專利名稱：來自食甲基嗜甲基菌的新的酶及其編碼基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術，具體地說是3-脫氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯合酶，預苯酸脫水酶和所述酶的編碼基因。所述基因用于提高芳香族氨基酸的產量。
背景技術：
通常工業上用短桿菌屬，棒桿菌屬，芽孢桿菌屬，埃希氏菌屬，鏈霉菌屬，假單胞菌屬，節桿菌屬，沙雷氏菌屬，青霉屬假絲酵母屬的微生物通過發酵的方法生產L-氨基酸。對于這些微生物，可利用從這些微生物的天然或突變體分離的菌株提高氨基酸的產量。此外，已公開了多種重組DNA技術通過增強L-氨基酸生物合成途徑中的酶的活性來提高L-氨基酸的產量。
盡管可以利用上述微生物進行育種或改良生產工藝來提高氨基酸的產量，但仍需開發更加廉價高效的L-氨基酸生產工藝來滿足對L-氨基酸日益增長的需求。
按照慣例，已知以能大批量并廉價獲得的甲醇作為原料，利用以下屬的細菌發酵生產氨基酸擬無枝酸菌屬和假單胞菌屬(參見日本專利公開No.45-25273)、精朊桿菌屬(參見日本專利公開No.49-125590)、精朊桿菌屬和甲烷單胞菌屬(參見日本專利公開No.50-25790)，微環菌屬(參見日本專利公開No.52-18886)，甲基菌屬(參見日本專利公開No.4-91793)和芽孢桿菌屬(參見日本專利公開No.3-505284)。
此外，有幾種酶在芳香族化合物，如L-苯丙氨酸，L-酪氨酸和L-色氨酸的生物合成途徑中起重要作用。所述的關鍵酶是3-脫氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯(以下縮寫為″DS″)。對于L-苯丙氨酸的生物合成，預苯酸脫水酶(以下縮寫為″PD″)也是關鍵酶。
但嗜甲基菌屬中編碼DS和PD的任何基因都是未知的。
發明內容
本發明的一個目的是提供屬于食甲基屬的細菌的編碼DS和PD的基因。
為達到上述目的本發明人進行了深入的研究。結果利用分支酸變位酶-預苯酸脫水酶基因(pheA)缺陷的大腸桿菌菌株，從食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)中成功地分離了DS和PD的編碼基因，從而完成了本發明。
本發明提供(1)由下述(A)或(B)所定義的蛋白(A)包含SEQ ID NO2所述氨基酸序列的蛋白；或(B)包含在SEQ ID NO2所述氨基酸序列中含有一個或多個氨基酸缺失，取代，插入或添加的氨基酸序列且具有3-脫氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-synthase)合酶活性的蛋白。
(2)編碼由下述(A)或(B)所定義的蛋白的DNA(A)包含SEQ ID NO2所述氨基酸序列的蛋白；或(B)包含在SEQ ID NO2所述氨基酸序列中含有一個或多個氨基酸缺失，取代，插入或添加的氨基酸序列且具有3-脫氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-synthase)合酶活性的蛋白。
(3)如(2)中所述的DNA，該DNA是下述(A)或(B)定義的DNA(A)包含如SEQ ID NO1所述核苷酸序列的DNA；或(B)可與如SEQ IDNO1所述的核苷酸序列或由該序列制備的探針在嚴格條件下雜交，且編碼具有3-脫氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯合酶活性的蛋白的DNA。
(4)如(3)所述的DNA，其中，所述的嚴格條件是在60℃，相當于1×SSC和0.1％SDS的鹽濃度下進行洗滌的條件。
(5)由下述(C)或(D)所定義的蛋白(C)包含SEQ ID NO4所述氨基酸序列的蛋白；或(D)包含在SEQ ID NO4所述氨基酸序列中含有一個或多個氨基酸缺失，取代，插入或添加的氨基酸序列且至少具有預苯酸脫水酶活性或分支酸變位酶活性之一的蛋白。
(6)編碼由下述(C)或(D)所定義的蛋白的DNA(C)包含SEQ ID NO4所述氨基酸序列的蛋白；或(B)包含在SEQ ID NO4所述氨基酸序列中含有一個或多個氨基酸缺失，取代，插入或添加的氨基酸序列且至少具有預苯酸脫水酶活性或分支酸變位酶活性之一的蛋白。
(7)如(6)中所述的DNA，該DNA是由下述(C)或(D)定義的DNA(C)包含如SEQ ID NO3所述核苷酸序列的DNA；或(D)可與如SEQ IDNO3所述的核苷酸序列或由該序列制備的探針在嚴格條件下雜交，且編碼至少具有預苯酸脫水酶活性或分支酸變位酶活性之一的蛋白的DNA。
(8)如(3)所述的DNA，所述的嚴格條件是在60℃，相當于1×SSC和0.1％SDS的鹽濃度下進行洗滌的條件。
本發明中，術語″3-脫氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯合酶活性″是指催化由磷酸烯醇式丙酮酸和D-赤蘚糖-4-磷酸酯合成3-脫氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯的活性。術語″預苯酸脫水酶活性″是指催化由預苯酸合成苯丙酮酸的活性，術語″分支酸變位酶″是指催化由分支酸合成預苯酸的活性。這表明與其他微生物，如大腸桿菌一樣，本發明所述的PD具有分支酸變位酶活性及預苯酸脫水酶活性。本發明中，術語″至少具有預苯酸脫水酶活性或分支酸變位酶活性之一″指PD具有一種或兩種性質。因此，在本發明中，″至少具有預苯酸脫水酶活性或分支酸變位酶活性之一″可以指″PD活性″。
下面對本發明進行詳細描述。
本發明的DNA可以來自下述食甲基嗜甲基菌的染色體DNA。
制備食甲基嗜甲基菌，例如食甲基嗜甲基菌菌株AS-1的染色體DNA。所述的染色體DNA可通過例如Saito和Miura(Biochem.Biophys.Acta.，72，619(1963))，或K.S.Kirby(Biochem.J.，64，405(1956))中所述的方法從細胞團中獲得。
然后，為從所獲得的染色體DNA中分離DS或PD基因，制備染色體DNA文庫。首先用合適的限制酶將上述染色體DNA部分消化以獲得多種片段的混合物。可以使用多種限制酶，條件是可以通過控制酶切反應時間等條件等控制酶切程度。例如，可用Sau3AI或BamHI在不低于30℃，優選地在37℃，以酶濃度1-10單位/ml在不同時間段(1min到2h)作用于所述的染色體DNA，對其進行消化。
接下來收獲DNA片段與可在埃希氏屬的細菌中自我復制的載體DNA相連制備重組DNA。具體地說，用限制酶在溫度不低于30℃、1-100單位/ml酶濃度的條件下作用于載體DNA 1h以上，優選1-3小時以將所述載體完全消化、切割、裂解，所述的限制酶，如BamHI產生的末端核苷酸序列與用Sau3AI切割染色體DNA所產生的末端核苷酸序列互補。接下來將上述獲得的染色體DNA片段混合物與經裂解切割的載體DNA片段混合，使1-100單位/ml濃度的DNA連接酶優選T4 DNA連接酶在4-16℃下作用于所述混合物不少于1h，優選4-24h，以獲得重組DNA。
用所得的重組DNA轉化埃希氏屬的微生物，如大腸桿菌B-7078(pheA::Tn10(KmR))。將轉化子涂布于不含苯丙氨酸的瓊脂平板上，將所得的克隆接種于液體培養基中培養。從培養細胞中回收質粒以獲得含PD基因的DNA片段。
通過測序確定由上述步驟獲得的DNA片段是否含有PD基因，并證實所確定的序列包含SEQ ID NO3中所述的序列。
通過片段測序和下述事實證明了，在下述實施例中獲得的含PD基因的克隆片段也含有DS基因，所述事實為該片段互補于DS-缺陷的芳香營養缺陷菌株AB3257(aroG 365-，aroH367-，aroF363-，thi-1，ilvC7，argE3，his-4，proA2，xyl-5 galK2，lacY1，mtl-1，strA712，tfr3，tsx-358，supE44，hsdR2，zjj-202::Tn10)。
當用BamHI消化食甲基嗜甲基菌菌株AS-1的染色體DNA時，DS和PD基因克隆為約10Kb的BamHI片段。
利用上述方法可從其他食甲基菌屬的細菌中分離出DS和PD基因。另外，由于本發明DNA的核苷酸序列已闡明，可以利用基于確定序列合成的寡核苷酸作為引物的PCR(聚合酶鏈式反應)或利用上述寡核苷酸為探針的雜交方法從嗜甲基菌屬細菌的染色體DNA或基因組文庫中獲得DNA。
可利用本領域技術人員已知的常規方法制備基因組DNA、制備基因DNA文庫，進行雜交，PCR，制備質粒DNA，進行DNA的消化、連接和轉化。上述操作參見Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.，″Molecular Cloning A Laboratory Manua l，Second Edition″，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)。
上述獲得的DS基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO1中所示。另外，由核苷酸序列編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
上述獲得的PD基因核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO3中所示。另外，由核苷酸序列編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。
本發明的DNA可編碼包含在一個或多個位點取代、缺失、插入、添加或倒轉一個或多個氨基酸的DS或PD，條件是所編碼的DS或PD的活性不發生改變。“幾個”氨基酸的數量依所述蛋白三維結構中的氨基酸殘基的位置或類型的不同而不同。原因如下，即一些氨基酸如異亮氨酸和纈氨酸彼此間高度同源。這樣的氨基酸之間的差異不會顯著地影響蛋白的三維結構。因此，由本發明的DNA編碼的蛋白可以是與構成DS或PD的全部氨基酸殘基同源性不小于35-50％，優選50-70％同源，且具有DS和PD活性的蛋白。更適當地，所謂″幾個″氨基酸是2到30，優選2到20，更優選2到10個。
編碼與上述DS或PD基本相同的蛋白的DNA可通過下述方法對核苷酸序列進行修飾而獲得，即通過例如定點誘變方法使得特定位點的一個或多個氨基酸殘基發生取代，缺失，插入，添加或倒轉。誘變處理包括在體外處理編碼DS和PD的DNA的方法，例如用羥胺處理，處理微生物的方法，例如用紫外線或誘變劑如，常用于誘變處理的N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和亞硝酸處理帶有編碼DS和PD的DNA的埃希氏屬細菌。
上述核苷酸的取代，缺失，插入，添加，或倒轉還包括天然存在的突變(突變體或變異體)，例如基于帶有DS和PD的微生物的個體差異或種或屬差異的突變。
可以通過在合適的細胞中表達帶有上述突變的DNA，再檢驗表達產物的DS和PD活性，由此獲得編碼與DS和PD基本上相同的蛋白的DNA。也可以從編碼帶有突變DS和PD的DNA或從帶有所述DNA的細胞中分離可與，例如序列表中SEQ ID NO1所述序列在嚴格條件下雜交并編碼具有DS和PD活性的蛋白的DNA，由此獲得編碼與DS和PD基本上相同的蛋白的DNA。所述的“嚴格條件”是指一種形成特異性雜交而不形成非特異性雜交的條件。用任何數值都難以清楚地表達這一條件。但舉例來說，所述嚴格條件包括高同源性的DNA，如同源性高于50％的DNA之間可以彼此雜交，而同源性低于上述數值的DNA間不能雜交的條件。或者，作為示例，所述嚴格條件是指在相當于Southern雜交普通洗滌條件的鹽濃度下使所述DNA彼此雜交，即60℃，1×SSC，0.1％SDS，優選0.1×SSC，0.1％SDS。
可在上述的條件下雜交的基因包括那些具有在所述基因的編碼區產生的終止密碼子的基因和那些由于在活性中心發生突變而沒有活性的基因。但這些突變可通過下述方式輕易地排除，即將所述基因與可商購的活性表達載體相連，再按上述方法測定DS和PD的活性。
舉例來說，用于表達DS或PD基因的宿主例如埃希氏屬的細菌，如大腸桿菌；棒狀細菌，如乳發酵短桿菌；嗜甲基菌屬的細菌，如食甲基嗜甲基菌；和多種真核細胞，如釀酒酵母；動物細胞和植物細胞，優選原核細胞，特別是大腸桿菌，棒狀細菌和食甲基嗜甲基菌。
將DS或PD基因引入大腸桿菌細胞的載體包括，例如pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219和pMW218。也可以用噬菌體DNA載體。
用于將DS或PD引入棒狀細菌的載體包括，例如pAM330(參見日本專利公開No.58-67699)，pHM1519(參見日本專利公開No.58-77895)，pAJ655，pAJ611和pAJ1844(參見日本專利公開No.58-192900)，pCG1(參見日本專利公開No.57-134500)，pCG2(參見日本專利公開No.58-35197)，pCG4和pCG11(參見日本專利公開No.57-183799)，pHK4(參見日本專利公開No.5-7491)。
用將DS或PD連到上述的載體中形成的重組載體轉化上述宿主將DS和PD引入其中。所述的DS或PD基因可通過轉導、轉座(Berg，D.E.and Berg，C.M.，Bio/Technol.，1，417(1983))，Mu噬菌體(Japanese Laid Open Patent Publication No.2-109985)或同源重組(Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring HarborLab.(1972))的方法整合到宿主細胞的基因組中。
可通過下述方式產生DS和PD，即培養按上述方法引入了DS或PD基因的細胞，在培養基中產生并積累DS或PD，從培養物中收集DS或PD。培養所選用的培養基應當是適合于宿主的培養基。
需要時可利用通常的酶純化方法，如離子交換層析，凝膠過濾層析，吸附層析，溶劑沉淀等從細胞抽提物或培養基中純化按上述方法產生的DS或PD。
可用本發明的DNA構建帶有其活性高于野生型的DS或PD。這可通過用包含可表達形式的DS或PD基因的載體轉化微生物實現。
用于本發明的細菌包括，例如食甲基嗜甲基菌AS1(NCIMB10515)等。可從英國國家工業和海洋細菌保藏中心，NCIMB Lts.，Torry研究站135，Abbey Road，Aberdeen AB9 8DG，獲得食甲基嗜甲基菌AS1(NCIMB10515)。
為提高芳香氨基酸，特別是L-苯丙氨酸的產量，擴增編碼DS和PD酶的基因是有益的。
圖1表示帶有DS和PD基因的質粒pPD1和pPD2的構建圖2表示帶有PD和DS基因，缺失了食甲基嗜甲基菌DNA片段后所得質粒的互補分析。
實施本發明的最佳方式在鳥槍實驗中通過互補，將帶有食甲基嗜甲基菌預苯酸脫水酶和DAHP-合酶基因的10kbp BamHI DNA片段克隆到低拷貝載體pMW119(ApR)中(圖1)。在這一實驗中用BamHI消化食甲基嗜甲基菌AS-1的染色體DNA，用T4 DNA連接酶將所得的DNA片段與質粒pMW119的BamHI消化產物連接。用所述連接產物轉化大腸桿菌B7078(pheA::Tn10(KmR))。在所得的抗氨芐青霉素克隆中選擇苯丙氨酸營養缺陷型消失的菌株，并從中回收質粒。將所得的質粒之一命名為pPD1。將帶有與pPD1中克隆片段方向相反的片段的質粒命名為pPD2。
互補于原養型的質粒pPD1和pPD2不僅是大腸桿菌B7078的pheA-突變體還有DS-大腸桿菌AB3257(aroG-，aroH-，aroF-)。由此推定質粒pPD1和pPD2都帶有在同一克隆的DNA片段中的編碼PD酶和DS酶的基因。
構建pPD1和pPD2的缺失衍生物(圖2)。所述的缺失是通過在體外用不同的限制酶消化質粒DNA再連接所得的DNA片段獲得的。用所得的連接混合物轉化PD-菌株大腸桿菌B-7078(pheA::Tn10(kan))成為Phe+原養型。對分離的質粒作圖并測定其互補DS-突變體大腸桿菌AB3257(aroG-，aroH-，aroF-)成為Aro+原養型的能力。所構建的缺失衍生物在結構和互補能力方面有所不同。發現了只帶有一個PD酶編碼基因的缺失衍生物。這些缺失衍生物喪失了互補DS-突變體大腸桿菌AB3257(aroG-，aroH-，aroF-)為原養型的能力。因此，推測在pPD1或pPD2中克隆的食甲基嗜甲基菌DNA片段帶有分別編碼DS和PD酶的兩個不同基因。
確定了編碼DS和PD酶的兩個食甲基嗜甲基菌基因的核苷酸序列。DS基因的核苷酸序列和由該核苷酸序列編碼的氨基酸序列如SEQID NO1所示。PD基因的核苷酸序列和由該核苷酸序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示。
通過計算機程序分析并表征了編碼DS和PD酶的食甲基嗜甲基菌基因的核苷酸序列。DS和PD基因序列翻譯后與許多其他微生物中的相同功能的蛋白表現出明顯的氨基酸序列相似性(表1，2)。
工業實用性本發明提供了3-脫氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯合酶，預苯酸脫水酶和該酶的編碼基因。該基因可用于提高芳香族氨基酸的產量。
表1食甲基嗜甲基菌DS酶蛋白序列與其他微生物中類似序列的比對
表2食甲基嗜甲基菌PD酶蛋白序列與其他微生物中類似序列的對比
序列表序列表<110>味之素株式會社<120>來自食甲基嗜甲基菌的新的酶及其編碼基因<130>B886MSOP1086<141>2001-11-13<150>RU 2000128122<151>2000-11-13<160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1083<212>DNA<213>食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)<220>
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Ile Gly His Leu Lys Asp Asp Gly Val Ile Tyr Arg Pro Glu Arg Glu35 40 45Ala Gln Ile Ile Arg Arg Leu Gln Ala Glu Asn Glu Gly Pro Leu Ser50 55 60Pro Glu Ala Val Ser His Ile Phe Arg Ala Val Met Ser Asn Cys Arg65 70 75 80Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala Ile Ala Phe Leu Gly Pro Leu Gly Thr85 90 95Tyr Ser Glu Glu Ala Ala Leu Lys Gln Phe Gly Glu Gly Arg Gln Ala100 105 110Val Val Cys Gly Ser Ile Asp Glu Val Phe Arg Thr Val Glu Ala Gly115 120 125Gln Ala Asp Tyr Gly Val Val Pro Val Glu Asn Ser Thr Glu Gly Ala130 135 140Val Gly Ile Thr Leu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Ala Leu Gln Val Val145 150 155 160Gly Glu Val Thr Leu Pro Val His His Cys Leu Leu Ser Ala Gln Gln165 170 175Asp Leu Gln Gln Ile Thr His Val Phe Ser His Ala Gln Ser Leu Ser180 185 190Gln Cys His Glu Trp Leu Asn Lys Val Leu Pro Ser Ala Gln Arg Glu195 200 205Ala Val Thr Ser Asn Ala Arg Ala Ala Gln Met Ile His Glu Leu Val210 215 220Ala Thr Gln Gly Thr Phe Ala Ala Ala Ile Ala Ser Lys Arg Ala Ala225 230 235 240Glu Leu Phe Asp Leu Asn Ile Leu Ala Glu Asn Ile Glu Asp Asp Pro245 250 255Lys Asn Thr Thr Arg Phe Leu Val Leu Gly Asn His Gly Val Ala Pro260 265 270Ser Gly Gln Asp Lys Thr Ser Leu Val Met Ser Ala His Asn Lys Pro275 280 285Gly Ala Val Leu Gln Leu Leu Glu Pro Leu Ser Arg His Gly Val Ser290 295 300Met Thr Lys Leu Glu Ser Arg Pro Ser Arg Gln Asn Leu Trp Asn Tyr305 310 315 320Val Phe Phe Val Asp Ile Glu Gly His Gln Gln Gln Pro Ser Val Gln325 330 335Ala Ala Leu Lys Glu Leu Ala Glu Arg Ala Thr Phe Leu Lys Val Leu340 345 350Gly Ser Tyr Pro Thr Ala Ile Ile35權利要求
1.一種由下述(A)或(B)所定義的蛋白(A)包含SEQ ID NO2所述氨基酸序列的蛋白；或(B)包含在SEQ ID NO2所述氨基酸序列中含有一個或多個氨基酸缺失，取代，插入或添加的氨基酸序列且具有3-脫氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯合酶活性的蛋白。
2.編碼由下述(A)或(B)所定義的蛋白的DNA(A)包含SEQ ID NO2所述氨基酸序列的蛋白；或(B)包含在SEQ ID NO2所述氨基酸序列中含有一個或多個氨基酸缺失，取代，插入或添加的氨基酸序列且具有3-脫氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯合酶活性的蛋白。
3.如權利要求2所述的DNA，該DNA是下述(A)或(B)所定義的DNA(A)包含如SEQ ID NO1所述核苷酸序列的DNA；或(B)可與如SEQ ID NO1所述的核苷酸序列或由該序列制備的探針在嚴格條件下雜交，且編碼具有3-脫氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯合酶活性的蛋白的DNA。
4.如權利要求3所述的DNA，其中，所述的嚴格條件是在60℃，相當于1×SSC和0.1％SDS的鹽濃度下進行洗滌的條件。
5.一種由下述(C)或(D)所定義的蛋白(C)包含SEQ ID NO4所述氨基酸序列的蛋白；或(D)包含在SEQ ID NO4所述氨基酸序列中含有一個或多個氨基酸缺失，取代，插入或添加的氨基酸序列且至少具有預苯酸脫水酶活性或分支酸變位酶活性之一的蛋白。
6.編碼由下述(C)或(D)所定義的蛋白的DNA(C)包含SEQ ID NO4所述氨基酸序列的蛋白；或(D)包含在SEQ ID NO4所述氨基酸序列中含有一個或多個氨基酸缺失，取代，插入或添加的氨基酸序列且至少具有預苯酸脫水酶活性或分支酸變位酶活性之一的蛋白。
7.如權利要求6所述的DNA，該DNA是下述(C)或(D)所定義的DNA(C)包含如SEQ ID NO3所述核苷酸序列的DNA；或(D)可與如SEQ ID NO3所述的核苷酸序列或由該序列制備的探針在嚴格條件下雜交，且編碼至少具有預苯酸脫水酶活性或分支酸變位酶活性之一的蛋白的DNA。
8.如權利要求7所述的DNA，其中，所述的嚴格條件是在60℃，相當于1x SSC和0.1％SDS的鹽濃度下進行洗滌的條件。
全文摘要
本發明提供來自食甲基嗜甲基菌的新的3－脫氧－D－阿糖庚酮糖酯－7－磷酸酯合酶和預苯酸脫水酶/分支酸變位酶，以及編碼所述酶的DNA。
文檔編號C12N9/90GK1527881SQ01821748
公開日2004年9月8日 申請日期2001年11月13日 優先權日2000年11月13日
發明者Y·A·V·伊奧曼塔斯, E·G·阿巴拉基納, 臼田佳弘, 西尾陽介, N·V·戈斯科瓦, Y A V 伊奧曼塔斯, 介, 弘, 戈斯科瓦, 阿巴拉基納 申請人:味之素株式會社