本發明涉及組織細胞培養技術領域，具體涉及一種細胞凍存液及其制備方法和應用。
背景技術：
干細胞(stemcell)是一類具有自我復制能力的多潛能細胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。根據干細胞所處的發育階段分為胚胎干細胞和成體干細胞。根據干細胞的發育潛能分為三類：全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞(專能干細胞)。干細胞是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫學界稱為“萬用細胞”。在腦、脊髓等所有神經組織中，不同的神經干細胞類型產生的子代細胞種類不同，分布也不同。雖然該細胞利用廣泛，但要廣泛地應用于臨床治療領域，其來源和數量仍遠遠不能滿足需求。因此神經干細胞的體外大規模擴增，以及將擴增后的細胞進行冷凍保存，是本領域技術人員迫切的需求。
白血病是危害人類的重要的腫瘤之一，在白血病治療和研究中，對于白血病干細胞的瞬時需求量很大，而傳統的分離方法不可能馬上獲得，因此，批量貯存，一起取出應用是必要的，但是常規的貯存方法效果不好，而冷凍的方法卻有很大的局限性。這是因為細胞凍存的過程會顯著改變細胞的熱力學、化學和物理環境，同時伴隨生物性損傷的危險。影響凍存效率的因素主要有：細胞濃度、冷凍速率以及凍存液。目前，干細胞凍存使用的凍存液有含血清和無血清的兩類，由于血清具有成分復雜、質量不穩定、價格昂貴等缺點，無血清凍存和復蘇技術成為發展趨勢。低溫保存干細胞主要依靠抗凍液二甲基亞砜(dmso)和血清的保護。常用到的細胞保護劑還有羥乙基淀粉0es)、聚乙二醇(peg)等。但是，dmso會對細胞產生毒性作用，對凍存的干細胞造成不可逆的損傷。為獲得來源方便的干細胞，開展有效的干細胞凍存方法是本領域迫切的需求，建立一種長期低溫保存干細胞的方法對于促進神經干細胞的研宄和應用具有重大意義。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題是提供一種細胞冷凍保存液以及相應的制備方法及使用方法。
本發明的技術方案如下：
一種細胞冷凍保存液，其特征在于由如下各組分組成：其特征是冷凍存液中含有:二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多肽的序列如seqidno：1-16任一所示。所述多肽有申請人通過前期的大量的基因庫篩選得到，所述多肽具有保護細胞免受損傷的功能。其名稱及序列如下：bx-1、bx-3、bx-4、bx-6、bx-7、bx-9、bx-11、bx-12、bx-14、bx-15、bx-17、bx-19、bx-22、bx-23、bx-25；其依次對應于seqidno：1-15。
在本發明的細胞的凍存液中，海藻糖以及維生素e和多肽具有明確的抵御外來傷害對細胞的損傷，特別是多肽，還具有保護細胞免受凍存時冰結晶對細胞的損傷。
本發明還提供了一種細胞的凍存液的制備方法，即將所述各組分混合搖勻即成。
本發明還提供了一種神經細胞凍存方法，包括以下步驟:
a.凍存液制備:制備所述的細胞凍存液，將各組分按照常規的操作方法將各組分按照相應的比例混合即可獲得；
b.細胞懸液制備:培養生長成單層的神經細胞一瓶，0.20％胰蛋白酶液消化4分鐘，棄胰酶液，加入dmem培養液15ml，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，離心4000轉/分，棄上清，加入步驟a凍存液2ml，混均，置入無菌的凍存管內；
c.冷凍:先將凍存管在4℃下凍存30min，然后放入-30℃凍存lh，再放入-80℃凍存3h，最后移入液氮中保存；
d.細胞復蘇:取出凍存管快速置于37℃水浴，震蕩直至細胞懸液完全融化，然后用5倍dmem液稀釋，1000r/min離心5min,離心去除上清液,再重復3次。所述細胞懸浮濃度為108細胞/ml-1010細胞/ml。
本發明的有益效果:
本發明的細胞凍存液，復蘇細胞存活率可達99％以上，較使用常規細胞凍存液的復蘇存活率有了顯著提高，基本上沒有細胞的損耗。
本發明的干細胞凍存液可以長期保存干細胞，細胞活性不發生變化，保證了細胞生物學活性。
本發明神經細胞凍存方法，操作簡單可行，價格適宜，具有較好的實用價值。
具體實施方式
實施例1細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：1所示。
實施例2細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：2所示。
實施例3細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：3所示。
實施例4細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：4所示。
實施例5細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：5所示。
實施例6細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：6所示。
實施例7細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：7所示。
實施例8細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：8所示。
實施例9細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：9所示。
實施例10細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：10所示。
實施例11細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：11所示。
實施例12細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：12所示。
實施例13細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：13所示。
實施例14細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：14所示。
實施例15細胞凍存液的制備
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：15所示。
比較例1
分別量取70ml的mem細胞培養液、20ml的小牛血清、i0ml的二甲基亞砜，混合制得常規細胞凍存液。
比較例2
將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。
實施例16凍存液的效果驗證
以上實施例1-15及比較例1-2所制備的細胞凍存液，分別按照下述方法進行細胞凍存和復蘇實驗。
細胞凍存過程:
培養生長成單層的人白血病干細胞，其細胞密度約6*109個/ml，加入ph7.0的pbs洗細胞表面一次。
將細胞用0.20％胰蛋白酶液消化4分鐘，棄胰酶液，加入dmem培養液15ml，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，離心4000轉/分，棄上清，加入實施例1-3和比較例1所制備的凍存液2ml，混均，置入無菌的凍存管內；
冷凍:先將凍存管在4℃下凍存30min，然后放入-30℃凍存lh，再放入-80℃凍存3h，最后移入液氮中保存；分別凍存1周，4個月，8個月。每組3個重復。
細胞復蘇:取出凍存管快速置于37℃水浴，震蕩直至細胞懸液完全融化，然后用5倍dmem液稀釋，1000r/min離心5min,離心去除上清液,再重復3次，計算細胞存活率。結果如下：
取8個月的凍存細胞，進行細胞分化培養，其中所述的細胞能夠正常進行分化，分化效率達到91.3％，而比較例1取出的細胞其分化率只能達到59.2％,說明細胞活性受到到很大的影響。
序列表
〈110〉潘時輝
〈120〉一種用于白血病治療的細胞凍存液
〈160〉15
〈210〉1
〈211〉19
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-1
wrfhsswrkmghylhddwk
〈210〉2
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-3
psewwqyfgrkpygllgg
〈210〉3
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-4
dkgqpkiekgwreksas
〈210〉4
〈211〉19
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-6
mdmdkqewrwwseqcyysg
〈210〉5
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-7
wwqrhlvwspwhaltfcp
〈210〉6
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-9
gamqmasdmsqlqwdaa
〈210〉7
〈211〉19
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-11
vfmtpakwcentwhppqrn
〈210〉8
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-12
lgmithpisldmipsgkg
〈210〉9
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-14
qgmwgsgshkfitktdq
〈210〉10
〈211〉19
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-15
hddkhiiwtrmpmgwkaqt
〈210〉11
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-17
ksqarhnrhfnaygqfsp
〈210〉12
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-19
pvqpqqgwgnqecmaar
〈210〉13
〈211〉19
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-22
hwdhefnrsrsfrqgvcsa
〈210〉14
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-23
rwlawfrrntqrqewhrw
〈210〉15
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉bx-25
llvgelregmkgywtml