與之相反，顯示能促進油菜生長，增加根尖數、根系長度等指標，因此，本發明具有創新性，其促進增加綠色營養體生長的效果有助于在生產上提高春后油菜產量，因此為油菜高產栽培提供了理論依據和技術支撐。

附圖說明

圖1為獨腳金內酯對油菜根系生長的影響示意圖。

圖1a中雙11用0，1.8μm獨腳金內酯處理7天后根系情況。左，0μm對照處理，右，1.8μm獨腳金內酯處理。

圖1b中雙11和中油雜12用0，1.8μm獨腳金內酯處理7天后植株生長情況對比。表明sls促進葉片和根系生長。左上，中雙11號對照處理，右上，中雙11號sls處理；左下，中油雜12對照處理，右下，中油雜12sls處理。

圖2為不同濃度sls處理油菜根尖數和根系長度示意圖。

圖2a0－18μm7種濃度獨腳金內酯處理后油菜根系長度。sls處理增加了根系長度，特別是0.018－1.8μm范圍內根系長度顯著增加，18μm抑制根系生長，但根系長度和數目仍高于對照。圖2b0-18μm7種濃度獨腳金內酯處理后根尖數目變化趨勢與根系長度相似。

圖3為不同濃度sls處理后油菜地上和地下部分干鮮重示意圖。

圖3a是不同濃度下地下部干重；圖3b是地上部干重；圖3c為根冠比。各指標干重都隨著獨角金內酯濃度增加而增加，在0.018－1.8μm范圍內達到顯著水平，根冠比顯著增加表明獨角金內酯對根系的影響大于地上部。

圖4為油菜自然群體材料苗期試驗生長情況示意圖。

具體實施方式

本發明所用獨角金內酯為gr24，是一種以在獨腳金內酯strigol為框架的基礎上人工合成的化學物質，獨腳金內酯類似物中最有效的一個產品。本發明建立了水培方法研究外源植物激素調控油菜生長的實驗技術，闡明了獨腳金內酯對油菜根系生長的影響，優化了最適濃度，通過對油菜自然群體進行處理，篩選到不同遺傳背景下根系生長對獨腳金內酯敏感性具有差異的材料。

實施例1：

一種研究獨角金內酯調控油菜根系生長的方法，其步驟是：

(1)水培條件和獨腳金內酯濃度優化：

a：選用中雙11和中油雜12油菜種子，在70％(體積比)乙醇中浸泡10分鐘后用蒸餾水沖洗6次；

b：種子均勻擺放在鋪有3層濕濾紙的培養皿上，于22℃恒溫生長箱中催芽2或3天，設置16小時光照，8小時黑暗處理，保持濾紙濕潤；

c：取若干個直徑約10厘米的塑料杯裝滿蒸餾水，杯口覆蓋、固定紗布并浸濕在水中，在紗布上均勻擺放催芽后的油菜籽，3天后當下胚軸長約2厘米時，取生長整齊的菜苗固定在泡沫板上，每板24株苗，種植3盆即3次重復，于1/2霍格蘭營養液中培養15天左右，每5或6或7天更換一次營養液；

d：配制0和0.00018μm和0.0018μm和0.018μm和0.18μm和1.8μm和18μm，共7個濃度獨腳金內酯溶液，0表示常規1/2霍格蘭營養液處理。油菜處理7天，每天取3株樣品測定植株干鮮重，用根系掃描儀掃描根系生長指標，如側根數目，側根長度、根系表面積和體積,掃描儀型號為winrhizo2009software(regentcompany,canada)(圖1-圖3)；本發明中獲得了對根系生長影響最大的濃度0.18μm。

(2)根系生長對獨角金內酯不敏感材料篩選：

a：300份油菜自然群體材料種子分別消毒、催芽，3天后每份材料種植6盆，每盆24株，在1/2霍格蘭營養液中培養15天；

b：配制濃度為0.1μm或0.2μm獨腳金內酯溶液，每份材料均在0μm和0.2μm獨腳金內酯中生長，6盆材料分為2組，每組3盆(3個重復)；

c：由于生長7天后植株形態差異最大，每個重復取10株，測定根系形態指標，地上部和根系干鮮重，根據0.1或0.2μm獨腳金內酯和0μm(對照)處理組指標的差值確定對獨腳金內酯敏感植株(圖4)。

(3)根系生長差異材料的驗證：

選取兩種處理下根系差異最明顯和無差異材料各5份或8份或10份，用相同的處理進一步驗證，選取極端材料。配制f1組合和f2群體，進行遺傳學和育種學研究。

本發明與土壤培養相比，能實現植株生長的實時監控和觀察，特別是結合根系掃描技術，獲得油菜根系形態指標數據；采用該技術植株生長整齊，減少試驗誤差，準確篩選到根系生長差異材料。