用于增加器官和組織保存溶液的穩定性和儲存壽命的溶液的制作方法

用于增加器官和組織保存溶液的穩定性和儲存壽命的溶液的制作方法
【專利摘要】公開了具有改進的穩定性的器官和組織保存溶液。該溶液包括兩種單獨的溶液。第一溶液，溶液A，包括平衡鹽溶液，其在為7.0或更高的pH下的溶液中是穩定的。第二溶液，溶液B，包括水性溶液，所述水性溶液含有L?谷胱甘肽和/或半胱氨酰甘氨酸，諸如D?葡萄糖的糖，L?精氨酸，諸如抗壞血酸的還原劑和水，溶液B的pH低于7.0，優選為從約3.0至5.0。然后在使用時將這兩種溶液混合在一起，并將pH調節至約7.3，得到具有改善的穩定性的器官和組織保存溶液。優選地，溶液A具有為約7.6的pH以及溶液B具有為約5.0的pH。本發明還包括試劑盒20，其包括在兩個單獨的容器22，24中的兩種溶液。在一個替代的實施例中，糖可在溶液A中。
【專利說明】用于増加器官和組織保存溶液的穩定性和儲存壽命的溶液
[0001] 相關申請
[0002] 本申請要求于2013年11月22日提交的序列號為61/963,093的在先提交的待決美 國臨時專利申請的權益和優先權，其公開內容由此以其全文通過引用并入本文。
技術領域
[0003] 本發明涉及用于保存組織和器官功能的配制物，以及更具體地涉及用于保存組織 和器官功能(具體是移植之前的血管導管功能）的儲存穩定的配制物。
【背景技術】
[0004] 本文引用的所有參考文獻的教導以其全文通過引用并入。
[0005] 美國專利7，981，596公開了組織和器官保存溶液，通常稱為GALA。其由以下三種成 分命名：谷胱甘肽，抗壞血酸和L-精氨酸。GALA溶液還包括平衡鹽溶液。這些溶液特別適用 于保存諸如動脈和靜脈的血管導管。血管導管被用作適于各種旁路外科手術的移植物，所 述手術包括但不限于周圍血管旁路分流手術和冠狀動脈旁路移植(CABG)手術。旁路移植是 其中血管導管以如此的方式移植以旁路繞過被阻塞的動脈以至于將血流恢復到目標組織 的方法。在血管手術期間，在血管導管被移植之前獲取血管導管、對其進行沖洗并暫時保存 在儲存溶液中。
[0006] 內皮功能障礙是在導致血管導管發生故障的相互關聯的發病中的主要決定因素。 移植失敗之后會導致移植血栓形成、內膜增生和加速移植動脈粥樣硬化，所有這些在血管 導管內皮的以往功能和/結構損傷之前都已預知。已經認識到用于在手術中獲取的隱靜脈 段的存儲溶液的選擇對血管內皮的結構和功能以及因此移植通暢方面具有顯著影響。這些 溶液無法充分保存保持血管導管已被許多研究者(Thatte HS，BisWas KS，Najjar SF等人， 隱靜脈內皮細胞的多光子顯微鏡評估及其用新溶液
[0007] GALA的保存（Multi-photon microscopic evaluation of saphenous vein endothelium and its preservation with a new solution,GALA.,Ann Thorac Surg 2003;75:1145-52和Hussaini 2011))所證實。在Wilbring等人的2011體外研究中證實在從 患者獲取的導管存放在通常適用于血管導管存儲的緩沖鹽溶液中之后血管功能完全喪失。 該數據表明內皮細胞功能也顯著下降，但這些功能失調的導管在本研究中被成功地用作適 于旁路手術的移植物。
[0008] 在體外研究中對于GALA?保存溶液對人體隱靜脈段的影響進行了評估。雖然當今 在臨床上使用的溶液導致在血管導管(隱靜脈)的內皮細胞活力上的顯著下降，但GALA?維 持內皮功能和結構活性至少達24小時（Thatte 2003, Circulation 2013: 127e6-e245Hussaini BE，Lu XG,Wolfe JA和Thatte S.Evalation of endoscopic vein extraction on structural and functional viability of saphenous vein endothelium.J Cariothorac Surg 2011;6:82-90)。因而體外數據表明通過將GALA?用作 血管導管保存溶液而提供血管導管的更好保存。然而，所公開的溶液由于溶液的不穩定性 而具有有限的儲存壽命。
[0009] 因此，需要生產GALA器官和組織保存溶液的改進的溶液以便提高溶液的穩定性和 儲存壽命。

【發明內容】

[0010] 本發明基于實現下述為前提，即GALA配制物的穩定性可通過將配制物分離成具有 pH為至少7、通常為7.4-8的第一溶液A和具有pH為小于7、通常更低的第二溶液B來改進。溶 液A包括平衡鹽溶液。溶液B包括水，諸如抗壞血酸的抗氧化劑，具體為L-谷胱甘肽的還原 劑，諸如L-精氨酸的一氧化氮底物和諸如D-葡萄糖的糖。該溶液保持在低于7、優選5,4或3 的pH，優選具有為以每百萬零份的氧含量。在本發明的一個替代實施例中，溶液A和B如上所 述配制，不同之處在于所述糖被添加到溶液A而不是溶液B。此外，在替代的配制物中，可添 加紅細胞生成素(ΕΡ0)，優選添加到溶液B。
【附圖說明】
[0011]圖1是適于在本發明中使用的多室袋的透視圖；
[0012] 圖2是適于與本發明一起使用的具有第一和第二容器的試劑盒的透視圖；
[0013] 圖3A和圖3B是表示在谷胱甘肽、抗壞血酸和精氨酸的加速儲存條件下隨時間變化 的濃度曲線圖；
[0014] 圖4是描繪L-谷胱甘肽在溶液B中降解速率的兩幅曲線圖；以及 [0015]圖5A-5D是實施本發明的方法的不意性視圖。
【具體實施方式】
[0016] 除非另有定義，否則文中所用的所有技術及科學術語具有由本發明所屬領域的普 通技術人員所通常理解的相同含義。盡管在本發明的實踐或測試中可使用與本文中所述那 些類似或相當的任何方法及材料，但對優選的方法及材料進行描述。出于本發明的目的，下 列術語定義如下。
[0017] 如本文中所用，術語"患者"包括動物界的成員，包括但不限于人類。
[0018] 如本文中所用，"器官"包括但不限于心臟、靜脈、動脈、肺、肝、胰腺及腎。亦涵蓋器 官的部分。
[0019] 如本文中所用，"無菌水"包括但不限于：（a)注射用無菌水，USP;(b)無菌蒸餾去離 子水;及(c)灌洗用無菌水。
[0020] 如本文中所用，"心麻痹(cardioplegia)"包括但不限于心臟麻痹。
[0021] 如本文中所用，"亞低溫"為約10攝氏度-21攝氏度。
[0022] 如本文中所用，"抗氧化劑"為當存在于包含可氧化底物生物分子的混合物或結構 中時，延遲或防止底物生物分子氧化的物質。例如，抗壞血酸為抗氧化劑。
[0023] "平衡鹽溶液"被定義為滲透上平衡以防止急性細胞或組織損傷的水性溶液。
[0024] "緩沖鹽溶液"被定義為平衡的鹽溶液，化學物質添加到其以保持預定的生理pH值 范圍。
[0025] "GALA"是指包括谷胱甘肽、抗壞血酸、L-精氨酸和平衡鹽溶液的一種類型的組織 保存溶液。
[0026] "移植物"被定義為在身體的一部分中移植或植入以修復缺陷的組織。
[0027] "獲取的旁路導管"被定義為用于使得血液旁路繞過阻塞的外科手術安裝的替代 路徑。
[0028] "心麻痹溶液"被定義為在運輸或手術過程中輔助保存心臟的溶液。
[0029] "細胞還原劑"被定義為容易失去電子從而引起其它物質被化學還原的物質。
[0030] "緩沖劑"是用于維持溶液的酸度(pH)接近選定值的酸或堿。用于生產本發明溶液 的優選的緩沖劑是4N的鹽酸和84 %的NaHC03。
[0031] "等滲溶液"是指具有跨半透膜的相同滲透壓的兩種溶液。等滲溶液是具有與細胞 相同的鹽濃度的溶液。
[0032] "生理溶液"被定義為通過與正常間質流體等滲而與正常組織兼容的鹽水性溶液。
[0033]本發明提供包含兩種溶液(溶液A和溶液B)的GALA類型的組織保存配制物，其相比 于現有GALA類型的單一溶液的組織保存溶液具有出乎意料之外的更高穩定性。
[0034] 根據本發明，第一溶液或溶液A包括平衡鹽溶液。該平衡鹽溶液包括水和生理學上 可接受的鹽。典型的平衡鹽溶液將包括水，鈣離子，氯離子，鉀離子，磷酸根離子，鎂離子和 鈉咼子。
[0035]平衡鹽溶液包括選自如下的鹽:二水合氯化鈣、氯化鉀、磷酸二氫鉀、六水合氯化 鎂、七水合硫酸鎂、氯化鈉、碳酸氫鈉、七水合磷酸氫二鈉及其組合。平衡鹽溶液以第一及第 二溶液混合在一起時將產生等滲溶液的濃度提供。在示例性實施例中，平衡鹽溶液包括約 0.14克/升二水合氯化鈣、約0.4克/升氯化鉀、0.06克/升磷酸二氫鉀、約0.1克/升六水合氯 化鎂、約0.1克/升七水合硫酸鎂、約8克/升氯化鈉、約0.36克/升碳酸氫鈉及約0.03克/升七 水合磷酸氫二鈉。
[0036]溶液A的成分在水中一起溶解，并且所得溶液的pH通過加入堿(諸如碳酸氫鈉）調 節至約7.4-8.0。
[0037] 任選地，溶液A可包含非甾體抗炎劑，諸如阿司匹林，萘普生和布洛芬。任選地，局 部麻醉藥物可加入，優選加入到溶液A中，或在替代方案中，麻醉藥物可在使用時加入。這樣 的局部麻醉藥物的實例包括但不限于利多卡因，阿替卡因/腎上腺素，甲哌卡因，布比卡因， 羅比卡因和氯普魯卡因。
[0038]根據本發明，GALA的以下成分將在第二溶液或者溶液B中：還原型谷胱甘肽，諸如 抗壞血酸的還原劑，諸如D-葡萄糖的糖，L-精氨酸，緩沖劑和水，其已用諸如氬氣的惰性氣 體吹掃以基本上除去所有溶解的氧(優選至小于O.lppm)。所得溶液B的pH小于7,且通常為 從3至5。作為替代方案，半胱氨酰甘氨酸可取代還原型谷胱甘肽，或半胱氨酰甘氨酸和還原 型谷胱甘肽的混合物可存在于溶液B中。在一種最優選的配制物中，溶液A的pH為8.0以及溶 液B的pH為約3.0。
[0039]更具體地，溶液B是在單獨的容器中來自溶液A的有機成分的溶液，且包括L-谷胱 甘肽，L-精氨酸，L-抗壞血酸，D-葡萄糖和水，用于在為3.0-5.0的pH下注射。可代替葡萄糖 使用的其它糖是任何糖，但優選任何單糖，所述單糖包括但不限于果糖，甘露糖和核糖。當 將溶液A和B在使用時混合的時候，混合溶液的pH為7.3 ± 0.4。溶液A和B的pH可使用許多已 知的緩沖劑來調節。優選的緩沖劑是4N的HC1和84%的NaHC03。在一種優選的配制物中，溶 液A的pH為約7.8以及溶液B的pH為約4.0。在一種最優選的配制物中，溶液A的pH為8.0以及 溶液Β的pH為3.0。
[0040]溶液中的鹽用于緩沖(保持pH)并保持相對于血管導管的等滲性。有機成分是為了 維持額外的緩沖能力、重量克分子滲透壓濃度(osmolality)和給血管導管提供非氧化性的 環境。四種有機成分(L-谷胱甘肽，L-抗壞血酸，L-精氨酸和D-葡萄糖)是血液的正常組分并 且為了它們在保存和維持血管導管的細胞外環境的作用而被包括在內。
[0041 ] L-谷胱甘肽和L-抗壞血酸是通過吸收自由基而防止對細胞造成氧化性損傷的抗 氧化劑。在組織保存溶液中的這些抗氧化劑的功能是：1)通過防止氧化來穩定溶液的其它 成分，從而改善產品的穩定性和儲存壽命;和2)防止對細胞膜和細胞外基質結構的氧化性 損傷。氧化性損傷已經表明破壞細胞外體系結構的結構完整性，從而導致中斷血管內皮細 胞襯里。中斷內皮襯里是血管移植物受損的一個指標。糖的目的是提供用于組織或器官的 能量來源。
[0042]當溶液A和溶液B相混合時，L-精氨酸的濃度應為從約250μΜ至約2000μΜ。葡萄糖 的濃度應為從約50mM至約120mM，L-谷胱甘肽為50μΜ至約2000μΜ和L-抗壞血酸為25μΜ至 約 1000μΜο
[0043] 第一或第二配制物可任選包括其量足以協助防止組織或器官血管內的血液凝固 的抗凝劑。示例性的抗凝劑包括肝素和水蛭素，但也可以使用其它抗凝劑，諸如阿司匹林。 示例性實施例包括濃度在從約50單位/毫升至約250單位/毫升范圍內的肝素。肝素也可在 溶液Α和Β相混合之后并在使用前之前單獨加入。
[0044] 在一個示例性實施例中，溶液A和溶液B的體積比為約19:1。例如，在一個實施例 中，950毫升的溶液A與50毫升溶液B混合以得到用于保存組織或器官功能的最終配制物。 [0045] 如果ΕΡ0添加到溶液A或B，當溶液A和溶液B相混合時，ΕΡ0的濃度應為約5單位/毫 升。
[0046] 根據本發明，第二替代性組織保存溶液包括溶液A和第二溶液溶液B，所述溶液A包 括糖，諸如葡萄糖，甘露糖，果糖等，所述糖與pH在7.4至8下的平衡鹽溶液混合，而第二溶液 溶液B包括還原型谷胱甘肽，抗壞血酸，L-精氨酸，在pH低于7、通常為5、4或3下的在水中的 緩沖劑，其可以存儲在無氧環境中。
[0047] 通常，在任一實施例中的溶液A或B都將不包括除具體所列那些以外的其它有機成 分，因為這些其它有機成分會是不必要的并增加生產成本。具體地，除了前面所列那些以外 的在其它類型的組織保存溶液中發現的其它有機化合物將不包括在溶液A或B中，以最大限 度地降低成本并減少可能對最終產品不利的潛在副反應。
[0048] 制造過程是穩健的，并在cGMP條件下進行。該產品由無菌灌裝過程滅菌，并且穩定 性測試提供至少2年的建議儲存壽命。
[0049] 圖1和圖2示出用于運輸、存儲和最后使用本發明的組織保存溶液的試劑盒或容器 的示例性典型實施例。這些是示例性的且其它容器可用于提供單獨的溶液A和B，它們在使 用時混合以便組織保存。
[0050] 圖1示出具有兩個腔室12和14的袋子10,兩個腔室12和14通過夾具16從彼此隔開 或夾斷。腔室12含有溶液A而腔室14含有溶液B。當夾具16被移除時，腔室12和14變成袋子10 的一個腔室，以及溶液A與溶液B混合得到袋子10中的整體器官和組織保存溶液。參見號為 5,257,985的美國專利。
[00511圖2示出具有兩個容器22和24的器官和組織保存試劑盒20。溶液A被包含在容器22 中以及溶液B被包含在容器24中。在使用時，容器24中的內容物可被排空到容器22內，或者 兩個容器22和容器24的內容物都可被排空到動脈或靜脈可放置于其中的盆或碗內，以產生 整體的器官和組織保存溶液。
[0052]在如圖2中所示的一個優選實施例中，溶液A被無菌裝填到預先滅菌的Nalgene瓶 中，然后將其用預先滅菌的HDPE螺帽固定。
[0053]溶液B被無菌地裝填到預先滅菌的硼硅酸鹽I型玻璃小瓶內，其用預先滅菌的 Stelmi隔膜固定，所述隔膜通過可撕開的密封件保持在位。可撕開的密封件在制造商推薦 的壓接設置下使用有效的壓接過程壓接至瓶。在混合和裝填過程中瓶B可用氬氣氣體脫氣 以減少氧的存在，但是這可能不是必要的。
[0054]含有溶液A的瓶和含有溶液B的瓶然后被放置在卡片紙(card-stock)預印箱內。此 時包裝說明書也放置在箱內。然后將箱密封并標記以便分配。
[0055] 在使用時，溶液A和B混合在一起以便完成GALA的最終溶液C且pH將被調節至約7.3 ± 0.4。如果溶液A的pH為8.0，則溶液B的pH將為約3.0。如果溶液A的pH為7.8，則溶液B的pH 將為約4.0。并且，如果溶液A的pH為7.6，則溶液B的pH將為約5.0。
[0056] 下面是用于實踐本發明的推薦過程。
[0057]將溶液22和24升溫至環境或房間溫度。在使用之前，通過檢查封閉情況來檢查每 個容器22和24是否有泄漏。如果發現泄漏，則丟棄溶液容器。執行對溶液的目視檢查以便檢 查是否有微粒物質。如果在溶液中明顯見到明顯的顆粒物、沉淀物或污染物，則不使用該溶 液。在即將使用前執行以下步驟：
[0058] 1.將溶液A的全部內容物從小瓶22倒入到無菌容器26 (例如托盤，杯子或小盆）內， 血管導管32在移植之前被存儲在容器26內，如圖5A中所示。
[0059] 2.用無菌注射器28從小瓶24無菌地取出12.5毫升的溶液B，并將其添加到具有溶 液A的容器26 (圖5B)以便形成GALA溶液34。
[0060] 3.將12，500單位的肝素加入到含有溶液A和B的容器26，如圖5C中所示。
[0061] 4.通過輕輕旋動在容器26中進行混合。
[0062] 溶液用于沖洗剛從患者取出之后的分離的血管導管32。混合的溶液A和B也可與注 射器組合使用以便將靜水壓力施加到導管以便存儲在溶液內之前評估導管泄漏。然后血管 導管32被存儲在容器26中的混合溶液34內直至血管導管可被移植到患者體內為止。
[0063] 本發明的溶液、裝置和灌注方法并不限于用于特定的組織、器官或細胞類型。例 如，本發明可用于所獲取的隱靜脈、上腹部動脈、胃網膜動脈和冠狀動脈旁路移植術(CABG) 中使用的橈動脈。本發明還可用于在移植手術期間保持器官和組織。本發明不限于任何特 定的組織或器官。例如，預期這樣的器官或組織可以是心臟，肺，腎，腦，血，血小板，肌肉移 植物，皮膚，腸道，骨骼，附屬器官，眼睛等或其部分。此外，本發明亦可用作原位組織或器官 防腐劑。可預期本發明的溶液用于洗滌和浸泡尚未從患者取出的組織及器官。例如，可預期 本發明在心臟停搏期間使用。例如，還可預期到本發明亦可用于急救程序，其中會需將組織 或器官浸泡于配制物中以保存其直到可進行手術或獲得其它醫療護理為止。就此而言，該 溶液可供醫院環境及"現場"（即，在救護車或臨時緊急醫療設施中）的緊急醫療人員使用。
[0064] GALA溶液(混合的溶液A和B)也可用作手術(具體是塑形或重建手術）中的灌洗溶 液。這包括但不限于吸脂，乳房重建，乳房切除術或其中將需要等滲的pH平衡的溶液諸如 GALA的其它操作。該GALA溶液也可用于使用制造商的用于沖洗或灌注的程序來沖洗或灌注 透析機。該GALA溶液也可與靜脈的外部支撐配合使用。這種支撐的一個實例是由以色列的 Vascular Graft Solutions of Tel-Aviv開發的Vest?血管外部支持。
[0065] 器官和組織保存溶液的成分也可摻入到膠體、乳膏、或水凝膠中。水凝膠的實例在 號為6,339,074的美國專利中公開。
[0066] 下面的表1示出本發明的實施例，其中溶液A的pH為約8.0以及溶液B的pH為約3.0。
[0067] 表 1
[0068] -個實施例的溶液A和B的定性和定量組分
[0069]
[0070]
[0071 ] 表2中示出混合的溶液A和溶液B的成分：
[0072] 表 2
[0073] 混合的溶液A和B的定性和定量組分
[0074]
[0075]
[0076] 以下實例意在說明本發明，但不以任何方式進行限制。
[0077] 實例 1
[0078] 制備來自表1的多個批次的溶液A和溶液B。來自三個單獨批次的二^^一組溶液A和 B容器被放置在保持在40°C具有75%相對濕度的合格的穩定性腔室內。來自每個批次的溶 液容器被定期取出并在這些加速條件下進行測試。該數據結果被外推以確定產品的存儲壽 命，如果它在2-8 °C下儲存的話。存儲壽命的確定基于產品溶液處于設置規范（set specification)內的最短持續時間的評估。研究溶液A和B的pH、重量克分子滲透壓濃度和 電導率。構成溶液A的八種無機鹽是惰性的，并且在水性介質中在延長的時間段下保持穩 定。
[0079]溶液B成分中的兩種，L-精氨酸和D-葡萄糖，也被發現在為3的pH下在延長的時間 段下保持穩定。因此由于所有其余規范符合驗收標準，影響產品的存儲壽命的最后結果的 兩種成分是L-抗壞血酸和L-谷胱甘肽，其原因在于它們的抗氧化性能。
[0080] 對于溶液而言，對于整體穩定性限制性能的理由是要保持必要的整體還原環境條 件。當溶液不再提供這項益處時，則其將不符合規范。只要一些還原型L-谷胱甘肽和L-抗壞 血酸(無論量多少）在氧化還原、平衡和溶液中仍保持處于它們的還原狀態下，就可達到還 原環境。換言之，只要L-谷胱甘肽和L-抗壞血酸分別保持在上述分析方法的檢測極限之上 即可。
[0081] 將溶液存儲在40°C下時所得到的數據使用為2的Q10因子外推到這樣的溶液的平 均5度的儲存溫度。基于該外推，可以預測到溶液B的儲存穩定性為約900天，提供至少兩年 的存儲壽命，遠遠超過行業內的要求，并遠遠超過當前配制物的穩定性。表明谷胱甘肽的濃 度的所獲得的原始數據在圖3A中示出，并且在圖3B中示出抗壞血酸和精氨酸隨時間變化的 濃度。
[0082] 實例2:
[0083]根據Q10原理，在速率常數、溫度和存儲壽命之間的關系可以表示為：
[0087] 其中kl和k2是在溫度T1和T2下以及儲存壽命SL1和SL2下的速率常數。溫度系數 Q10的值取決于反應的激活能量Ea。因此如果已知針對至少兩個不同溫度的速率常數，則可 使用上述公式來計算Q10。取決于存儲壽命的所需估計值是否分別是a)保守的 (conservative) ;b)可能且合理;或者c)不保守但卻可能，Q10的值通常為2,3或4。作為經驗 法貝IJ，為2的Q10對應于12.2千卡/摩爾的Ea，3對應于19.4千卡/摩爾的Ea，且4對應于24.5千 卡/摩爾的Ea。
[0088] 在產品監管提交(regulatory submission)的早期階段過程中，當可能尚未得到 詳細的溫度依賴性反應動力學數據時，必須對存儲壽命進行保守的估計。因此，用于降解反 應的低活化能采取為2的Q10值，以便確定產品存儲壽命的保守估計。根據該原理，反應速率 在儲存溫度每上升10度會增加大約一倍，表現出適于反應的"最有可能的活化能"。
[0089]從溶液B的兩個批次的加速研究確定適于在40°C下在溶液B中的L-谷胱甘肽分解 的一階速率常數為0.0643天4，兩個批次為:一個批次在頂部空間中具有氬氣，另一個批次 在頂部空間中沒有氬氣。這些屬性(profiles)-起在圖4中示出。一階指數衰減在下面的曲 線圖中示出，以及相應的線性對數圖在上面的曲線圖中示出。此外，在該溫度(40°C)下，適 于L-谷胱甘肽的產品規范接近其期滿約73天的極限。使用上面公式中的參數，在5°C下存儲 的存儲壽命的保守估計可使用為2的Q10值通過外推法如下估計：
[0091] 其中：
[0092] Shelf Life:存儲壽命
[0093] Days:天
[0094] Months:月
[0095] 因此從該計算可以推斷出當產品在5°C下存儲時，溶液B的存儲壽命將被預測為最 起碼為27個月。
[0096]但是在收集15個月的數據之后對在2-8°C下的三個GMP批次的溶液B的穩定性的詳 細實時研究表明，從加速研究的27個月的存儲壽命的估計值可能是非常保守的，并且實際 Q10因子是2.94。
[0097]在5°C下的實時穩定性研究迄今進展約一年左右。來自這些批次的L-谷胱甘肽降 解的可用的12-15個月的反應動力學數據可通過約1.40χ10-3天-1的速率常數擬合到一階反 應動力學。在這些速率下，L-谷胱甘肽的產品規范接近其期滿約100個月的極限。出人意料 的是，使用Q10外推技術基于40°C的加速研究所確定的存儲壽命顯著短于（27個月）由實際 實時數據所確定的存儲壽命。這種差異可基于在如下所述的Q10外推期間所做的假設而被 合理化。
[0098]在圖4中示出在65天的階段期間在40 °C /75 % RH的加速條件下所觀察到的溶液B的 溶液B中L-谷胱甘肽的降解速率。對于幾個其它批次的溶液B而言已經觀察到類似的趨勢。 在所有情況下，該反應的速率在特性(一階)方面是純指數性的，暗示相同的消逝時間賦予 分析物濃度(在這種情況下是L-谷胱甘肽的濃度)上隨所研究的時間范圍的相等分數減少。 在表3中總結出在40°C和5°C二者下對所有十一個批次研究的速率常數。從指數擬合導出的 方程中的指數值是一階速率常數κι (以天-1為單位）。在每個所研究溫度下的這些值也列于 表3中。
[0099]溫度系數Q10的為2.94的該實驗導出值高于在存儲壽命的之前計算中使用的為2 的值。Ql〇 = 2的值表示從12千卡/毫摩爾的相對低活化能產生的存儲壽命的非常保守的估 計。另一方面具有Ql〇 = 2.94的值的19千卡/毫摩爾的較高活化能意味著反應速率在儲存溫 度每上升10度會增加大約兩倍，與存儲壽命具有相應的反比關系。
[0100]通過為2.94的修正Q10值(其是針對L-谷胱甘肽分解的更具有代表性的為19.0千 卡/摩爾的真實活化能量），溶液B的存儲壽命可通過外推40 °C的存儲壽命數據和/或直接從 在5°C下的一年的實時數據的指數擬合來重新計算。修正值列于表3中。
[0101]由這兩種方法得到的結果差異通過使用Q10值為2(保守）和2.94(經驗)通過40°C 的經驗數據外推在5°C和60°C之間的各種溫度下的存儲壽命的比較中示出。結果示于表4 中。
[0103]
[0104] 因此，通過下述顯著改善存儲壽命，即通過將GALA溶液的成分分離成較高pH的平 衡鹽溶液(其任選可包括葡萄糖），并在低得多的pH下存儲有機成分，尤其是L-精氨酸、抗壞 血酸和谷胱甘肽加任選的糖。已經意外地發現，增加還原型谷胱甘肽的穩定性也增加抗壞 血酸和L-精氨酸的穩定性。兩種溶液的存儲穩定性遠遠超過商業期望或需求，使得該配制 物更可行和廣泛適用于各種不同的環境。這提供了改進的移植性能的最終結果，提高移植 物材料的細胞生存力。
[0105] 這是對本發明連同實施本發明的優選方法的描述。然而，本發明本身應只由所附 權利要求限定。
【主權項】
1. 器官和保存試劑盒，其包括： 包含在第一容器中的第一水性溶液，其中所述第一水性溶液包括平衡鹽溶液，并且所 述第一溶液具有至少為7.0的pH;和 包含在第二容器中的第二溶液，其中所述第二溶液包括水、還原型谷胱甘肽、抗壞血 酸、糖、L-精氨酸，并且所述第二溶液具有為約5.0或更小的pH。2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其中所述第一和第二容器是在單個容器內的第一和 第二腔室，以及第一和第二腔室通過隔開物從彼此分隔開，其中當移除所述隔開物時，所述 第一溶液與所述第二溶液混合以形成整體的器官和組織保存溶液。3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其中所述第一溶液的pH為約7.8以及第二溶液的pH為 約 4.0。4. 根據權利要求1所述的試劑盒，其中所述第一溶液的pH為約7.6以及第二溶液的pH為 約5 ·0〇5. 根據權利要求1所述的試劑盒，其中溶液A和/或B在膠體、軟膏、洗劑或水凝膠中配 制。6. 用于制備器官或組織保存溶液的方法，包括； 制備第一溶液，包括形成具有pH為7.6至約8.0的平衡鹽溶液； 制備pH為約3 - 5的第二溶液，所述第二溶液包括水、D-葡萄糖、L-精氨酸、谷胱甘肽和抗 壞血酸；以及 在使用時將第一溶液與第二溶液混合在一起，以形成具有pH為7.3 ± 0.4的混合溶液。7. 用于保存組織或器官的方法，包括根據權利要求6所述的方法形成溶液，并將組織或 器官與所述溶液接觸。8. 根據權利要求7所述的方法，其中所述組織或器官選自于由下述構成的組：隱靜脈、 上腹部動脈、胃網膜動脈、橈動脈、心臟、肺、腎、腦、肌肉移植物、皮膚、腸道、骨骼、附屬器 官、眼睛、以及所述組織或器官的部分。8. 用于保存器官和組織的試劑盒，其包括： 包含在第一容器中的第一水性溶液，其中所述第一水性溶液包括平衡鹽溶液和糖，并 且所述第一溶液具有從約7.6至約8.0的pH;和 包含在第二容器中的第二溶液，其中所述第二溶液包括水、L-精氨酸、還原型谷胱甘肽 和抗壞血酸，并且所述第二溶液具有為約3-5的pH。9. 根據權利要求8所述的試劑盒，其中所述第一溶液的pH為約7.6以及第二溶液的pH為 約5 ·0〇10. 根據權利要求8所述的試劑盒，其中將溶液A和/或B在膠體、軟膏、洗劑或水凝膠中 配制。11. 用于制備器官或組織保存溶液的方法，包括； 制備具有PH為約7.6至8.0的第一溶液，其包括水性平衡鹽溶液和糖； 制備PH為約3-5的第二溶液，其包括水、L-精氨酸、谷胱甘肽和抗壞血酸；以及 將第一溶液與第二溶液混合在一起。12. 根據權利要求11所述的方法，其中所述第一溶液的pH為約7.6以及第二溶液的pH為 約5 ·0〇13. 制備溶液的方法，包括將水、谷胱甘肽、L-精氨酸、糖和還原劑混合，并用緩沖劑緩 沖所述溶液，以使溶液具有為從3.0至約5.0的pH。14. 根據權利要求13所述的方法，其中糖是葡萄糖。15. 根據權利要求13所述的方法，其中所述還原劑是抗壞血酸。16. 溶液，其包括水、L-精氨酸、谷胱甘肽、糖、還原劑和緩沖劑。17. 根據權利要求16所述的溶液，其中所述糖是葡萄糖。18. 根據權利要求16所述的溶液，其中所述還原劑是抗壞血酸。19. 根據權利要求16所述的溶液，其中所述緩沖劑是鹽酸溶液。20. 器官和保存試劑盒，其包括： 包含在第一容器中的第一水性溶液，其中所述第一水性溶液包括平衡鹽溶液，并且所 述第一溶液具有至少為7.0的pH;和 包含在第二容器中的第二溶液，其中所述第二溶液包括水、半胱氨酰甘氨酸、抗壞血 酸、糖、L-精氨酸，并且所述第二溶液具有為約5.0或更低的pH。21. 根據權利要求20所述的器官保存，其中所述第二溶液進一步包括還原型谷胱甘肽。22. 用于制備器官或組織保存溶液的方法，包括； 制備第一溶液，包括形成具有為從7.6至約8.0的pH的平衡鹽溶液； 制備pH為約3 - 5的第二溶液，其包括水、D-葡萄糖、L-精氨酸、半胱氨酰甘氨酸和抗壞血 酸；以及 其中所述第一和第二溶液中之一包括糖； 在使用時候將所述第一溶液與第二溶液混合在一起。23. 根據權利要求22所述的方法，其中所述第二溶液進一步包括還原型谷胱甘肽。24. 保存活體組織的方法，包括： 將第一水性溶液與第二水性溶液混合，以形成混合溶液，其中所述第一和第二溶液中 之一包括糖； 其中所述第一水性溶液包括平衡鹽溶液且pH至少為7; 其中所述第二溶液包括水、還原型谷胱甘肽、抗壞血酸、L-精氨酸，所述第二溶液的pH 為5.0或更小；以及 將所述組織與所述混合溶液接觸。25. 根據權利要求24所述的方法，其中所述第一溶液的所述pH為約8以及所述第二溶液 的pH為約3。26. 根據權利要求24所述的方法，其中所述第一溶液的所述pH為約7.6以及所述第二溶 液的所述pH為約5。27. 根據權利要求24所述的方法，其中所述第二溶液還包括半胱氨酰甘氨酸。28. 根據權利要求24所述的方法，其中所述糖是葡萄糖。29. 根據權利要求24所述的方法，其中所述混合溶液具有為約7.3 ± 0.4的pH。30. 保存活體組織的方法，包括： 將第一水性溶液與第二水性溶液混合； 其中所述第一水性溶液包括平衡鹽溶液，所述平衡鹽溶液具有為7.6至約8.0的pH;以 及 其中所述第二溶液包括水、葡萄糖、L-精氨酸、還原型谷胱甘肽、抗壞血酸和任選的半 胱氨酰甘氨酸，所述第二溶液的pH為3-5，從而形成混合的溶液并使得所述組織與所述混合 溶液接觸。
【文檔編號】A01N1/02GK105916374SQ201480061943
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2014年11月18日
【發明人】馬亨德拉·瑟亞納
【申請人】索瑪解有限公司