一種提高無核葡萄雜交胚挽救成苗的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物育種技術領域，尤其涉及一種提高無核葡萄雜交胚挽救成苗的方法。
【背景技術】
[0002]無核葡萄由于食用方便深受消費者歡迎，在世界鮮食葡萄生產上占有重要地位，美國80%以上的鮮食葡萄是無核品種。但在葡萄育種方面，由于無核葡萄果實沒有種子，作為母本無法獲得雜交后代植株，長期以來只能利用有核品種作為母本與無核品種進行雜交，但其后代出現無核植株的比率很低，且育種周期較長。上世紀90年代，胚挽救技術的發展為無核葡萄育種帶來了新途徑，使無核葡萄作為母本進行雜交育種成為可能，不僅大幅度增加了后代無核的幾率，也大大縮短了育種周期，在一定程度上解決了無核葡萄育種的難題，作為一種有效的無核葡萄育種方法受到育種家們的高度重視。但是在胚挽救過程中，品種基因型、取樣接種時間、培養基種類與相態、植物生長調節劑、碳源、培養環境、移栽方式等都會對胚挽救的萌發率和成苗率產生影響，且各因子相互作用，并且南北方地區差異使得南方葡萄發育成熟早，胚敗育最佳期不同，加大了對無核葡萄胚挽救技術體系構建的難度，導致了無核葡萄為母本雜交后果實中胚發育率低，胚挽救成苗不足已經成為制約南方無核葡萄育種效率的瓶頸，如何提高無核葡萄胚挽救育種的成苗率，擴大胚挽救植株群體，成為葡萄育種家的努力方向。
【發明內容】
[0003]本發明針對現有的缺點，公開了一種提高無核葡萄雜交胚挽救成苗的方法，從而有效地促進無核葡萄雜交胚發育，在離體組織培養條件下能發育成苗，且胚培養苗健壯整齊，迅速擴大植株群體，提高南方地區無核葡萄育種中胚挽救育種效率。
[0004]為了解決上述技術問題，本發明通過下述技術方案得以解決。
[0005]一種提高無核葡萄雜交胚挽救成苗的方法，包括以下步驟，
[0006]A.摘心環剝:無核葡萄母本新稍長到6葉期，花序上留I葉進行摘心處理，在花前7-10天對頂副梢進行第二次摘心處理，其余副梢留I葉摘心，在初花期人工去雄前進行頂副梢摘心與結果枝的環剝；本發明中，無核葡萄母本新稍長到6葉期，花序上留I葉進行摘心處理，在花前7-10天對頂副梢進行第二次摘心處理，其余副梢留I葉摘心，起到以下技術效果:控制營養生長，促進花序發育。
[0007]B.雜交后取樣、低溫處理后接種胚珠:在初花期進行人工去雄授粉，在授粉后雜交種子敗育的最佳取果期摘取幼果，幼果取回后4-6°C低溫處理，3天，剝取胚珠接種，選擇加入第一外源添加物的B5液體培養基，25°C暗培養80-90天；
[0008]C.取裸胚接種:取胚珠，胚珠縱切剝取白色裸胚，接種到加入了第二外源添加物的WPM培養基上，光培養；
[0009]D.繼代擴繁:將30-40天苗齡的胚挽救試管苗，雙芽莖段接種在繼代培養基1/2WPM上，繼代培養基1/2WPM上加入第三外源添加物，外源添加物為0.1-0.5mg/L的IBA、20-40g/L的蔗糖、2-3g/L的活性炭，光培養得試管苗；
[0010]E.煉苗:對試管苗進行煉苗。
[0011]作為優選，步驟B中，授粉后雜交種子敗育的最佳取果期為火焰無核葡萄和寒香蜜雜交為授粉后33-36天，或奧迪亞無核葡萄和碧香無核雜交為授粉后38-40天。步驟B中，在初花期進行人工去雄授粉，在授粉后雜交種子敗育的最佳取果期摘取幼果，并進行低溫處理，取出流水沖洗30min，然后于超凈工作臺用75%乙醇漂洗30s，無菌水沖洗I次，再將果粒放入升汞溶液消毒6min，無菌水沖洗3-5次，剝取胚珠接種，選擇B5液體培養基，25°C暗培養80-90天。
[0012]作為優選，步驟B中，第一外源添加物為1-2.5mg/L的IBA、0.5-1.5mg/L的GA3、
0.1-0.5mg/L 的 6-BA、50-65g/L 的蔗糖、0.5-1.5g/L 的活性炭。
[0013]作為優選，步驟C中，第二外源添加物為0.4-0.8mg/L的6-BA、20_40g/L的蔗糖、l-2g/L的活性炭。
[0014]作為優選，步驟E中，煉苗方式為，試管苗移到室內自然光條件下培養2天；打開瓶蓋培養2天；取出試管苗、洗凈根系上培養基，栽入已裝好用70%甲基托布津和1000倍滅菌泥炭的營養缽中，苗上蓋塑料杯保濕，時間為7天；移到設施條件下長出2片新葉后定植，苗床土壤用30%惡霉靈消毒，即得到無核葡萄雜交苗植株。本發明在煉苗過程中，試管苗移到室內自然光條件下培養2天，是為了適應光照。打開瓶蓋培養2天是為了適應光照、溫度與濕度變化。取出試管苗、洗凈根系上培養基，栽入已裝好用70%甲基托布津和1000倍滅菌泥炭的營養缽中，苗上蓋塑料杯保濕培養，是為了適應光、溫濕度與泥炭基質。移到設施條件下是進行移栽前的適應性鍛煉。
[0015]與現有技術相比，本發明的有益效果為:本發明所采用的方法，能有效促進無核葡萄雜交胚在離體條件下繼續發育，提高胚珠與胚發育率，促進胚萌發，增加了雜交后代成苗的基數，從而能得到更多的雜交后代，且繼代擴繁后胚挽救苗健壯整齊，有助于降低因移栽死亡而造成的單株丟失風險與后期的鑒定。應用本發明所獲得的無核葡萄雜交胚發育率高，胚挽救苗整齊健壯，胚發育率達到了 41.7%，成苗率達到了 18.3%，繼代培養成苗率達到了 92%，其中健壯苗與次健壯苗達到81.8%，試管苗移栽成活率達到了 97%，大大提高了無核葡萄雜交后代胚挽救育種成苗的植株群體，提高了無核葡萄胚挽救育種效率，可操作性強、容易掌握。
【具體實施方式】
[0016]實施例1
[0017]一種提高無核葡萄雜交胚挽救成苗的方法，包括以下步驟，
[0018]A.摘心環剝:無核葡萄母本新稍長到6葉期，花序上留I葉進行摘心處理，在花前7天對頂副梢進行第二次摘心處理，其余副梢留I葉摘心，在初花期人工去雄前進行頂副梢摘心與結果枝的環剝；
[0019]B.雜交后取樣、低溫處理后接種胚珠:在初花期進行人工去雄授粉，在授粉后雜交種子敗育的最佳取果期摘取幼果，幼果取回后4°C低溫處理，3天，剝取胚珠接種，選擇加入第一外源添加物的B5液體培養基，25°C暗培養80天；
[0020]C.取裸胚接種:取胚珠，胚珠縱切剝取白色裸胚，接種到加入了第二外源添加物的WPM培養基上，光培養；
[0021]D.繼代擴繁:將30天苗齡的胚挽救試管苗，雙芽莖段接種在繼代培養基1/2WPM上，繼代培養基1/2WPM上加入第三外源添加物，外源添加物為0.lmg/L的IBA、20g/L的蔗糖、2g/L的活性炭，光培養得試管苗；
[0022]E.煉苗:對試管苗進行煉苗。
[0023]步驟B 中，第一外源添加物為 lmg/L 的 IBA、0.5mg/L 的 GA3、0.lmg/L 的 6_BA、50g/L的蔗糖、0.5g/L的活性炭。
[0024]步驟C中，第二外源添加物為0.4mg/L的6_BA、20g/L的蔗糖、lg/L的活性炭。
[0025]實施例2
[0026]一種提高無核葡萄雜交胚挽救成苗的方法，包括以下步驟，
[0027]A.摘心環剝:無核葡萄母本新稍長到6葉期，花序上留I葉進行摘心處理，在花前7-10天對頂副梢進行第二次摘心處理，其余副梢留I葉摘心，在初花期人工去雄前進行頂副梢摘心與結果枝的環剝；
[0028]B.雜交后取樣、低溫處理后接種胚珠:在初花期進行人工去雄授粉，在授粉后雜交種子敗育的最佳取果期摘取幼果，幼果取回后6°C低溫處理，3天，剝取胚珠接種，選擇加入第一外源添加物的B5液體培養基，25°C暗培養90天；
[0029]C.取裸胚接種:取胚珠，胚珠縱切剝取白色裸胚，接種到加入了第二外源添加物的WPM培養基上，光培養；
[0030]D.繼代擴繁:將40天苗齡的胚挽救試管苗，雙芽莖段接種在繼代培養基1/2WPM上，繼代培養基1/2WPM上加入第三外源添加物，外源添加物為0.5mg/L的IBA、40g/L的蔗糖、3g/L的活性炭，光培養得試管苗；
[0031]E.煉苗:煉苗方式為，試管苗移到室內自然光條件下培養2天；打開瓶蓋培養2天；取出試管苗、洗凈根系上培養基，栽入已裝好用70%甲基托布津和1000倍滅菌泥炭的營養缽中，苗上蓋塑料杯保濕，時間為7天；移到設施條件下長出2片新葉后定植，苗床土壤用30%惡霉靈消毒，即得到無核葡萄雜交苗植株。
[0032]步驟B中，授粉后雜交種子敗育的最佳取果期為火焰無核葡萄和寒香蜜雜交為授粉后3