多孔金屬材料在生物樣品冷凍中的應用及冷凍方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物低溫冷凍保存技術領域，具體涉及多孔金屬材料在生物樣品冷凍中的應用及冷凍方法。
【背景技術】
[0002]低溫冷凍，是指將生物組織在加有冷凍保護劑的溶液中，冷凍至某一低溫并對其長期保存的過程，在生物研宄、醫學應用等方面都有廣泛的使用與需求。其常用的方式有常規冷凍和玻璃化冷凍。其中，常規冷凍是將含有冷凍保護劑的生物樣品先在低溫冰箱中冷凍至_80°C，再將其在液氮中冷凍至_196°C并在液氮中長期保存的冷凍方法。玻璃化冷凍是指直接將含有冷凍保護劑的生物樣品在液氮中冷凍至_196°C的低溫冷凍方法。二者均對冷凍時的降溫速率有著較高的要求。然而，對于較大尺寸的生物組織，例如細胞團，組織，甚至整個器官；以及較大體積的生物溶液，如血液，含生物微組織的懸液等。因其特征尺寸大，傳熱熱阻大，導致冷凍速率低，會在生物組織中形成較大的冰晶，對其造成機械性的損傷，使得現有的冷凍技術很難將其有效的保存。
[0003]同時，樣品的體積變大，會導致傳熱的不均勻性增加，使得其在復溫過程中，會存在較大的熱應力，這對生物樣品存活造成了極大的威脅。因此，尋找能改善大體積的生物組織冷凍時的換熱方法，降低冷凍時的熱阻，對于解決較大體積生物樣品的冷凍、推進低溫冷凍保存技術的進一步發展，至關重要。
[0004]多孔金屬材料，作為一種新型的功能性材料，因其密度小，比表面積大，力學承載好，熱分散能力強等優勢，被廣泛用于航天，能源，建筑等領域。尤其是開孔的金屬多孔泡沫材料，其基體成分為銅鋁等高導熱金屬，孔間空隙為空氣填充，使得流體可以通過孔隙流動，從而被廣泛用于加強流體換熱，相變儲熱，均勻導熱和散熱等領域。目前，還未曾見過利用多孔金屬材料冷凍保存生物樣品的報道。
【發明內容】
[0005]為了克服上述現有技術存在的缺陷，本發明的目的在于提供多孔金屬材料在生物樣品冷凍中的應用及冷凍方法，該方法使用材料簡單，操作方便，易于實現，能夠加快冷凍速率，保證較高的生物組織存活率。
[0006]本發明是通過以下技術方案來實現:
[0007]本發明公開了多孔金屬材料在生物樣品冷凍中的應用。
[0008]所述多孔金屬材料的孔與孔之間連通，流體能夠通過多孔金屬材料中的孔隙；多孔金屬材料的孔隙率、孔徑、直徑以及體積參數，能夠根據所冷凍生物樣品的大小和體積進行選擇。
[0009]所述多孔金屬材料的孔隙率為0.5?0.99 ;多孔金屬材料的孔徑為100?5000 μmD
[0010]所述多孔金屬材料由導熱系數大于20W/m.°C的高導熱材料制成。
[0011]所述高導熱材料為銅、鋁、鐵、鎳等其他高導熱系數固體材料。
[0012]所述生物樣品為細胞、細胞團、血液、微生物組織或含生物組織的溶液。
[0013]本發明還公開了一種基于多孔金屬材料的生物樣品冷凍方法，將多孔金屬材料切割成與凍存管及生物樣品體積適應的形狀，再將混有冷凍保護劑的生物樣品懸液加入已放入多孔金屬材料的凍存管中，進行低溫冷凍處理。
[0014]優選地，將多孔金屬材料切割成圓柱狀，置于凍存管中，再將混有冷凍保護劑的生物樣品懸液加入已放入圓柱狀多孔金屬材料的凍存管中，進行低溫冷凍處理；其中，圓柱狀多孔金屬材料的外徑與凍存管的內徑相同。
[0015]優選地，所述多孔金屬材料的孔與孔之間連通，流體能夠通過多孔金屬材料中的孔隙；多孔金屬材料的孔隙率、孔徑、直徑以及體積參數，能夠根據所冷凍生物樣品的大小和體積調節。
[0016]所述多孔金屬材料的孔隙率為0.5?0.99 ;多孔金屬材料的孔徑為100?5000 μm。所述多孔材料由導熱系數大于20W/m.°C的高導熱材料制成，高導熱材料為銅、鋁、鐵、鎳等其他高導熱系數固體材料。。
[0017]低溫冷凍處理后還包括復溫處理，具體操作為:
[0018]將多孔金屬材料凍存管于37°C下水浴復溫解凍，直至凍存管中成為冰水混合物時，移出水浴；將凍存管中溶解后的溶液轉移到試管內后，去除冷凍保護劑，加入培養液，得到解凍后的生物樣品組織溶液。
[0019]與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果:
[0020]本發明公開了多孔金屬材料在生物樣品冷凍中的應用，由于多孔金屬材料的孔與孔之間連通，流體能夠通過多孔金屬材料中的孔隙，因此以多孔金屬材料作為傳熱媒介，能夠有效提高冷凍速率，且冷凍過程中由于多孔材料存在孔隙，不易形成較大體積的冰晶，從而盡可能避免冷凍過程中生物組織的損傷。生物樣品內部的傳熱更為均勻，能夠避免造成較大熱應力，從而保證生物樣品的存活。同時，在冷凍過程中冷凍生物組織不與液氮直接接觸，不會造成生物污染。多孔金屬材料的孔隙率、孔徑、直徑以及體積參數，能夠根據所冷凍生物樣品的大小和體積進行選擇。
[0021]本發明還公開了基于多孔金屬材料的生物樣品冷凍方法，該方法所需的實驗裝置制作簡單，易實現，冷凍流程操作便捷，可冷凍細胞或細胞團等其他生物組織，以及大體積的生物溶液(如血液)，不受所含生物組織種類的限制。根據所冷凍生物樣品的大小和體積選擇相應孔隙率、孔徑、直徑以及體積參數，的多孔金屬材料。
[0022]進一步地，通過本方法冷凍后的生物樣品在復溫時速度快，能夠有效避免復溫時的再結晶對生物組織造成的損傷。
【附圖說明】
[0023]圖1為本發明所述冷凍方法的示意圖；
[0024]圖2為使用本發明的常規冷凍方法流程圖；
[0025]圖3為使用本發明的常規冷凍方法實驗結果圖；
[0026]其中圖3(a)為常規冷凍方法在低溫冰箱中實驗結果圖；圖3(b)為常規冷凍方法在液氮中實驗結果圖；圖3(0)是其前1200s的冷凍曲線放大圖；圖3((1)是其前40s的冷凍曲線放大圖；
[0027]圖4為使用本發明的玻璃化冷凍方法裝置圖；
[0028]圖5為使用本發明的玻璃化冷凍方法實驗結果圖。
【具體實施方式】
[0029]下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。
[0030]參照圖1，本發明的基于多孔金屬材料的生物樣品冷凍方法所用裝置包括凍存管和多孔金屬材料；將多孔金屬材料切割成圓柱狀，置于凍存管中。多孔金屬材料為開孔的金屬材料，孔與孔之間連通，可允許流體流動。多孔金屬材料的外直徑與凍存管的內徑相同。
[0031]所述多孔金屬材料的孔隙率為0.5?0.99 ;多孔金屬材料的孔徑為100?5000 μ m，多孔金屬材料的孔隙率，孔徑，直徑，體積等參數，可根據所冷凍樣品大小和體積，相應選擇和調節。
[0032]所述凍存管由耐低溫材料構成，耐低溫材料包括聚丙烯材料。
[0033]所述多孔金屬材料由高導熱材料構成，導熱系數大于20W/(m*°C )，高導熱材料包括銅、鋁、鐵、鎳等其他高導熱系數固體材料。。
[0034]所述的冷凍裝置能夠冷凍細胞、細胞團或其他生物組織以及大體積的生物溶液(如血液)。
[0035]冷凍方法為:在配制細胞、細胞團或微生物組織溶液后，在其中加入冷凍保護劑，用于在冷凍過程中將抑制細胞內冰晶的長大。
[0036]參見圖2，冷凍過程中，先旋開凍存管旋蓋，然后將混有冷凍保護劑的生物組織溶液緩緩倒入已放有多孔金屬材料的凍存管中。之后，旋緊凍存管旋蓋。常規冷凍時，將凍存管放入倒有異丙醇的程序降溫盒中。將程序降溫盒轉移至低溫冰箱(-80°C)中緩慢冷凍12小時后，從低溫冰箱中取出程序降溫盒，迅速將凍存管浸沒至液氮中進行冷凍。
[0037]玻璃化冷凍時，參見圖4，將凍存管直接浸沒至液氮中冷凍。
[0038]復溫時，將冷凍的多孔金屬材料的凍存管直接放入水浴鍋中加熱至冰水混合物，之后將生物組織溶液移出。
[0039]下面以冷凍細胞為例，對本發明的冷凍方法進行詳細使用說明。
[0040]一種基于多孔金屬材料的冷凍方法，包括以下步驟:
[0041]1、細胞冷凍
[0042]I)配置細胞懸液，使其濃度為I X 14?I X 10 6個/mL ；
[0043]2)將多孔金屬材料和凍存管消毒后，將多孔金屬材料放入凍