一種防治核桃基腐病的生防菌劑及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種生防治劑，特別涉及一種以拮抗核桃基腐病病原菌的枯草芽孢桿 菌為主要成分的生防治劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 核桃（Juglans regia L.)屬落葉喬木，是我國重要的經濟樹種，具有豐富的營養 價值和保健功能，可制取食用油和制作各種食品。核桃作為新疆的第二大果樹，栽培面積占 全疆林果總面積的四分之一，核桃產業已成為新疆農民致富增收的重要支柱產業之一。核 桃適生范圍廣，常被栽植于山區和田園，是重要的用材樹種和生態樹種。近幾年，隨著新疆 核桃種植面積逐漸擴大，大面積種植單一品種、管理粗放以及栽培模式等原因，病蟲害問題 日益增多，核桃基腐病（Pythium oligandrum Drechsler)的大面積嚴重發生制約了新疆核 桃產業的健康發展，核桃基腐病與腐爛病有本質的區別，核桃腐爛病主要危害支桿的皮層， 皮層上面產生小黑點。
[0003] 目前，防治核桃基腐病的方法主要以化學方法為主，通過大田試驗篩選出了咪酰 胺等防效較好的藥劑。常規的化學藥劑在防治核桃基腐病方面，有經濟、高效和方便等優 勢，但其易環境污染，不利于打造生態健康果園。最近幾年通過生防菌株防治果樹病害已成 為一種重要的防治手段，目前應用較多的拮抗細菌主要有芽孢桿菌Bacillus SUbtiliS、假 單胞桿菌Pseudomonas spp·、土壤放射桿菌Agrobacterium radiobacter等。然而通過詰 抗菌株防治核桃基腐病的研宄尚未見報道。因此，篩選出抗菌譜廣、生防活性高及對環境安 全的新型拮抗細菌，制備成高效的生防菌劑，對該病害的防治具有重要意義。本申請從分離 核桃基腐病病原菌過程中得到的細菌與病原菌通過平板對峙培養法篩選出抑制效果較好 的生防細菌，并對其進行種類鑒定，將分離得到的生防細菌制備成生防菌株，實現菌株的應 用。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的問題，提供一種防治核桃基腐病 的菌株。
[0005] 本發明進一步提供利用上述菌株制備的生防菌劑。
[0006] 本發明進一步提供上述生防菌劑的制備方法。
[0007] 本發明進一步提供利用上述生防菌劑的防治方法。
[0008] 本發明人等從新疆和田地區墨玉縣采集得的核桃基腐病病害標本中分離出一種 屬于枯草芽孢桿的菌株，發現該菌株對植物生長無不良影響，具有抑制核桃基腐病病原菌 的效果，并由此完成了本發明。
[0009] 本發明涉及以下的菌株和核桃基腐病生防菌劑、生防菌劑的制備方法以及利用生 防菌劑防治核桃基腐病的方法。
[0010] (1)枯草芽孢桿菌菌株GY-11。
[0011] (2)含有芽孢桿菌菌株GY-Il作為有效菌的核桃基腐病生防菌劑。
[0012] (3)使用上述（2)中記載的核桃基腐病生防劑進行防治核桃基腐病的防治方法，。
[0013] [枯草芽孢桿菌菌株GY-11的分離與保藏]
[0014] 本發明的枯草芽孢桿菌菌株GY-Il是從新疆和田地區墨玉縣采集的核桃基腐病 病害標本中分離出的菌株。
[0015] 具體的，本發明是通過以下步驟得到核桃基腐病拮抗菌菌株GY-Il的：
[0016] (1)拮抗菌株的分離：將核桃基腐病病害標本材料的病健交界部位切成5mm的組 織塊，先用75%乙醇消毒該組織塊30s，立即取出，再置于1 %次氯酸鈉消毒90s，最后用無 菌水沖洗3次后利用滅菌濾紙將組織塊表面的水吸干，得到消毒后的組織塊。將消毒后的 組織塊在PDA培養基上進行培養，培養溫度為28°C恒溫培養，每24h觀察一次，當觀察到 組織塊周圍出現抑菌圈時，使用劃線法將抑菌圈的的細菌菌落純化在NA平板上，得到單菌 落，最后將得到的單菌落于4°C保存。
[0017] (2)拮抗菌株的篩選：將分離得到的單菌落進行活化培養，在距離病原菌2. Ocm 處等距離地將所述單菌落劃線至已接種核桃基腐病病原菌的PDA平板上，以只接病原菌的 PDA平板培養基為對照，每個處理3個重復。28°C恒溫培養，待對照的平板培養基的菌絲即 將長滿時，測量細菌菌株與病原菌之間的抑菌帶寬度，得到對核桃基腐病病菌抑菌帶最寬 的拮抗菌株GY-Il。
[0018] 其中，所述PDA培養基的配方是去皮土豆200g，葡萄糖17g，瓊脂15g，蒸餾水 lOOOmL，pH 自然。
[0019] 其中，所述NA培養基的配方為：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaC15g，瓊脂15g，蒸餾水 1000mL ? pH 7. 2〇
[0020] 該菌株根據其后所述的培養特征和生理生化特征，參考《常見細菌系統鑒定手冊》 和《芽孢桿菌屬》的描述，結合分子生物學結果，確定拮抗菌株GY-11為枯草芽孢桿菌的新 菌株，于2015年5月14日作為"枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)GY_ll"保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC);保藏地址：北京市朝陽區北辰西 路1號院3號，中國科學院微生物研宄所。
[0021] (a)形態學性質
[0022] 形態：桿狀
[0023] 大小：0· 7 ~0· 8X2 ~3 μπι
[0024] 運動性：+
[0025] 鞭毛著生狀態：周生
[0026] 芽孢形態：橢圓
[0027] 芽抱大小：0· 6 ~0· 9 X I. 0 ~L 5 μ m
[0028] (b)培養性質
[0029] 菌落形狀：圓形
[0030] 菌落顏色：乳白色
[0031] 液體培養基培養：乳白色，白色邊緣不圓滑似圓形，表層不規則突起，褶皺明顯。
[0032] (c)生理學性質
[0033] 革蘭氏染色：+
[0034] 接觸酶試驗：+
[0035] VP 實驗：+
[0036] 甲基紅試驗：+
[0037] 淀粉水解：+
[0038] 檸檬酸的利用：+
[0039] 卵磷脂試驗：_
[0040] 菌膜形成試驗：+
[0041] 吲哚物質的生成：_
[0042] 好氧兼性厭氧測定：_
[0043] 硫化氫的產生：_
[0044] 硝酸鹽的還原：-
[0045] 2% NaCl ：++
[0046] 5% NaCl ：++++
[0047] 7 % NaCl ：++++
[0048] 10% NaCl ：++
[0049] 需要說明的是，" + "代表陽性，代表陰性，"++"代表生長一般，"++++"代表生 長最適。
[0050] (d)分類學性質
[0051] 菌株GY-11與枯草芽抱桿菌Bacillus subtilis的16SrDNA序列同源性為99%， 在GenBank注冊的序列號為KP876486。從基于鄰接法構建的16S rDNA系統發育樹（如圖 2所不）可以發現；菌株GY-Il與模式菌株枯草芽孢桿菌（KF496886)聚類在同一大分支內 (支持率99% )，并結合菌株的形態學及生理生化特征，最終確定菌株GY-Il為枯草芽孢桿 菌 Bacillus subtilis。
[0052] [GY-11菌株的培養]
[0053] 有關本發明的GY-Il菌株的培養方法可以選擇任何適宜的培養基和培養條件。此 外，除液體培養基之外可以使用加入了瓊脂的斜面培養基和平板培養基等固體培養基。通 過培養使GY-Il菌株增殖以獲得所需的菌體量。
[0054] 培養基中的碳源可以利用所述GY-Il菌株可以同化的所有物質。具體地說，除葡 萄糖、半乳糖、D-土塘、蔗糖、麥芽糖、麥芽提取物、淀粉水解物等糖之外，還有GY-Il可以利 用的各種合成或天然碳源，但是不包括乙酸。
[0055] 培養基中的氮源，同樣的，除含有有機氮的蛋白胨、酵母提取物、硫酸銨、谷氨酸、 酵母膏、磷酸二氫銨、硝酸鉀、氯化銨、硝酸鈣、天冬氨酸、亞硝酸鈉之外，還可以是GY-Il菌 株可以利用的各種合成或天然氮源，但是不包括尿素。
[0056] 根據常規的微生物培養方法，必要時可以相應地添加 NaCl、磷酸鹽等無機鹽類、 鈣、鎂、鐵等金屬鹽，維生素、氨基酸等微量營養源。
[0057] 培養可以在搖床培養、震蕩培養、通氣培養等好氧條件下進行。培養溫度為20~ 40°C，優選25~30°C，進一步優選為25°C ;pH5~9,優選6~7,進一步優選為7 ;培養時間 24-48h，優選24h為宜，其中，搖床培養的轉速為120-220r/min，優選160-200r/min，進一步 優選為180r/min。
[0058] 為實現本發明的另一目的，本發明提供的一種防治核桃基腐病的生防菌劑是由保 藏號為CGMCC No. 10809的生防菌株GY-Il制備而成，其中，生防菌劑中的活菌總濃度為 1. 6Χ108-3· 8X1010CFU/mL〇
[0059] 為實現本發明再一目的，本發明提供的生防菌劑的制備方法，是將菌種保藏號為 CGMCC No. 10809的生防菌株GY-Il在培養基中震蕩培養，經離心處理后，將沉淀用滅菌水 稀釋成GY-Il活菌總濃度為I. 6X 108-3. 8X 101(lCFU/mL的菌劑。
[0060] 其中，所述培養基選擇NA培養基、NB培養基、PDA培養基、LB培養基中的一種。
[0061] 優選地，所述培養基為NB培養基和LB培養基。
[0062] 其中，所述震蕩培養的培養溫度為20°C -40°C。
[0063] 優選地，所述震蕩培養的培養溫度為25°C。
[0064] 其中，所述離心處理的轉速為120r/min_220r/min。
[0065] 優選地，所述離心處理的轉速為180r/min。
[0066] 其中，所述培養基的起始pH值為5-9。
[0067] 優選地，所述培養基的起始pH值為7。
[0068] 為實現發明的再一目的，本發明提供的利用生防菌劑防治核桃基腐病的方法是： 可以直接施用于核桃基腐病發病部位，也可以用水等稀釋后施用于核桃基腐病發病部位。
[0069] 本發明利用新疆和田地區墨玉縣采集得的核桃基腐病病害標本中分離出一種枯 草芽孢桿菌株GY-Il對核桃基腐病病原菌具有高效的抑制作用，并且利用該菌株制備的生 防菌劑對核桃基腐病的防治有良好的