改變植物開花時間的方法

專利名稱：改變植物開花時間的方法
技術領域：
本發明涉及通過基因工程改變植物的開花時間。具體地說，本發明涉及通過操控開花基因座(FLC)基因家族的活性來控制開花時間。
背景技術：
植株由營養性生長轉向開花是植株生命周期中一個重要的發育轉變。開花的開始時間對于野生型植物的成功繁殖至關重要，大多數植物都已進化形成了可準確調節開花時間的系統。這些系統同時監測環境信號和植物的發育狀態，從而控制開花過程。
所監測的兩種常見環境信號是光周期和溫度。在光周期響應性植物中，由葉子感知日照時間，開花信號似乎是由葉子轉移到分生組織的(Zeevaart，光與開花過程，Process，eds.，D.Vince-Prue，B.Thomas&K.E.Cockshull，137-142，AcademicPress，Orlando，1984)。低溫可通過被稱為春化作用的過程促進開花。春化直接作用于分生組織，可能是通過使得它們能夠認知開花信號發揮作用(Lang，植物生理學百科，ed.，W.Ruhland，15(第1部分)，1371-1536，Springer-Verlag，Berlin，1965)。其他可影響開花的環境信號包括光的質量和營養狀況。
植物的發育狀態也會影響開花時間。大多數植物都會經歷一個開花被抑制的不成熟期，最后過渡到成熟期，此時植物已具備了開花的條件(Poethig，科學，250，923-930，1990)。“階段轉變”使得植物可達到適當的大小以適合開花繁殖。
在談到開花時，發育性的開花途徑通常指自發性的，以表示與環境改變無關。然而，自發性和環境性途徑不可能完全割裂。例如，煙草中的日-中性品種在形成一定數量結瘤后開花，因而可歸為完全通過自發途徑開花的品種，但是，嫁接研究發現，日-中性和光周期響應性煙草對類似的可轉移開花信號有響應(Lang等，美國科學院院報，74，2412-2416，1977；McDaniel等，植物雜志，9，55-61，1996)。因此，這些途徑潛在的生物化學反應似乎是保守性的。
對幾個品種的基因分析已鑒定到了影響開花時間的基因。對開花時間基因最廣泛的基因研究是對擬南芥進行的。在擬南芥中，曾用兩種方法鑒定了開花時間基因。方法之一是在早開花的品種內誘導會影響開花時間的突變。這樣的突變會延遲開花，或使得開花更早。延遲開花的突變鑒定其野生型作用為促進開花的基因，提早開花突變鑒定抑制開花的基因。以擬南芥進行的研究已鑒定了20個以上經突變可特異性地影響開花時間的基因座，以及影響開花又影響其他發育過程的其他幾個基因座(例如，det2，copl，gal和phyB)(Koornneef等，植物生理學植物分子生物化學年度回顧，49，345-370，1998；Weigel，遺傳學年度回顧，29，19-39，1995)。
鑒定開花時間基因的另一種方法是確定自然發生的開花時間改變的基因基礎。雖然實驗室常用的擬南芥品種是早開花型的，但大多數擬南芥是晚開花型的。晚開花品種與早開花品種的區別之一在于，晚開花品種在兩個基因座FRIGIDA(FRI)開花基因座(FLC)處具有抑制開花的顯性等位基因(Sanda等，植物生理學，111，641-645，1996；Lee等，植物學雜志，6，903-909，1994；Clarke等，分子基因遺傳學，242，81-89，1994；Koornneef等，植物學雜志，6，911-919，1994)。
對開花時間突變株和對開花時間自然改變的生理學研究發現，在擬南芥中，開花受到多種途徑的控制(Koornneef等，植物生理學植物分子生物學年度回顧，49，345-370，1998)。一組晚開花突變體(fca，fpa，fve，fy，ld)和含有晚開花FLC和FRI等位基因的植株表現為在誘導條件下(長日照)開花延遲，日照短時，則延遲更嚴重。對這些晚開花品系的春化可抑制晚開花表型。另一組晚開花突變體(co，fd，fe，fha，ft，fwa，gi)在短日照和長日照條件下培養的開花時間幾乎沒有差異。而且，該組對春化也幾乎沒有反應。同組雙突變株與單突變親本相比，開花并未顯著延遲，但各組一個的雙突變株則開花遲于單突變的親本(Koornneef等，遺傳學，148，885-92，1998)。因此，似乎存在著平行的開花途徑，介導對于環境和發育信號的開花響應。光周期途徑在長日照時促進開花。文獻中稱為自發性的途徑(因為光周期響應不受途徑中突變的影響)似乎控制著開花的年齡，更具體地說是能夠開花發育階段。最近有信息可支持該途徑在發育方面的作用，即，自發性途徑突變株表現出諸如毛狀體改變之類變化，表明這樣的突變株由不成熟向成熟的轉變延遲(Telfer等，發育，124，645-654，1997)。
因fca，fpa，fve，fy，ld等位基因突變或因存在顯性的晚開花FLC和FRI等位基因而造成的自發性途徑阻滯可被春化作用避繞(Koornneef等，植物生理學植物分子生物學年度回顧，49，345-370，1998)。因此，可將FLC和FRI看作造成春化需求的基因。其他品種，尤其是蕪菁，似乎有著與擬南芥相同的“周期”。在對蕪菁內開花顯性抑制和春化劑之間關系的分析中，對這種相似性進行了最全面的分析。油籽蔓菁和蕪菁一年生品種和兩年生品種的主要區別來自于控制春化響應性開花時間的基因(Osborn等，美國遺傳學協會，146，1123-1129，1997)。比較蔓菁和蕪菁一年生和兩年生品種分離種群的數量性狀基因座(QTL)發現，2個主要QTL賦予蔓菁春化響應性晚開花特征，蕪菁可能也是如此(Osborn等，美國遺傳學協會，146，1123-1129，1997)。在蕪菁中，這兩個開花時間QTL在重組近交種群中是分開的，對開花時間影響最大的QTL是VFR2(蕪菁2中的春化響應性開花時間)。而且，VFR2似乎對應于擬南芥的FLC用雜交探針制定VFR2的高分辨率圖譜，由此可在晚期等位基因滲入早開花一年生品種后進行擬南芥和蕪菁之間的比較，只有對應于FLC的探針監測到VFR2(＜0.44cm)沒有發生重組，這說明VFR2是FLC的類似物。
開花時間對農業和園藝來說至關重要。園藝作物通常以其花朵作為產品。例如稻米、小麥、玉米、大麥和燕麥等食物、飼料或纖維作物，以及大豆、低芥酸菜籽和棉花等雙子葉植物，以及向日葵、西紅柿、椰菜及其他豆科植物，通常以它們的花朵或開花后的結果--果實、種子或種莢作為產品。了解開花時間調控的分子機制將可以通過基因操作改變開花時間，優化花朵、果實和種子的生產。例如，在某些作物中提早開花將可以在生長季節過短的地區種植該作物，或者在目前只可以種植一種作物的地區種植多種作物。
在另一些作物中，有用的是植株的非開花部分。在這樣的作物中，避免或延遲開花時間可提高這些有用部分的得率。此類植物的例子包括紫花苜蓿和三葉苜蓿等飼料，卷心菜等芥菜、菠菜和萵苣等蔬菜。在甜菜或土豆等使用地下部分的作物中，延遲或避免開花可提高得率。而且，避免甜菜開花還可以使得能量更多地用于產糖。同理，延遲開花也可以提高木料或植株體作物的得率。因此，理解開花時間控制的分子機制不僅有必要，而且具有重要意義。
發明概述本發明包括了一族基因，即開花基因座(FLC)基因，它們是開花抑制的重要調控因素。本發明包括這些基因的DNA序列，及這些基因表達的多肽和蛋白質。
本發明還涉及轉基因植物，它們因具有影響FLC蛋白質活性的水平及時機的轉基因，與同種的非轉基因植株相比改變了開花特性。
本發明的目的之一是提供可創造出新的植物品種的一種工具，從而可改變植物的開花時間。可根據種植者的需要，通過改變植物內FLC基因的水平，將開花時間提前或延遲。
這可以使得植物經修飾而變得非常有用。因為開花是開花植物一個重要生理階段，所以，能夠控制開花時間將可以促進其營養性生長或開花，從而更復合需要。
通過以下說明和附圖，本發明的其他優點和特征將變得更明顯。
附圖簡述


圖1是植物基因中MADS盒成員之間相關程度的系統發生圖。
詳細描述本發明涉及植物開花基因座(FLC)基因家族基因的核苷酸和蛋白質序列。如后文所述，植物的基因組內通常有一個以上FLC基因。然而，FLC基因之間相似或同源。本發明發現用這些基因可產生改變開花特征的轉基因植物。有了本發明對FLC基因的認識，就可以通過抑制FLC活性提早轉基因植物的開花時間，或通過提高FLC活性延遲開花時間。這就為種植者和育種者提供了一種獨特的工具，從而可改變作物的開花時間特征使之更符合種植者的需要。
以下是幾個FLC基因的核苷酸序列和氨基酸序列。本發明的工作是由從擬南芥中分離出基因FLC1并進行測序開始的。利用這一信息以及其他基因信息發現了后文中的其他幾個FLC基因。結果發現，擬南芥(因為其基因組是植物中最小的之一，所以在植物遺傳實驗室中研究較多)具有至少3個FLC基因，在此稱為FLC1，FLC2和FLC3。利用擬南芥中這3個FLC基因的信息，目前已鑒定了蕓苔屬的2個FLC基因。這些基因有幾個特征與所有其他植物的FLC基因是共同的。
FLC基因屬于一類所謂MADS盒基因。MADS盒是一段高度保守的基序，為一組進化相關轉錄因子所共有。MADS是首次鑒定出具有MADS盒共有序列區的原基因的首字母縮寫。至今已鑒定到許多MADS盒基因，目前正致力于進一步將這些基因區分成亞組。在植物中，MADS盒基因被認為影響著植物發育的許多方面，包括結構性發育。本發明鑒定的2個FLC基因(擬南芥FLC2和FLC3)曾是過去擬南芥基因組測序的一部分，但是其功能是此前未知的。
圖1采用了原由Martin Yanofsky和Elean Alvarez-Buylla，UC San Diego匯總的數據，是說明迄今為止在擬南芥和玉米中鑒定的MADS盒蛋白質之間相關程度的系統發生樹。值得注意的是，本發明鑒定的3個FLC基因的彼此關系比它們與任一其他MADS盒基因都更緊密。
后文序列表中列出的是擬南芥FLC1、FLC2和FLC3，以及蕪菁BrFLC1A和BrFLC1B的cDNA序列，和推導氨基酸序列。還有一些序列比較數據。這些數據表明擬南芥的FLC1和FLC2在其全長范圍內的相同性為60％，除MADS盒基因以外全部區域的相同性仍在50％以上。后一比較更重要，因為所有MADS區的MADS盒基因之間本身具有較高的保守性。為了進行這一項分析，MADS盒區被認為是蛋白質序列氨基端的前60個氨基酸。這種序列相似性程度似乎是跨種類的。實際上，蕓苔屬基因BrFLC1A和BrFLC1B與FLC1的相似性大于FLC1與FLC2相似性。MADS盒之外FLC2與蕓苔屬基因的相同性略低于50％，所以，一般認為FLC基因家族變體間氨基酸水平上的相同性高于40％。因此，除MADS盒區之外氨基酸相同性高于40％是FLC基因家族成員的表征之一。
再次看
圖1系統發生樹，重要的是本發明鑒定的3個擬南芥FLC基因的彼此關系比它們與其他擬南芥BADS盒基因之間的更緊密。因為據信對MADS盒基因已完全了解(至少根據近期完成的擬南芥全基因組測序)，所以可以用常規序列分析方法及匹配軟件，從圖中得出任一新測序的基因與
圖1所示MADS盒家族成員之間的關系。FLC基因家族成員是，根據系統發生圖分析，與擬南芥FLC1、FLC2和FLC3的關系比其與任一其他擬南芥MADS盒基因更緊密的基因。
確認某基因是FLC基因族成員的方法之一是測定該基因對開花時間的影響。后文實施例描述了證明FLC基因實際上延遲轉基因植物開花的試驗。以擬南芥為模型，通過測試一個可能的FLC基因是否在轉基因植物中具有類似的效果，可確認其他植物種類推定FLC基因的活性。
需要強調的是，以上工具所實現的是對植物開花時間的改變。FLC的正常功能是延遲或抑制開花。然而，獲得FLC基因的序列可使得植物的開花時間向兩個方向改變。目前已有數種方法可下調或上調某內源性植物基因的表達。要下調基因表達，可在植物內插入一段該基因編碼序列的反義鏈，或者可通過共同抑制來下調基因表達水平，這是一種知之尚少的現象，即，一段人造基因構建物的插入有時會引起對該插入基因及與之同源的其他基因的抑制。要上調植物基因，可通過植物基因組的胚系轉化，在植株內引入此基因的額外拷貝，或通過選擇強度和特性適當的植物啟動子，提高植物細胞內和組織內天然基因所產生蛋白質的活性水平。
需要理解的是，目前植物基因工程的水平以可以將任意基因構建物引物任何有用的植物品種。然而，這一過程仍具有一定隨機性，最主要的是，外源DNA插入植物基因組仍是在植物基因組內任意位置發生的。結果，在植物轉化所得的任何一組植株中，不同的基因插入的結果有時會差異極大。例如，就單基因插入某內源性植物基因的另一拷貝而言，所得許多植株的該內源性蛋白質活性會略有提高，另一些則沒有可測知的改變，甚至可測得所述活性的降低，而有少數的活性則顯著提高。然而，這種變數并不意味著不可能獲得穩定的結果，因為對每一具體的基因插入來說，代與代之間的結果傾向于一致。因此，高活性植株具有的有效的高活性等位基因可通過正常的孟德爾遺傳傳遞給它們的后代。
為了制造轉基因植物，正如本領域技術人員所知的，需要在植株內制造一個能夠表達插入的蛋白質編碼序列(外源或內源)的基因構建物。還需要將該基因構建物插入所述植物的方法。
目前已知許多制造可在植物內表達蛋白質的基因構建物的工具和技術。欲在植物細胞內表達多肽或蛋白質的基因構建物必需包含編碼蛋白質的DNA序列，該序列決定在所得植物內所表達的多肽或蛋白質的序列。欲在植物內表達多肽或蛋白質的蛋白質編碼序列必需置于植物可表達啟動子的調控之下，并后接一段植物轉錄終止序列，又稱聚腺苷酸序列。植物可表達啟動子即如下啟動子在植物內有效，來自植物或來自植物病原例如病毒(例如煙草花葉病毒)或細菌(例如農桿菌啟動子，如胭脂氨酸合成酶啟動子)。來自病原的啟動子多為組成型啟動子，即它們能始終在植株的所有組織內表達蛋白質編碼序列。其他植物啟動子則被認為是組織特異性的(例如果實或花朵特異性)或發育特異性(例如對植物生命周期的某一階段具有特異性，例如出芽期特異性或衰老特異性)，另一些則是誘導型的(例如熱休克或金屬離子誘導型啟動子)。這些類型的啟動子都可根據預期對所得轉基因植物的預期作用用于本發明。
并非所有基因構建物都是用來在轉基因植物細胞內生產多肽或蛋白質。如果操作的目的是降低植物內靶蛋白的活性水平，則可能希望基因構建物在植物內降低內源性蛋白質水平而不是生產蛋白質。為此目的的一種著名方法是反義技術，即形成一基因構建物，在植物細胞內合成一段mRNA，它與靶基因表達時產生的mRNA的某些部分互補。反義RNA干擾靶mRNA的翻譯，由此降低該植物內蛋白質的生產。
已證明有數種方法可將基因插入植物形成轉基因植物。使用最廣，說明最全面的是農桿菌介導轉化或加速粒子介導轉化。各種農桿菌介導植物轉化技術利用了植物病原農桿菌將細菌質粒DAN轉移到植物細胞基因組內的能力。粒子介導植物轉化技術使用一加速裝置(通常為基因搶)加速包有DNA的粒子，使之進入植物細胞。對于以上兩種方法還需要輔以其他技術，從而可由轉化細胞得到完全成熟的、形態正常的植株。因此，這些技術通常都包括鑒定轉化細胞的選擇或篩選方法，以及從單個轉化細胞再生成完整植株的方法。如上所述，這些技術已被證明適用于多種植物，并適用于多種幾乎所有具有經濟價值的植物品種。也可用其他技術，例如電穿孔來形成轉基因植物。但就本發明而言，具體的植物轉化技術并不重要。植物只要經基因工程改造成為轉基因植物，轉化原植物的方法就變得無關緊要。然后，已插入植物基因組的轉基因就可以通過經典植物育種法的一般規則被第一代基因工程植株的后代完全繼承。“轉基因”在此指靶植物細胞所攜帶的插入基因構建物。因此，“轉基因植物”在此指帶有這種轉基因的植物。
本發明揭示了有關一組植物基因，即FLC基因的信息。雖然這些基因此前已經以其天然或改變狀態存在于植物內，但本發明首次將它們分離了出來。“分離形式”表示這些基因從其宿主植株內被分離出來。由此，可以獲得有關這些基因的信息并用于對基因極其元件的體外操作，從而創建多種用途的基因構建物。用途之一就是形成轉基因植物。另一種用途是對轉基因或非轉基因植物的診斷和分析，分析并確定它們的FLC基因活性方式，用來協助育種或形成開花時間特征符合需要的植物。
例如，如后文所述，因FLC內突變而缺乏FLC活性的植物開花比含有活性FLC等位基因的植株早得多。具有野生型FLC活性的植株的葉數是FLC活性降低的植株的約6倍。而且，FLC表達水平高于正常的轉基因植物表現出明顯的開花延遲。雖然以下實施例是用擬南芥進行的(因在該植物內的基因操作較簡單)，但同樣的技術也適用于其他植物品種。實際上，FLC基因之間的高度相同性表明，作為一種普遍規律，一種植物FLC基因家族的成員在其他植物品種中也是有功能的。
開花時間調節FLC基因是植物開花引發的抑制者。據信，FLC的開花引發聚核苷酸片段在開花引發的調控中起者核心作用，因為，其他基因是通過改變該基因的活性來調節開花的。然而，該基因并非決定植物開花時間的唯一因素。例如，已證明，FRIGIDA(FRI)基因座是開花的協同抑制者，可與FLC發生協同作用(參見，Lee等，植物雜志，6，903-909，1994)。相反，LUMINIDEPENDENS基因促進開花，它通過降低FLC水平發揮作用。在缺乏LUMINIDEPENDENS活性因而開花延遲的突變株中，FLC水平顯著提高。因此，改變開花引發調節基因是控制開花時間的有效手段。
進一步發現，FRI的作用是提高FLC水平。事實上，FLC和FRI兩基因是兩個顯性等位基因，可相互作用從而延遲開花。按照傳統命名，小寫(例如fri，flc)表示隱性或非活性等位基因，大寫(例如FRI，FLC)表示活性的顯性等位基因。要延遲開花，一般需要兩個等位基因都承顯性。這樣，早開花的植物具有以下基因組合fri/fri和flc/1flc1；fri/fri和FLC1/fri；fri/fri和FLC1/FLC1；FRI/fri和flc1/flc1；FRI/FRI和flc1/flc1。晚開花的基因組合為FRI/fri和FLC1/flc1；FRI/FRI和FLC1/flc1；FRI/fri和FLC1/FLC1；FRI/FRI和FLC1/FLC1。因此，在非轉基因品系中檢測FLC1突變型時，可將含有未知活性的FLC1等位基因的植株與含有FRI等位基因(以純合體為佳)雜交，看是否含有活性FLC1等位基因。
植物的生命周期可分成至少兩個階段營養期和繁殖期。在大多數經濟作物植物中，在營養期，植物不斷生長，包括植物葉的增大和增多。繁殖期從開花引發開始。此時，許多植物的繼續生長是花朵、果實和種子的生長(或發育)。經濟作物植物已就所需的特性經歷了選育，所述特征包括植物同時進入收獲期。結果，種植于相同條件下的植物群中的每一植株的葉數高度一致。由于這種葉數的相同性，開花時間的改變常可根據作物植株上葉數來確定。例如，如果植物開花提早，則該植株的葉數將少于種植于相同條件下開花未提前的植株。而且，還可以認為，開花提前的植株其營養期短于種植于相同條件下開花未提前的植株。同理，如果開花被抑制而延遲，則植物的葉數將多于種植于相同條件下開花未延遲的植株。而且，開花受抑制的植株其營養期也將比種植于相同條件下開花未受抑制的植株延長。開花時間的改變也可根據時間來測定。
引入FLC基因拷貝的植物可能也含有抑制開花的野生型(即內源性)開花時間調控編碼區。在引入基因組后，FLC基因可放大該內源性開花時間調控編碼區的活性，從而延遲開花。例如，可在植物內引入第二份開花時間調控編碼區，從而增加植物內開花時間調節FLC蛋白質的量。開花時間調控編碼區部分所編碼的部分FLC蛋白的表達也能激發植物開花。激發植物開花的部分多肽稱之為顯性陰性突變，后文有詳細描述。
本發明還提供了一種基因修飾植物，其特征在于開花時間被改變的表型。即，本發明修飾后的植物，不論是通過在植物內引入表達新的或更多FLC蛋白質的FLC基因加以修飾，還是通過抑制植物內內源性FLC基因活性加以修飾，表現為開花引發時間比沒有插入轉基因的相同植物遲。較好的是，轉基因植物的開花時間(平均)比沒有轉基因的相同植物晚至少3天，至少7天更好，至少12天最好。或者，轉基因植物的開花時間(平均)比沒有轉基因的相同植物早至少3天，至少7天更好，至少12天最好。較好的是，將轉基因植物與沒有轉基因的相同植物種植在相同條件下。后文擬南芥的數據顯示，甚至可能得到開花時間更大的改變，如3周到3個月。
轉基因植物與無轉基因相同植物之間開花期開花引發時間的早晚差異也可根據開始開花時兩者的葉數差異來測定。較好的是，開始開花時，轉基因植物的葉數比無轉基因的相同植物多至少10％，至少50％更好，至少80％最好。或者，轉基因植物的葉數比無轉基因的相同植物少至少10％，至少50％更好，至少80％最好。較好的是，將轉基因植物與沒有轉基因的相同植物種植在相同條件下。
本發明實施例之一中，提供了一種核酸分子，包括一段核苷酸序列，代表擬南芥FLC基因編碼區或其部分，FLC基因序列的等位變異體，以及來自其他品種的FLC基因編碼區的同源序列。同源性即相關性，可用核酸雜交技術、數據庫計算機檢索，計算機或人工比較氨基酸和核酸序列，和用FLC特異性抗體進行的蛋白質檢測等技術來測定。兩段序列如果排列后有一定百分比的對應殘基相同，則是“相似的”。較好的是，兩段核苷酸序列的相同性高于31％，高于約50％更好，高于70％更好，高于80％最好。
所以，本發明包括這樣的基因和蛋白質，它們是植物基因FLC家族的成員，且一級結構與后文所述的FLC1具有明顯的相同性。將兩段氨基酸序列(即，同源序列的氨基酸序列和FLC1的序列)排列對齊，使得MADS區，即氨基酸1-60對齊，然后對兩段氨基酸序列的全長進行排列對齊，使得其中相同的氨基酸數量達到最大。排列中，序列之一或兩者中允許留空，為使MADS區的殘基對齊，并使氨基酸相同數量最大，但各序列內的氨基酸必需保持在其正確的序位。氨基酸相同性百分比是以下兩值中的高值(a)排列中兩序列相同的氨基酸數量除以FLC1的氨基酸數再乘以100；或(b)排列中兩序列相同的氨基酸數量除以后續多肽的氨基酸數再乘以100。較好的是，開花時間調控多肽在FLC1蛋白質全長上的相同性高于40％，高于50％更好，高于70％最好。
核苷酸水平的序列同源性或相同性不那么重要。正如本領域所熟知的，遺傳密碼子的簡并性使得許多不同DNA蛋白編碼序列可編碼同樣的氨基酸序列。甚至可以，而且經常，在制作植物表達盒時，出于方便克隆或密碼子使用偏性上的原因而改變天然蛋白質編碼序列，但不改變產物蛋白質的氨基酸序列。
本發明的分離核酸分子可用多種方法獲得。例如，可用本領域熟知的方法來分離核酸分子。這些技術包括但不限于1)可測性標記代表任一FLC基因全部或部分的探針，用其與基因組或cDNA庫雜交，檢測相似的核酸序列；2)抗體篩選表達文庫，檢測相似的結構特征；3)聚合酶鏈反應(PCR)合成；和4)核酸分子化學合成。特定的基因編碼區還可以在GenBank，國家衛生研究院計算機數據庫中找到。然后，可分離出編碼區，將其連接入后文所述的載體中。
為了用可測性標記的探針鑒定分離所得核酸分子，或為鑒定互補鏈與FLC1雜交的聚核苷酸片段，標準的嚴謹性雜交條件是采用Church等(美國科學院院報，81，1991-1984)所述的方法并加以改進在含0.5M磷酸鹽緩沖液，Ph7.2，7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，10mM EDTA的溶液中45℃培養12小時，在含2×SSC(1×SSC150mM NaCl/15mM檸檬酸鈉，pH7.0)和0.1％SDS的溶液中45℃洗滌3次，每次20分鐘。較好的是，聚核苷酸(例如探針)可在標準嚴謹性雜交條件下與SEQ ID NO1中的核苷酸序列雜交。通常，聚核苷酸(例如探針)不必與聚核苷酸片段的所有核苷酸互補，只要能在上述條件下雜交即可。或者，可采用更高嚴謹度的條件，例如，提高雜交和洗滌步驟的溫度至65℃、60℃、55℃或50℃。而且，雜交所需的時間可不用上述的12小時。通常，嚴謹度越低的雜交條件允許相關而不一定相同FLC基因的雜交，因而可鑒定出其他品種中的FLC基因。較好的是雜交和洗滌溫度為，按照優先順序，68℃雜交65℃洗滌，60℃雜交和洗滌，55℃雜交和洗滌，50℃雜交和洗滌，最好的是45℃洗滌和洗滌。
本發明所述的植物包括各種可用轉化技術改造的開花植物，包括單子葉和雙子葉植物。單子葉植物例如但不限于苷藍、洋蔥和大蒜等蔬菜；例如玉米、大麥、小麥、水稻、高粱、珍珠粟、裸麥和燕麥等谷類；和草料或草皮等草類。雙子葉植物的例如但不限于諸如西紅柿、豆子、大豆、胡椒、萵苣、豌豆、紫花苜蓿、三葉草、蕓苔(卷心菜、椰菜、花椰菜、芽苷藍、油菜籽和蘿卜)，胡蘿卜，甜菜，茄子，菠菜，黃瓜，南瓜，西瓜，哈密瓜，向日葵；棉花等纖維作物；和花卉及灌木等觀賞植物。
雖然后文實施例證明增強FLC的表達可延遲或抑制開花，FLC功能喪失則將促進開花，仍可用其他方法修飾FLC從而改變開花時間。例如，可在植物基因組內引入編碼某開花時間調節多肽顯性陰性轉基因。顯性陰性突變體即可活躍干擾正常的內源性蛋白質功能的蛋白質。于是可以阻抑某基因的作用但不致使結構基因本身或其RNA失活。該方法曾被成功地用于和FLC同屬于MADS區家族的轉錄因子。(Gauthier-Rouviere等，實驗細胞研究，209，208-215，1993；Mizukami等，植物細胞，8，831-845，1996)。在用MADS盒基因制造顯性陰性突變的實驗中，最有效的構建物是沒有該多肽C末端區的那些。因為，FLC和大多數MADS盒基因一樣具有相同的基本結構，所以類似的C末端截斷對FLC同樣有效。這一截斷物包含全長FLC1蛋白質的氨基酸1-150，對應于FLC基因的核苷酸1-450。
以上大致描述了本發明。更全面的理解可通過以下具體實施例獲得。實施例在此僅用于說明，并不限定本發明的范圍。
實施例對4種誘導后flc1等位基因中的損傷進行了測定。有關3種快速中子flc1等位基因早開花表型的數據見表1和2。4種flc1等位基因都含有可能造成功能完全喪失的突變。總之，FLC1基因功能的喪失在長日照和短日照條件下都完全抑制了FRI的晚開花作用。在早開花-無FRI的背景中，FLC1功能喪失只在短日照條件下影響開花時間。因此，野生型或活性FLC1顯然是開花的抑制者。
表1flc1功能喪失突變在晚開花、含FRI背景中的影響品系 開花時的蓮座葉數量長日照--含FRI的野生型74(12)*長日照--flc1-2 11.8(.75)*長日照--flc1-3 12.0(0.6)長日照--flc1-4 11.8(0.4)*短日照--含FRI的野生型＞100短日照--flc1-3 44(2.7)*括弧內的數字表示標準誤差。測定開花前形成的葉數作為開花時間。據此，在含FRI背景中，flc1突變植物其開花前的時間均為含FLC1野生型植物的1/6。
表2flc1失能突變在早開花無FRI背景中的影響品系開花時的蓮座葉數量長日照--Col野生型 13.7(0.8)*長日照--flc1-313.2(0.7)短日照--Col野生型 55.4(4.7)短日照--flc1-342.4(3.5)*括弧內的數字表示標準誤差。測定開花前形成的葉數作為開花時間。
本發明的品系來自擬南芥生物學來源中心，Columbus，OH。除非另作說明，培養條件和本領域技術人員普遍所知和所用的相同。由于春化對開花引發的作用，培養條件不使植物長期經受低溫(例如0-8℃)。對擬南芥進行基因分析的技術是本領域技術人員所已知的(參見，例如Koornneef等，基因分析，“擬南芥方法”，分子生物學方法，第8卷，Martinez-Zapater等(eds.)，Humana Press，Totowa，NewJersey，pp.105-227，1998)。
4種酵母人造染色體(YAC)克隆中包含Nga249和nga151之間的區域。為了制作其他標記，我們測定YAC末端克隆的DNA序列，并設計用于擴增Ler和Col中對應序列的引物。測定這些Ler和Col的DNA序列，確定單核苷酸改變，然后用來產生衍生切割擴增多態序列(dCAPS)標記(Michaels和Amasino，1998；Neff等，1998)。用來自YAC CIC1B8左端和右端的標記檢測到，FLC1兩側都發生重組，證明FLC1位于CIC1B8所覆蓋的620kb區間內。
在覆蓋CIC1B8的Kazusa擬南芥基因組課題中曾鑒定到13BAC，TAC和P1克隆。這些克隆中插入片段長70-100kb，用它們作為DNA印跡試驗的探針，所述試驗用含快速中子誘導的flc1突變植株的EcoRV-消化DNA進行。兩個重疊克隆，K6M1和MYB9，鑒定到數條flc-2中有缺失的條帶。用Sau3A1部分消化產生K6M1和MYB9的10-20kb隨機片段，用它們在二元載體pPZP211(Hajdukiewicz等，1994)中建立一個文庫，用該文庫的各克隆轉化Ler品系中的FRI。該文庫由Col背景的DNA構成，該背景含有晚開花的FLC1等位基因。因此，用含FLC1-Col等位基因的構建物轉化的Ler-FRI植物將晚開花。該文庫中的一個克隆，211-31，產生了開花很晚的T1植株。1/3以上的植株在培養8個月后，沒有開花就開始衰老。
在211-31中測序發現了3個推定基因。為了確定哪一個是FLC1，對以下3個候選基因進行了檢測，它們來自另兩種快速中子flc1等位基因，flc1-3和flc1-4，和一個EMS產生的等位基因flc1-1。兩種快速中子等位基因都表現出MADS盒轉錄因子所產生條帶的多態性。測定flc1-1，flc1-3和flc1-4的序列發現，它們的MADS轉錄因子的第一個外顯子中都存在損傷。flc1-3有一段104bp的缺失，因此失去了啟動密碼子，flc1-4有一段7bp的缺失，因此在前20個氨基酸后發生讀碼框改變。flc1-1在第一外顯子/內含子的連接處有一處單堿基轉換，因而將保守的GT供體位點變成了AT，并可能因而干擾剪接。通過RT-PCR從Col背景中分離出FLC1 cDNA，序列表中給出了其序列。實施例3晚開花轉基因擬南芥的產生為了確定FLC1是否可用于改變開花時間，培養了含兩種不同FLC1構建物的轉基因擬南芥。第一種構建物，211-31，由含FLC1的基因組DNA與其天然啟動子構成。另一種，pSM7，含有位于煙草花葉病毒組成型35S啟動子調控下的FLC1基因組編碼區(Odell等，自然，313，810-2，1985)。
通過農桿菌介導的轉化將211-31轉化入Ler型FRI(Bechtold等，C.R.Acad.Sci.Paris，3161194，1993)。非轉化的Ler-FRI約在長出14片原生蓮座葉開花(Lee等，植物雜志，6，903-909，1994)。以211-31轉化的Ler-FRI植物因FRI與FLC1的協同作用，開花顯著延遲(表3)。90％以上的轉化子在50多片以上時才開花，約38％始終未開花，即使培養在能夠強烈促進擬南芥開花的富遠紅外線條件下亦是如此。因此，FLC1過表達可使植物在整個生命周期內不開花。由于211-31轉化的植物其發育的營養期延長，生物量增加了10倍。這說明，一個FLC基因的過表達能夠使得早開花的植物變成晚開花植物。
通過農桿菌介導的轉化將pSM7轉化入野生型Ler(Bechtold等，C.R.Acad.Sci.Paris，3161194，1993)，用于測定FLC1在正常早開花品系內組成型表達的效應。結果見表5。30％轉基因植株開花未明顯晚于其Ler親本，35％中度延遲，35％明顯延遲。轉基因植物開花時間的不一致可能是因為它們在基因組內的插入位置不同引起表達水平不同。這說明，即使沒有FRI活性，FLC1表達也足以實質性地延遲開花。而且，組成型FLC1表達引起的晚開花對春化不敏感(春化可有效促進含FRI和FLC1的天然晚開花品系早開花)。因此，通過以一組成型啟動子取代原天然FLC啟動子，就可以形成晚開花而此特征對環境因素不敏感的晚開花植物。同樣，晚開花伴有生物量增加。
表3以FLC1轉化的含FRI植物的開花時間*開花時的蓮座葉數占轉化植物百分比12-20 8％20-40 0％40-80 54％＞80 38％*非轉化的Ler-FRI，沒有FLC1功能，在形成12-14片蓮座葉后開花，引入了1份或多份FLC1拷貝的轉基因植物中92％在形成了3倍于以上葉數后才開花。測定開花前的葉數作為開花時間指標。因此，在該品系內引入FLC1基因統一地改變了植物性狀，使其開花延遲了6倍。數個品系始終不開花。
表4以FLC1轉化的含FRI植物的生物量增加*品系 鮮重Ler-FRI 1.5g(.14)211-31轉化的Ler-FRI 15.5g(2.1)*以FLC1轉化后，植物的鮮重增加了10倍。括弧內的數字是標準偏差。
表5以組成型FLC1轉化的Ler植物的開花時間*開花時的蓮座葉數 占轉化植物百分比7-10 30％10-20 35％＞20 35％*野生型Ler在形成7-8片葉時開花，70％第一代轉化子開花延遲，其中35％開花前的葉數是非轉化子的2倍。測定開花前的葉數作為開花時間指標。因此，組成型表達FLC1的該品系的開花時間統一延遲了3倍以上。
表6FLC1與蕪菁FLC1同源基因之間的氨基酸相同性MADS區內的相同性MADS區外的相同性總相同性BrFLC1A 88％ 81％ 83％BrFLC1B 93％ 81％ 85％*在以上比較中，氨基酸1-60被認定為MADS區。因為家族成員間在MADS區內高度保守，所以給出了MADS區內和區外的相同性。
表7FLC1與FLC2和FLC3之間的氨基酸相同性MADS區內的相同性MADS區外的相同性總相同性FLC283％ 50％60％FLC383％ 50％60％*在以上比較中，氨基酸1-60被認定為MADS區。因為家族成員間在MADS區內高度保守，所以給出了MADS區內和區外的相同性。
表8flc2失能突變對開花時間的影響品系 開花時的蓮座葉數范圍長日照--野生型 8-9長日照--flc2-1 6-7長日照--flc2-2 6-7短日照--野生型 25-30短日照--flc2-1 7-9短日照--flc2-2 9-11實施例7FLC2過表達延遲擬南芥開花為了評價FLC2過表達對開花時間的作用，將FLC2基因組編碼區置于組成型35S啟動子調控下，通過標準技術(Bechtold等，C.R.Acad.Sci.Paris，316，1194，1993)將其轉化到擬南芥中。結果見表9。和FLC1一樣，FLC2過表達足以延遲開花。許多轉化植株開花期的葉數是對照的2-3倍。
表9FLC2過表達對開花時間的作用*開花時的蓮座葉數占轉化植物百分比12-16 55％17-33 45％*非轉化的野生株在8-9葉時開花。
綜合該試驗的數據可確認FLC家族基因在植物內起延遲開花的作用。以上數據表明在許多(即使不是大多數)植物中有一個以上天然FLC基因。雖然FLC基因與其他開花時間基因諸如FRI基因相互作用，但僅FLC基因就能夠改變植物開花的時間。FLC基因編碼的蛋白質具有高度的種內和種間序列相同性，而且，一個品種的FLC在其他品種中也有效。本發明由此提供了一種有用的工具，可操縱或協助控制多種植物的開花時間。
本發明分別引用并參考了在此引用的各篇專利、專利申請、出版物，以及核酸和蛋白質數據庫目錄，包括BenBank的登錄號和EMBL的登錄號。需要理解的是，由于現有技術的限制，給出的數據中可能存在偶然的序列誤差或缺失，但并不影響數據的使用價值。本發明精神和范圍內的各種修改對本領域技術人員來說是顯而易見的，因此，不應將本發明理解為僅限于說明性的實施例。
序列表<110>Amasino，RichardSchomburg，FritzMichaels，ScottSung，Si-Bum<120>改變植物開花時間的方法<130>960296.96871<140>09/513，775<141>2000-02-25<150>60/121，572<151>1999-02-25<150>60/123，455<151>1999-03-05<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>797<212>DNA<213>擬南芥<220><221>CDS<222>(1)..(588)<400> 1atg gga aga aaa aaa cta gaa atc aag cga att gag aac aaa agt agc 48Met Gly Arg Lys Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ser Ser1 5 10 15cga caa gtc acc ttc tcc aaa cgt cgc aac ggt ctc atc gag aaa gct 96Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Ile Glu Lys Ala20 25 30cgt cag ctt tct gtt ctc tgt gac gca tcc gtc gct ctt ctc gtc gtc 144Arg Gln Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Ser Val Ala Leu Leu Val Val35 40 45tcc gcc tcc ggc aag ctc tac agc ttc tcc tcc ggc gat aac ctg gtc 192Ser Ala Ser Gly Lys Leu Tyr Ser Phe Ser Ser Gly Asp Asn Leu Val50 55 60aag atc ctt gat cga tat ggg aaa cag cat gct gat gat ctt aaa gcc 240Lys Ile Leu Asp Arg Tyr Gly Lys Gln His Ala Asp Asp Leu Lys Ala65 70 75 80ttg gat cat cag tca aaa gct 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1.一種轉基因植物，其基因組中含有編碼FLC基因家族成員的轉基因，該轉基因植物的開花時間相對非轉基因同種植物發生了改變。
2.根據權利要求1所述的轉基因植物，其中轉基因植物的開花早于非轉基因同種植物。
3.根據權利要求1所述的轉基因植物，其中轉基因植物的開花遲于非轉基因同種植物。
4.根據權利要求1所述的轉基因植物，其中的FLC基因家族成員選自擬南芥的FLC1、FLC2、FLC3，和蕪菁的BrFLC1A和BrFLC1B。
5.權利要求1所述轉基因植物的種子。
6.轉基因植物的種子，其基因組中含有一個轉基因，該轉基因包括一個植物可表達啟動子和植物FLC蛋白質的編碼區，該植物FLC蛋白(i)具有MADS盒區，(ii)其MADS盒區之外氨基酸序列與擬南芥FLC1或FLC2即SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的相同性至少40％，而且(iii)當其在轉基因植物內表達時，能夠有效延遲轉基因植物的開花，使之遲于相同基因背景的非轉基因植株。
7.由權利要求6所述種子長成的植物。
8.根據權利要求6所述的種子，其中FLC蛋白質MADS盒區之外的氨基酸序列與FLC1的相同性至少50％。
9.一種轉基因植物的種子，其基因組中含有一個轉基因，該轉基因包括一個植物可表達啟動子和植物FLC蛋白質家族成員的編碼區，所述的FLC蛋白質家族成員在系統發育上與擬南芥FLC1或FLC2蛋白質的相關性比擬南芥的任何其他MADS盒區更密切。
10.由權利要求9所述的種子培養出的轉基因植物。
11.一種轉基因植物的種子，其基因組中含有一個轉基因，該轉基因包括一個植物可表達啟動子，該啟動子與植物FLC蛋白質編碼序列足夠部分的互補序列操作性連接，以降低由該種子長成的植株內內源性FLC蛋白質活性水平，所述的植物FLC蛋白質(i)具有MADS盒區，(ii)其MADS盒區之外氨基酸序列與擬南芥FLC1或FLC2即SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的相同性至少40％，而且(iii)當其在轉基因植物內表達時能夠有效延遲轉基因植物的開花，使之遲于相同基因背景的非轉基因植株。
12.一段分離的核苷酸序列，包含擬南芥FLC1基因即SEQ ID NO1的編碼序列。
13.一段分離的DNA序列，包含編碼擬南芥FLC1蛋白質即SEQ ID NO2的DNA序列。
14.一種基因構建物，包含一個植物可表達啟動子，該啟動子與FLC基因家族蛋白質的編碼序列操作性連接，所述的植物FLC蛋白質(i)具有MADS盒區，(ii)其MADS盒區之外氨基酸序列與擬南芥FLC1(SEQ ID NO2)或FLC2(SEQ IDNO4)的相同性至少40％，而且(iii)當其在轉基因植物內表達時能夠有效延遲轉基因植物的開花，使之遲于相同基因背景的非轉基因植株。
15.一種植物，其基因組中含有權利要求14所述的基團構建物。
16.根據權利要求14所述的基因構建物，其中的FLC蛋白質選自擬南芥的FLC1、FLC2、FLC3，和蕪菁的BrFLC1A和BrFLC1B。
17.根據權利要求14所述的基因構建物，其中植物FLC基因其氨基酸序列與擬南芥FLC1蛋白質(SEQ ID NO1)的相同性至少50％。
18.一種基因構建物，包含一個植物可表達啟動子，該啟動子與植物FLC蛋白質編碼序列足夠部分的互補序列操作性連接，以降低由該種子長成的植株內內源性FLC蛋白質活性水平，所述的植物FLC蛋白質(i)具有MADS盒區，(ii)其氨基酸序列與擬南芥FLC1即SEQ ID NO1的相同性至少40％，而且(iii)當其在轉基因植物內表達時能夠有效延遲轉基因植物的開花，使之遲于相同基因背景的非轉基因植株。
19.一種轉基因植物，含有FLC基因家族成員的轉基因，培養于相同的條件下時，該基因修飾植物的開花比相同基因背景的非轉基因植株早或遲至少7天。
20.一種生產改變了開花時間的轉基因植物的方法，包括將植物細胞與轉基因接觸，該轉基因包含植物可表達啟動子和植物FLC基因；鑒定插入有該轉基因的植物細胞；由該植物細胞再生成轉基因植物，所述轉基因植物的葉數比相同基因背景的非轉基因植株少或多10％，所述的葉數是轉基因植株與非轉基因植株培養于相同條件下測定的。
全文摘要
本發明提供開花基因座(FLC)基因家族的基因鑒定,并利用有關信息來調節植物開花的時間。這一信息可用來生成轉基因植物,其開花時間被選擇性地改變。由于這些基因原本的作用是延遲開花,所以,增強FLC蛋白質的活性將延遲開花時間,抑制FLC活性則將開花時間提前。本發明描述了該基因家族一定數量的樣品,具有一定代表性。本發明證明,該基因家族的成員在其他品種的植物中同樣有效。
文檔編號C12N15/29GK1346408SQ00804291
公開日2002年4月24日 申請日期2000年2月25日 優先權日1999年2月25日
發明者R·M·阿馬西諾, F·M·尚伯格, S·D·邁克爾斯, S·B·宋, K·斯科特科 申請人:威斯康星校友研究基金會