本發明涉及中藥資源開發利用技術領域，具體來說是一種利用暗紫貝母愈傷組織生產暗紫貝母總生物堿的方法。
背景技術：
暗紫貝母（fritillariaunibracteatahsiaoetk.c.hsia）系百合科多年生草本植物，是名貴藥材川貝母的主要基原植物之一。目前，以暗紫貝母干燥鱗莖為主要來源的川貝母是貝母中的佳品，習稱“松貝”，具有清熱潤肺、化痰止咳的功效，是治療咳嗽的重要良藥。暗紫貝母在自然環境中生長緩慢，周期長，從種子萌發到長成藥材，需要4-5年的時間，遠不能滿足市場需求，由于長期采挖，野生資源極度匱乏，面臨枯竭。為了解決暗紫貝母資源緊缺問題，有大量研究集中于暗紫貝母組培快繁培養方面，期望通過鱗莖再生來增加種苗資源，實現規模化人工栽培，這在一定程度上縮短了生產周期，但面臨許多問題，如組培苗馴化成功率不高，且種植區域受限等。隨著貝母生物堿成分研究的不斷發展，直接從貝母組培鱗莖或組培物中提取生物堿更具有優勢，可以在短期內繁殖大量材料來供提取生物堿，且不受時間和區域限制。
申請號為“200910164379.9”的中國發明專利公開了一種采用細胞團塊懸浮培養生產川貝母總生物堿的方法，該方法是將愈傷組織打碎后進行培養生產川貝母，屬于發酵工程范疇，存在著培養復雜，過程不容易控制的問題。并且，暗紫貝母與川貝母生物堿成分在質與量上存在一定的差異，對暗紫貝母生物堿進行組培生產研究具有重要意義，但目前未見相關利用暗紫貝母來生產貝母總生物堿的方法。
技術實現要素：
本發明的目的是針對上述技術存在的問題，提供一種利用暗紫貝母愈傷組織生產暗紫貝母總生物堿的方法，本發明方法利用愈傷組織來制備貝母總生物堿，其具有生產周期短、操作簡單的特點。
為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種利用暗紫貝母愈傷組織制制備暗紫貝母總生物堿的方法，步驟包括：
（1）愈傷組織的誘導：以實驗室通過組織培養生產的鱗莖為外植體，選取幼嫩的鱗瓣片切成0.5cm的小塊，接種于ms+naa1-2mg/l+6-ba0.5-1mg/l+2,4-d1-1.5mg/l+瓊脂5g/l+蔗糖30g/l的培養基上，控制ph為5.8、培養室溫度為23±1℃、空氣相對濕度50%-60%、光照時間12小時/天、光照強度2000l條件下誘導培養30-35天獲得到大量愈傷組織；
（2）增殖與生物堿積累培養：將步驟（1）中產生的愈傷組織切成0.8×0.8cm，接種至培養基ms+zt1.5-3mg/l+naa0-0.2mg/l+瓊脂4.5g/l+蔗糖30g/l的培養基中，控制培養溫度23±1℃、空氣相對濕度50%-60%、光照時間12小時/天、光照強度2000l條件下培養30-35d后獲得生物堿含量高的培養物；
（3）貝母生物堿含量測定：收集步驟（2）培養后的愈傷組織，置于干燥的濾紙上吸收水分，并放入烘箱中40℃烘干至恒重，以西貝母堿為對照，提取暗紫貝母生物堿，并檢測其含量。
本發明中，提取暗紫貝母的提取方法采用《中國藥典》（2005版）的操作方法。
本發明方法還提供一種利用上述方法制備的暗紫貝母總生物堿。對于本領域技術人員來說，利用本發明方法制備的暗紫貝母總生物堿在生物制藥領域中的應用也屬于本發明的保護范圍。
本發明的有益技術效果是：本發明利用暗紫貝母作為貝母總生物堿的提取原料，其愈傷組織具有繁殖快、增殖率高的特點，通過激素調控次生代謝產物積累，達到了快速生產暗紫貝母總生物堿的目的，其培養后的愈傷組織中西貝母堿百分含量高達0.32%，是藥典中規定的藥材標準含量的6倍多。本發明方法操作簡單，貝母總生物堿產量高，適合工業生產應用。
具體實施方式
下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
實施例1
一種利用暗紫貝母愈傷組織制制備暗紫貝母總生物堿的方法，步驟包括：
（1）愈傷組織的誘導：以實驗室通過組織培養生產的鱗莖為外植體，選取幼嫩的鱗瓣片切成0.5cm的小塊，接種于ms+naa1-2mg/l+6-ba0.5-1mg/l+2,4-d1-1.5mg/l+瓊脂5g/l+蔗糖30g/l的培養基上，控制ph為5.8、培養室溫度為23±1℃、空氣相對濕度50%-60%、光照時間12小時/天、光照強度2000l條件下誘導培養30-35天獲得到大量愈傷組織；
（2）增殖與生物堿積累培養：將步驟（1）中產生的愈傷組織切成0.8×0.8cm，接種至培養基ms+zt1.5-3mg/l+naa0-0.2mg/l+瓊脂4.5g/l+蔗糖30g/l的培養基中，控制培養溫度23±1℃、空氣相對濕度50%-60%、光照時間12小時/天、光照強度2000l條件下培養30-35d后獲得生物堿含量高的培養物；
（3）貝母生物堿含量測定：收集步驟（2）培養后的愈傷組織，置于干燥的濾紙上吸收水分，并放入烘箱中40℃烘干至恒重，磨成粉末過3號篩，取2g粉末加入40ml的三氯甲烷-甲醇（4:1）溶液進行貝母生物堿的提取，過濾去渣定容至50ml。取2-5ml溶液，蒸干，加10ml三氯甲烷溶液，溶解待測。以西貝母堿為對照品（對照品溶液0.2mg/ml），制作標準曲線，通過紫外分光光度計依法測定供試品吸光度，并從標準曲線上讀出樣品的含量，計算即得（《中國藥典》2,015）。測得步驟（2）培養后的愈傷組織中西貝母堿百分含量高達0.32%，是藥典中規定的藥材標準含量的6倍多。
以上實施例僅用以說明而非限制本發明的技術方案，盡管參照上述實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應該理解：依然可以對本發明進行修改或者等同替換，而不脫離本發明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。