專利名稱：鑒定植物抗青枯病能力的水培接菌法的制作方法
技術領域：
本發明是鑒定植物抗青枯病能力的水培接菌法，屬植物保護鑒定技術。
青枯病屬于郎氏假單孢菌(Ralstonia solanacearum)，是一種重要的土傳植物維管束萎蔫病原細菌，全球分布十分廣泛，特別以熱帶、亞熱帶地區發生最為嚴重，一些溫帶地區也有受害報道。我國南方及東南亞地區是世界上青枯病發生的重災區，每年因此病損失近十億美元。青枯菌的寄主范圍很廣，據報道茄科的番茄、煙草、辣椒、茄子、馬鈴薯以及生姜、甘薯、花生和木本植物的油橄欖、桑樹、木麻黃等均是其寄主。美國學者Kelman(1951)首次系統報道了該病的發生、發展及其危害性。此后各國科學家都從各個學科開展了對該病的深入研究，經過半個多世紀的努力，人們對該病從病理學、生理學、遺傳學、分子生物學、生物物理學以及預防科學方面有了深入和統一的認識，為防治青枯病的發生，提高作物產品的產量和質量有了科學的依據。在植物保護的實驗研究中，青枯菌的接種技術(也稱作感染方式)也經歷了一個較長的研究過程。認識到青枯菌是一種土傳病菌，人們首先通過根系感染使植株接觸病菌，使其發病，觀察其發病時間遲早和長短、傷害程度，以此評價植株對該病的抵抗能力(抗病性)。通常使用方法有菌液灌根(包括傷根和不傷根)法、浸根法。所使用的菌液濃度則根據作物的抗病力或不同實驗目的，從1×106～1×108個菌/毫升不等；為了加快對植株的傷害，又研究出針刺葉脈(或葉腋)法，菌液濃度從1×106～1×107個菌/毫升不等；到目前為止，青枯菌的接菌感染技術不外乎上述三種。對方法的使用描述得較為詳細的有美國的G.C.Somodi等發展的文章《Comparison ofInoculation Techniques for Screening Tomato Genotypes for Bacterial WiltResistance》(番茄不同基因型青枯病抗性篩選的接菌感染技術比較)(Proceedings of An International Conference Taiwan，28-31 October 1992EditorsG.L.Hartman and A.C.Hayward)(國際會議論文集臺灣1992年10月28日～31日)以及王卉、任欣正發表的《青枯菌(Pseudomonas solanacearum)在番茄抗、感病品種根部的吸附、侵入和繁殖》。這三種方法一直沿用至今。作物抗青枯病育種工作者在實踐中發現，三種方法都存在不夠理想的地方。在自然界和生產實踐中，病原菌是從植株根部侵入植物體內并由此引起發病的，根系結構、內在在物質以及它與病原菌的共扼關系，可能對病菌的入侵和繁殖有關系。針刺法僅是在植株的葉片或葉液部位注入病菌，使植株在該部位首先發病，此方法的嚴重不足之處，是它不能完全反映出植物的抗病特性，因此，這一方法多用于鑒定青枯菌致病能力和寄主范圍的研究；在作物抗病育種的操作上，多采用菌液灌根、浸根法，它的特點是使植株能按照自然發生規律受到感染和發病。但是由于土壤中微生物種類有近百種，特別是有些土壤病原真菌其致病力遠比青枯菌強得多，如番茄的立枯病、辣椒的疫病、煙草的黑莖病、茄子花生的枯萎病等，對試驗結果干擾很大，如何減少其它病原菌的干擾一直是探討的內容之一。土壤消毒、水旱輪作等都是有效途徑，但其工作量大，準備時間長，實際操作時受到限制。加上土壤的物理性狀很難一致，故重復性差。
本發明目的就是為了克服和解決現有鑒定植物抗青枯病能力的接菌技術方法存在針刺法不能完全反映出植物的抗病特性或菌液灌根、浸根法土壤病原真菌對試驗結果干擾太大，而對土壤消毒、水旱輪作雖可減小干擾，而存在工作量大、時間長、實際操作困難、重復性差、鑒定準確性、可靠性差等的缺點和問題，研究發明一種能完全反映出自然發病客觀實際，真正能體現作物對青枯病抗病特性而操作上又簡單易行、試驗條件容易控制、試驗重復性好、鑒定準確性可靠性高的鑒定植物抗青枯病能力的水培接菌法。
本發明是通過下述技術方案來實現的它是根據植物和青枯菌在一定的物質條件下能夠在水中正常生長的特性，對兩個生物體的生長條件進行人工控制，使青枯病在水中吸附到植株根系，通過傷口進入根部進而繁殖并傷害植株；其關鍵在于(一)把青枯菌感染植物的接菌操作從在土壤里改為在水中；(二)兩個生物體從培養、生長到發病的這個時段都受到人工控制，做到條件完全一致；其具體準備工作和技術操作流程如下(1)準備工作如下①準備一批盛水的容器——水培池，上面配有支撐植株生長的設施；②配備一批控制生物體生長的儀器如水族箱水泵、控溫儀(包括探頭)、定時器等，如試驗在冬季進行應配備發熱絲；③一批適合接菌——4～8片真葉的植株幼苗，一般每個重復20株；④植物生長營養液，使用時則根據植物種類的不同進行選擇和調整；⑤達到一定濃度經過活化的青枯菌；⑥環境條件可作人工控制的建筑物，如溫室、大棚等；(2)技術操作流程如下①往水培池注入單蒸餾水或經過滅菌處理的自來水；②添加MS營養液，最終濃度為10％，每10天左右補充1次營養液；③在支撐板的孔內栽上供接菌用的幼苗，使根系接觸營養液至少4厘米；④小水泵開始以10～20分鐘/每小時的泵水增氧，水溫控制在27±1.5℃，室溫28～32℃；⑤植株在上述條件下預培養3天，注入青枯菌，最終濃度為5×107～1×108個菌/毫升，可根據試驗需要作調整；⑥植株在接菌5天后開始表現發病癥狀，再按常用方法調查發病情況至試驗結束。試驗結果表明不同作物品種水培法接種青枯菌后的發病情況與田間的菌液灌根、浸根法表現的抗病特性比較一致。如表1所示。
表1
本發明的實用性在于(1)采用能夠使供試植株感病的接菌濃度(1×106～1×108個細菌/毫升)，以及青枯菌增殖的培養方法；(2)采用植株最容易感病的物候期——幼苗4～8片真葉期，實驗條件能滿足植物生長和發病的要求；(3)所使用的一切儀器、設備、用具、藥物、試劑，都可以在市場上買得到，而且價錢便宜。比如，做一個容積為140×90×10cm(水深5cm時水的容積為83升)的水培養池(包括有120個盛放植株的圓孔的蓋板)，所用的泡沫板和木板，僅需100元；水族箱小水泵50元/個，控溫儀200元/個，定時器60～120元/個，發熱絲20元/池，植物營養液約需200元/套(可用多次)，定植杯(插在蓋板孔內支撐植株生長的有孔塑料杯)12元/池·120個，培養青枯菌的用具一般從事植保工作的單位都已具備，如無菌操作間或超靜工作臺，30±2℃恒溫培養箱，培養皿或試管，滅菌設備如手提式高壓滅菌鍋，檢測菌液濃度的分光光度計，比濁管等，再配上照明和控制室溫設備(如果需要的話)。這樣，總的費用僅需1500元(植保用具除外)。
本發明與現有技術相比具有如下的優點和有益效果(1)應用本發明方法實施植物抗青枯病鑒定，由于對水質作了嚴格控制，避免了其它有害微生物的干擾，實驗準確性可靠性高。它克服了土壤接菌時容易發生的其它病菌引起發病對實驗準確性的影響，特別對較大規模的試驗更是如此；(2)本發明的方法糾正了針刺接菌法未能完全體現植物抗病特性的不足，讓植株能在模擬自然環境條件下，在與病菌的共同生活與抗爭中表現出應有的反應機制；(3)本發明方法是在可以人工控制的情況下進行的，實驗重復性好；同時時間大大縮短，并全年可多次進行重復試驗。以上這些優點和有益效果可以從以下實驗數據得到證明①植物根系在水中生長必須有充足的氧氣。根據規定，水中飽和溶氧量28℃時為7.75毫克/升，29℃時為7.64毫克/升。實驗中，探頭位置為入水深約30毫米時探得通氣8分鐘／小時水中溶氧量為6.80～6.98毫克/升，通氣15分鐘/小時為6.97～7.27毫克/升。每小時通氣10～20分鐘能滿足植物在水中生長的要求；②分別將4～6片真葉的番茄、煙草、辣椒幼苗移栽于MS水培液中，15天后調查株高凈增長量&#60培養15天后實際高度一培養前高度(10株平均值)&#62番茄為9.7厘米，煙草為3.8厘米，辣椒為6.1厘米，分別是土壤中生長為對照的110、95.8和101％，屬于正常；③液體培養的青枯菌對植物有強致病力，番茄的發病率分別為99.11％和91.24％，煙草為69.45％和69.20％，辣椒為84.45％和87.50％(4次重復平均)；④如表1所示的試驗結果表明，不同作物品種水培法接種青枯菌后的發病情況與田間表現的抗性比較一致。青枯病發病率試驗表明，應用本發明方法完全能夠正確反映植物對青枯病的抗病特性，本發明方法更能反映事實的本質，它的準確性可靠性高、效果好、方法簡單、見效快、成本低。
本發明的實施方式比較簡單，只要按上面說明書所述的技術方案——具體的準確工作和技術操作流程進行逐步操作，便能較好地實施本發明①其實施過程中，其設備及材料均可在市場選購選用，例如水族箱水泵可選SUBMERGED LIQUID FILTER，13W；控溫儀(包括探頭)可選上海醫用儀表廠生產的WMZK-01型溫度指示控溫儀；定時器可選廣東佛山偉力公司生產的GB-60型間歇開關電器；植物生長營養液可選用的有很多，如N6(Nitch-6尼許培養基)、B5(Burger-5伯格培養基)、Hoagland(霍格蘭營養液)、Moore(摩爾營養液)或以MS(Murasige&Skoog)營養液為基礎，按不同植物需要作適當調整配料；無菌操作間的滅菌設備可選用上海醫用核子儀器廠生產的YXQ·SG41·280A型；檢測菌液濃度的分光度計可選用上海化學分析儀器廠生產的光波長650納米的7210型；②發明人經過多年的研究和大量試驗，按照說明書所述的技術操作流程步驟進行操作已有很多成功的實施例。如表1所示是其實施試驗結果之一。試驗證明了本發明的先進性、準確性高、可靠性高、方法簡單、見效快、成本低。
權利要求
1.一種鑒定植物抗青枯病能力的水培接菌法，其特征在于它是根據植物和青枯菌在一定的物質條件下能夠在水中正常生長的特性，對兩個生物體的生長條件進行人工控制，使青枯病在水中吸附到植株根系，通過傷口進入根部進而繁殖并傷害植株；其關鍵在于(一)把青枯菌感染植物的接菌操作從在土壤里改為在水中；(二)兩個生物體從培養、生長到發病的這個時段都受到人工控制，做到條件完全一致；其具體準備工作和技術操作流程如下(1)準備工作如下①準備一批盛水的容器——水培池，上面配有支撐植株生長的設施；②配備一批控制生物體生長的儀器如水族箱水泵、控溫儀、定時器等，如試驗在冬季進行應配備發熱絲；③一批適合接菌——4～8片真葉的植株幼苗，一般每個重復20株；④植物生長營養液，使用時則根據植物種類的不同進行選擇和調整；⑤達到一定濃度經過活化的青枯菌；⑥環境條件可作人工控制的建筑物，如溫室、大棚等；(2)技術操作流程如下①往水培池注入單蒸餾水或經過滅菌處理的自來水；②添加MS營養液，最終濃度為10％，每10天左右補充1次營養液；③在支撐板的孔內栽上供接菌用的幼苗，使根系接觸營養液至少4厘米；④小水泵開始以10～20分鐘/每小時的泵水增氧，水溫控制在27±1.5℃，室溫28～32℃；⑤植株在上述條件下預培養3天，注入青枯菌，最終濃度為5×107～1×108個菌/毫升，可根據試驗需要作調整；⑥植株在接菌5天后開始表現發病癥狀，再按常用方法調查發病情況至試驗結束。
全文摘要
本發明是鑒定植物抗青枯病能力的水培接菌法,它是對兩個生物體的生長條件進行人工控制,使青枯菌在水中吸附到植株根系,通過傷口進入根部而繁殖并傷害植株。其包括具體準備工作:準備水培池;配備一批控制生物體生長的儀器;配備適合接菌植株幼苗;配備營養液,經活化青枯菌及溫室等;其操作流程:往水培池注滅菌水→添加營養液→栽供接菌用幼苗→泵水增氧、控溫→注入青枯菌→調查發病情況。本發明重復性好、準確性可靠性高、方法簡單、容易操作、時間短、見效快、成本低。
文檔編號C12Q1/18GK1287175SQ0011740
公開日2001年3月14日 申請日期2000年9月8日 優先權日2000年9月8日
發明者李乃堅, 譚炳安 申請人:廣東省農業科學院蔬菜研究所, 華南農業大學