一種簕欓懸浮細胞及再生植株的快速繁殖方法
【專利摘要】本發明涉及一種簕欓懸浮細胞及再生植株的快速繁殖方法，包括葉片的消毒、愈傷組織的誘導、懸浮細胞的培養、植株再生、煉苗移栽等步驟。采用本發明對簕欓進行組織培養，不受季節、氣候地域等因素的制約，節省土地，速度快，質量高，便于集約化管理和工廠化生產。
【專利說明】
一種簕攩懸浮細胞及再生植株的快速繁殖方法
技術領域
[0001]本發明涉及簕攩組織培養的快繁方法，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002]繁^,Zanthoxylumarice/wae，蕓香科，又名狗花椒、鷹不泊，常綠灌木或喬木，高可達12米，干和枝有皮刺，皮刺三角形，紅褐色，水平直出或稍向上，單數羽狀復葉，列生;小葉7-23，紙質到革質，矩圓形、倒卵狀矩圓形或為不對稱的菱形，長2-6厘米，全緣或沿中部以上有不明顯的鋸齒，無毛，上面有光澤，傘房狀圓錐花序，頂生;花小而多，淡青色;雌花較雄花稍大，無退化雄蕊，心皮2，分離至基部，果紫紅色，有粗大腺點，頂端正有極短喙。分布于福建、廣東、廣西，疏林中，具有祛風利濕，活血止痛之功效，根可治療黃疸型肝炎，腎炎水腫，風濕性關節炎;果用于治療胃痛，腹痛;葉主治跌打損傷，腰肌勞損，乳腺炎，癤腫，目前尚未發現關于簕攩繁殖技術的相關報道。
【發明內容】
[0003]本發明所要解決的技術問題是提供一種簕攩的快速繁殖方法，采用本發明對簕攩進行組織培養，不受季節、氣候地域等因素的制約，節省土地，速度快，質量高，技術密度性高，便于集約化管理和工廠化生產。
[0004]本發明所要解決的技術問題是通過以下方案來實現的:
取簕攩的葉片，在洗衣粉中浸泡2min，流水沖洗20min，超凈工作臺上2.5%次氯酸鈉處理5min，1%溴水處理5min，無菌水沖洗5遍，消毒處理過的簕攩葉片接入培養基配方為NH+IAA0.lmg/L+ZT2mg/l誘導培養基中進行愈傷組織誘導培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂5.5g/L，誘導出來的愈傷組織放入不加瓊脂的上述液體培養基配方中，110r/min旋轉搖床培養15d，建立分散性好、均勻、生長迅速的懸浮細胞系，黑暗條件下進行，溫度28± TC，pH5.8，培養條件為在40mL培養液中接種量為0.5g，18d繼代I次，繼代時保留I/3體積的舊培養液，培養出來的懸浮細胞轉移到再生培養基1/2NH+硝酸銀10-15mmol/L+0.1-0.2mg/ml活性炭中獲得再生植株，附加蔗糖35g/L，瓊脂6.5g/L，植株再生初期的體細胞胚萌發在黑暗條件下進行，待淺綠色葉鞘抽出后轉移到28土 1°C、40001x白色熒光燈下，16h/8h光周期條件下生根，簕攩試管苗生根30天后，將封口膜打開，在自然光照下煉苗7天，選取根長5cm左右且株高8cm以上的幼苗移栽至已滅菌的基質(河沙:椰絨:珍珠巖=1:1:1)中，1/2MS營養液噴灑，燒杯罩住保溫保濕，一個月后可見葉片、根明顯增長，新葉萌發。
[0005]采用本發明制備的簕攩懸浮細胞增殖率高，再生植株成活率高，能耗少，有助于簕攩的大規模開發利用。
[0006]下面將結合【具體實施方式】對本發明作進一步闡述，但本發明要求保護的范圍并不局限于下列實施方式。
【具體實施方式】
[0007]實施例1取簕攩的葉片，在洗衣粉中浸泡2min，流水沖洗20min，超凈工作臺上2.5%次氯酸鈉處理5min，1%溴水處理5min，無菌水沖洗5遍，消毒處理過的簕攩葉片接入培養基配方為NH+ IAA0.lmg/L+ZT2mg/L誘導培養基中進行愈傷組織誘導培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂5.5g/L， 誘導出來的愈傷組織放入不加瓊脂的上述液體培養基配方中，ll〇r/min旋轉搖床培養15d， 建立分散性好、均勻、生長迅速的懸浮細胞系，黑暗條件下進行，溫度28±l°C，pH5.8,培養條件為在40mL培養液中接種量為0.5g，18d繼代1次，繼代時保留1/3體積的舊培養液，培養出來的懸浮細胞轉移到再生培養基1/2NH+硝酸銀10mmol/L+0.1mg/mL活性炭中獲得再生植株，附加蔗糖35g/L，瓊脂6.5g/L，植株再生初期的體細胞胚萌發在黑暗條件下進行，待淺綠色葉鞘抽出后轉移到28土 rC、40001x白色熒光燈下，16h/8h光周期條件下生根，簕攩試管苗生根30天后，將封口膜打開，在自然光照下煉苗7天，選取根長5cm左右且株高8cm以上的幼苗移栽至已滅菌的基質(河沙:椰絨:珍珠巖=1:1:1)中，1/2MS營養液噴灑，燒杯罩住保溫保濕，一個月后可見葉片、根明顯增長，新葉萌發，再生成活率87%。
[0008]實施例2取簕攩的葉片，在洗衣粉中浸泡2min，流水沖洗20min，超凈工作臺上2.5%次氯酸鈉處理5min，1%溴水處理5min，無菌水沖洗5遍，消毒處理過的簕攩葉片接入培養基配方為NH+ IAA0.lmg/L+ZT2mg/L誘導培養基中進行愈傷組織誘導培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂5.5g/L， 誘導出來的愈傷組織放入不加瓊脂的上述液體培養基配方中，ll〇r/min旋轉搖床培養15d， 建立分散性好、均勻、生長迅速的懸浮細胞系，黑暗條件下進行，溫度28±l°C，pH5.8,培養條件為在40mL培養液中接種量為0.5g，18d繼代1次，繼代時保留1/3體積的舊培養液，培養出來的懸浮細胞轉移到再生培養基1/2NH+硝酸銀15mmol/L+0.2mg/mL活性炭中獲得再生植株，附加蔗糖35g/L，瓊脂6.5g/L，植株再生初期的體細胞胚萌發在黑暗條件下進行，待淺綠色葉鞘抽出后轉移到28土 rC、40001x白色熒光燈下，16h/8h光周期條件下生根，簕攩試管苗生根30天后，將封口膜打開，在自然光照下煉苗7天，選取根長5cm左右且株高8cm以上的幼苗移栽至已滅菌的基質(河沙:椰絨:珍珠巖=1:1:1)中，1/2MS營養液噴灑，燒杯罩住保溫保濕，一個月后可見葉片、根明顯增長，新葉萌發，再生成活率90%。
[0009]實施例3取簕攩的葉片，在洗衣粉中浸泡2min，流水沖洗20min，超凈工作臺上2.5%次氯酸鈉處理5min，1%溴水處理5min，無菌水沖洗5遍，消毒處理過的簕攩葉片接入培養基配方為NH+ IAA0.lmg/L+ZT2mg/L誘導培養基中進行愈傷組織誘導培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂5.5g/L， 誘導出來的愈傷組織放入不加瓊脂的上述液體培養基配方中，ll〇r/min旋轉搖床培養15d， 建立分散性好、均勻、生長迅速的懸浮細胞系，黑暗條件下進行，溫度28±l°C，pH5.8,培養條件為在40mL培養液中接種量為0.5g，18d繼代1次，繼代時保留1/3體積的舊培養液，培養出來的懸浮細胞轉移到再生培養基1/2NH+硝酸銀10mmol/L+0.2mg/mL活性炭中獲得再生植株，附加蔗糖35g/L，瓊脂6.5g/L，植株再生初期的體細胞胚萌發在黑暗條件下進行，待淺綠色葉鞘抽出后轉移到28土 rC、40001x白色熒光燈下，16h/8h光周期條件下生根，簕攩試管苗生根30天后，將封口膜打開，在自然光照下煉苗7天，選取根長5cm左右且株高8cm以上的幼苗移栽至已滅菌的基質(河沙:椰絨:珍珠巖=1:1:1)中，1/2MS營養液噴灑，燒杯罩住保溫保濕，一個月后可見葉片、根明顯增長，新葉萌發，再生成活率94%。
【主權項】
1.一種簕攩懸浮細胞及再生植株的快速繁殖方法，包括葉片的消毒、愈傷組織的誘導、 懸浮細胞的培養、植株再生、煉苗移栽，其主要步驟如下:(1)取簕攩的葉片，對其進行消毒處理；(2)將步驟(1)消毒處理過的簕攩葉片接入培養基配方為NH+IAA0.1mg/L+ZT2mg/L誘導 培養基中進行愈傷組織誘導培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂5.5g/L;(3)取步驟(2)誘導出來的愈傷組織放入不加瓊脂的上述液體培養基配方中，llOr/min 旋轉搖床培養15d，建立分散性好、均勻、生長迅速的懸浮細胞系；(4)取步驟(3)培養出來的懸浮細胞轉移到再生培養基1/2NH+硝酸銀10-15mmol/L+ 0.1-0.2mg/ml活性炭中獲得再生植株，附加蔗糖35g/L，瓊脂6.5g/L;(5)步驟(4)獲得的再生植株進行煉苗移栽。2.按照權利要求1所述的一種簕攩懸浮細胞及再生植株的快速繁殖方法，其特征在于: 步驟(1)中所述簕攩無菌葉片的獲得為，取簕攩的葉片，在洗衣粉中浸泡2min，流水沖洗 20min，超凈工作臺上2.5%次氯酸鈉處理5min，1%溴水處理5min，無菌水沖洗5遍。3.按照權利要求1所述的一種簕攩懸浮細胞及再生植株的快速繁殖方法，其特征在于: 步驟(2)和(3)中愈傷組織誘導、懸浮細胞培養、體細胞胚的誘導均在黑暗條件下進行，溫度 28±l°C，pH5.8。4.按照權利要求1所述的一種簕攩懸浮細胞及再生植株的快速繁殖方法，其特征在于: 步驟(3)懸浮細胞的培養條件為在40mL培養液中接種量為0.5g，18d繼代1次，繼代時保留1/ 3體積的舊培養液。5.按照權利要求1所述的一種簕攩懸浮細胞及再生植株的快速繁殖方法，其特征在于: 步驟(4)中植株再生初期的體細胞胚萌發在黑暗條件下進行，待淺綠色葉鞘抽出后轉移到 28± 1°C、40001x白色熒光燈下，16h/8h光周期條件下生根。6.按照權利要求1所述的一種簕攩懸浮細胞及再生植株的快速繁殖方法，其特征在于: 步驟(5)煉苗移栽的方法為簕攩試管苗生根30天后，將封口膜打開，在自然光照下煉苗7天， 選取根長5cm左右且株高8cm以上的幼苗移栽至已滅菌的基質(河沙:椰絨:珍珠巖=1:1:1) 中，1/2MS營養液噴灑，燒杯罩住保溫保濕，一個月后可見葉片、根明顯增長，新葉萌發。
【文檔編號】A01H4/00GK106069759SQ201610455631
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月22日
【發明人】楊成東
【申請人】南京澤朗生物科技有限公司