具有動物型糖鏈加成功能的植物細胞的制作方法

專利名稱：具有動物型糖鏈加成功能的植物細胞的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種具有動物型糖鏈加成功能的植物細胞，一種從這類植物細胞再生的植物，一種生產這類植物細胞的方法，以及一種利用該植物細胞生產具有動物型糖鏈的糖蛋白的方法。
背景技術：
除傳統和常規的生殖方式以外，可利用基因工程技術對植物細胞進行改造，由此可將其它方法不可行的或有利的性狀賦于植物細胞。例如至今為止，已產生并應用了具有抗病、抗除草劑、長壽等類似性能的植物。最近，傳統上由動物細胞、酶母、大腸桿菌等產生的有用的蛋白質，已經可通過植物細胞或植物生產。
迄今為止，已報道的利用植物細胞或植物表達的簡單蛋白質或糖蛋白包括以下的例子α-1-抗胰蛋白酶Appl Microbiol Biotechnol 1999十月；52(4)51，6-23 Terashima M，Murai Y，Kawamura M，Nakanishi S，Stoltz T，Chen L，Drohan W，Rodriguez RL，Katoh S；α-淀粉酶Biotechnology(NY)1992 Mar；10(3)292-6 Pen J，Molendijk L，QuaxWJ，Sijmons PC，van Ooyen AJ，van den Elzen PJ，Rietveld K，Hoekema A；血紅蛋白Nature 1997 Mar 6；386(6620)29-30 DieryckW，Pagnier J，Poyart C，Marden MC，Gruber V，BouRNAt P，BaudinoS，Merot B；木聚糖酶Nat Biotechnol 1999五月；17(5)466-9“在植物根的滲出物中生產重組蛋白質”Borisjuk NV，Borisjuk LG，Logendra S，Petersen F，GlebaY，Raskin I；抗體Eur J Biochem 1999六月；262(3)810-6 Fischer R，Liao YC，Drossard J.Curr TopMicrobiol Immunol 1999；236275-92 Ma jk，Vine ND，J ImmunolMethods 1998十一月1；220(1-2)69-75 Verch T，Yusibov V，Koprowski H；肌醇六磷酸酶Biochem Biophys Res Commun 1999十月14；264(1)201-6“在煙草葉中表達的重組真菌肌醇六磷酸酶(phyA)的描述”Ullah AH，Sethumadhavan K，Mullaney EJ，Ziegelhoffer T，Austin-Phillips S，Plant Physiol 1997七月；114(3)1103-11“從大豆細胞培養懸液中分泌具活性的重組肌醇六磷酸酶”Li J，HegemanCE，Hanlon RW，Lacy GH，Denbow MD，Grabau EA；人血清白蛋白Biotechnology(NY)1990 Mar；8(3)217-21“在轉基因植物中生產正確加工的人血清白蛋白”Sijmons PC，Dekker BM，Schrammeijer B，Verwoerd TC，van den Elzen PJ，Hoekema A；人乳白蛋白J Biochem(Tokyo)1998 Mar；123(3)440-4“在轉基因煙草中表達人α-乳白蛋白”Takase K，Hagiwara K；人干擾素J Interferon Res 1992十二月；12(6)449-53 Edelbaum O，Stein D，Holland N，Gafni Y，LivnehO，Novick D，Rubinstein M，Sela I；人艾杜糖醛酸苷酶Curr TopMicrobiol Immunol 1999；24095-118“轉基因植物用于治療用蛋白質連接上游與下游的策略”Cramer CL，Boothe JG，Oishi KK；GM-CSF(粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子)CMAF 1995八月15；153(4)427-9Robinson A；水蛭素P；ant Mol Biol 1995十二月；29(6)1167-80“利用OLEOSIN分配在植物種子中生產生物活性水蛭素”Parmenter DL，Boothe JG，van Rooijen GJ，Yeung EC，Moloney MM；人乳鐵蛋白Protein Expr Purif 1998六月；13(1)127-35“在轉基因煙草植物中生產人乳鐵蛋白”Salmon V，Legrand D，Slomianny MC，EL YazidiI，Spik G，Gruver V，BouRNAt P，Olagnier B，Mison D，Theisen M，Merot B Plant Physiol 1994十一月；106(3)977-81“在煙草細胞中表達人乳鐵蛋白cDNA以生產抗細菌的蛋白質”Mitra A，Zhang Z；血管緊張素轉移酶的肽掏抑制劑(西紅柿和煙草)Biotechnology(NY)1993八月；11(8)930-2 Hamamoto H，Sugiyama Y，Nakagawa N，Hashi da E，Matsunaga Y，Takemoto S，Watanabe Y，Okada Y；多聚羥基丁烯Nat Biotechnol 1999十月；17(10)1011-6“ARABIDOPSIS和蕓苔的新陳代謝工程用于生產多聚(3-羥基丁酸鹽-CO-3-羥基戊酸鹽)共聚物”Slater S，Mitsky TA，Houmiel KL，Hao M，ReiserSE，Taylor NB，Tran M，Valentin HE，Rodriguez DJ，Stone DA，Padgette SR，Kishore G，Gruys KJ Planta 1999十月；209(4)547-50“在蕓苔NAPUS的油種白色體中生產多聚(β-羥基丁酸鹽)”HoumielKL，Slater S，Broyles D，Casagrande L，Colburn S，Gonzalez K，Mitsky TA，Reiser SE，Shah D，Taylor NB，Tran M，Valentin HE，GruysKJ；葡糖腦苷脂酶，Ann NY Acad Sci 1996五月25；79262-71“用轉基因煙草進行人類酶的生物生產”Cramer CL，Weissenborn DL，Oishi KK，Grabau EA，Bennett S，Ponce E，Grabowski GA，Radin DNCurr Top Microbiol Immunol 1999；24095-118“轉基因植物用于治療性蛋白質連接上游與下游的策略”Cramer CL，Boothe JG，OishiKK；葡糖醛酸糖苷酶，Adv Exp Med Biol 1999；464127-47“在轉基因玉米中進行分子耕作生產工業用蛋白質”Hood EE，Kusnadi A，Nikolov Z，Howard JA Biotechnol Bioeng 1998十月5；60(1)44-52，“轉基因玉米種子的加工及其在重組β-葡糖醛酸糖苷酶復性中的作用”Kusnadi AR，Evangelista RL，Hood EE，Howard JA，Nikolov ZL；紅細胞生成素，Plant Mol Biol 1995 Mar；27(6)1163-72 MatsumotoS，Ikura K，Ueda M，Sasaki R Biosci Biotechnol Biochem 1993八月；57(8)1249-52 Matsumoto S，Ishii A，Ikura K，Ueda M，SasakiR谷氨酸脫羧酶Nat Med 1997七月；3(7)793-6 Ma SW，Zhao DL，YinZQ，Mukherjee R，Singh B，Qin HY，Stiller CR，Jevnikar AM AdvExp Med Biol 1999；464179-94 Ma S，Jevnikar AM或其它。
應用植物細胞或植物生產有用蛋白質的優勢是，植物細胞和植物可以在蛋白質上添加一個糖鏈。
常規用于生產重組蛋白的大腸桿菌不具有添加糖鏈的功能。酵母具有添加糖鏈的功能，但所添加的糖鏈與動物糖鏈的結構有差異。在動物中，添加糖鏈的結構在不同物種間各異。即使是在同一動物體中，也發現添加的糖鏈結構很大程度上隨不同組織、不同發育和分化階段或其它而各異。
總之，根據糖鏈與糖蛋白的連接方式，可以將糖蛋白中糖鏈的結構分為兩類一種糖鏈類型為氮-連接糖鏈，其中糖鏈與蛋白質中天冬酰胺殘基連接；另一種是氧-連接糖鏈，其中糖鏈與蛋白質中絲氨酸或蘇氨酸殘基連接。對于氮-連接糖鏈，在動物、植物、昆蟲、酵母等中有高甘露糖型糖鏈、復合型糖鏈以及雜合型糖鏈。
一種糖蛋白的糖鏈具有一種核心結構(核心糖鏈)。一種核心糖鏈首先是以在細胞內質網中含脂質體的復合物形式合成的，接著轉移到蛋白質上(Annu Rev Biochem 1985；54631-64 Kornfeld R，KornfeldS)。然后，含轉移來的核心糖鏈的蛋白質由內質網輸送至高爾基體，在這里將糖進一步添加到核心糖鏈上以延長糖鏈。在高爾基體中糖鏈的延伸被稱為末端糖鏈合成，這種過程在不同物種中各異。
另外，巖藻糖殘基與核心糖鏈還原末端部分的N-乙酰氨基葡糖殘基的連接方式多種多樣，連接方式取決于不同的物種(Biochem BiophysActa 1999十二月6；1473(1)21，6-36，Staudacher E，Altmann F，Wilson IB，Marz L)。
如上所述，植物具有同動物一樣的糖鏈添加機制。植物是生產有用的糖蛋白的潛在宿主。然而，盡管所生產的蛋白質應該具有生理活性，某些該類蛋白質如果在翻譯后沒有成功地進行加工，不能像生理活性蛋白質一樣呈現本身的活性(特別是在添加糖鏈后)。另外，植物所具備的糖鏈添加機制與動物，特別是人類的不同。因此，可能將一種與預想的動物型糖鏈結構不同的糖鏈添加到蛋白質上，所形成的蛋白質就可能對人具有抗原性(Glycobiology 1999四月；9(4)365-72Cabanes-Macheteau M，Fitchette-Laine AC，Loutelier-Bourhis C，Lange C，Vine ND，Ma JK，Lerouge P，Faye L)。
一種植物糖鏈的特征性結構是其中巖藻糖殘基與核心糖鏈中還原末端部分N-乙酰氨基葡糖連接的方式。已報道這種連接方式隨物種不同而不同 (Biochem Biophys Acta 1999十二月6；1473(1)21，6-36，Staudacher E，Altmann F，Wilson IB，Marz L)。對于植物，已報道了一種α1，3-連接(Biosci Biotechnol Biochem1999一月；63(1)35-9 Palacpac NQ，Kimura Y，Fujiyama K，YoshidaT，Seki T；Biosci Biotechnol Biochem 1997十一月；61(11)1866-71Kimura Y，Ohno A，Takagi S；Eur J Biochem 1991七月1；199(1)169-79 Sturm A)。對于人和大鼠這樣的哺乳動物，已報道了一種α1，6-連接(Glycobiology 1991九月；1(4)337-46 TakeuchiM，Kobata A)。在圖9中，顯示了一種植物和一種動物的復合型糖鏈結構。對于昆蟲細胞，α1，3-連接和α1，6-連接均已發現(GlycoconjJ 1998十一月；15(11)1055-70 Wilson IB，Altmann F；Eur J Biochem1991八月1；199(3)745-51 Staudacher E，Altmann F，Glossl J，Marz L，Scheachter H，Kamerling JP，Hard K，Vliegenthart JF)。
從植物和昆蟲中獲得的有α1，3-糖蛋白連接的糖鏈部分一般來講對人具有抗原性(Glycoconj J 1998十一月；15(11)1055-70 WilsonIB，Altmann F；Int Arch Allergy Immunol 1999二月-四月；118(2-4)4113 Petersen A，Grobe K，Schramm G，Vieths S，AltmannF，Schlaak M，Becker WM；Int Arch Allergy Immunol 1999九月；120(1)30-42 Fotisch K，Altmann F，Haustein D，Vieths S)。
負責在一個N-乙酰氨基葡糖殘基上添加一種巖藻糖殘基的酶的基因，即α1，3-巖藻糖基轉移酶的cDNA，已從一種植物即綠豆中克隆到(J Biol Chem 1999七月30；274(31)21830-9 Leiter H，Mucha J，Staudacher E，Grimm R，Glossl J，Altmann F)。對于哺乳動物，已從人和豬中克隆到α1，6-巖藻糖基轉移酶的cDNA(J Biochem(Tokyo)1997三月；121(3)626-32 Yanagidani S，Uozumi N，IharaY，Miyoshi E，Yamaguchi N，Taniguchi N；J Biol Chem 1996十一月1；271(44)27810-7 Uozumi N，Yanagidani S，Miyoshi E，IharaY，Sakuma T，Gao CX，Teshima T，Fujii S，Shiba T，Taniguchi N)。
N-乙酰氨基葡糖轉移酶I基因的突變體已從擬南芥中獲得。在這種突變體中，糖鏈的加工停滯于N-乙酰氨基葡糖轉移酶I后(PlantPhysiol 1993八月；102(4)1109-18 von Schaewen A，Sturm A，O’Neill J，Chrispeels MJ)。當將從人獲得的N-乙酰氨基葡糖轉移酶I的cDNA導入到這種突變體中，N-乙酰氨基葡糖轉移酶的活性得到恢復(Proc Natl Acad Sci USA 1994三月1；91(5)1829-33 GomezL，Chrispeels MJ)。相反，當將從擬南芥獲得的N-乙酰氨基葡糖轉移酶I的cDNA導入到沒有N-乙酰氨基葡糖轉移酶活性的CHO細胞的變種Lec1中，CHO細胞的N-乙酰氨基葡糖轉移酶活性得到恢復(BiochemBiophys Res Commun 1999八月11；261(3)829-32 Bakker H，LommenA，Jordi W，Stiekema W，Bosch D)。
另外，發現除與一種固定氮的細菌-根瘤菌屬NGR234中的一種結節因子的生物合成相關的基因之外，nodZ基因可以編碼巖藻糖基轉移酶(J Bacteriol 1997八月；179(16)5087-93 Quesada-Vincens D，Fellay R，Nasim T，Viprey V，Burger U，Prome JC，Broughton WJ，Jabbouri S)。
Olsthoorn等報道在百脈根根瘤菌NZP2213中，α1，3-巖藻糖基轉移酶參與結節因子的生物合成(Biochemistry 1998六月23；37(25)9024-32 Olsthoorn MMA，Lopez-Lara IM，Petersen BO，BockK，Haverkamp J，Spaink HP，Thomas-Oates JE)。從百脈根根瘤菌中獲得的一種nodZ蛋白，可以將GDP-β-巖藻糖中的巖藻糖殘基轉移到一種幾丁質寡糖還原末端N-乙酰氨基葡糖殘基的C6位上(ProcNatl Acad Sci USA 1997四月29；94(9)4336-41 Quinto C，WijfjesAHM，Bloemberg GV，Blok-Tip L，Lopez-Lara IM，Lugtenberg BJ，Thomas-Oates JE，Spaink HP)。這種nodZ蛋白與從動物中獲得的α1，6-巖藻糖基轉移酶具有類似的酶活性，但實質上在氨基酸序列水平上沒有同源性(Glycobiology 1991十二月；1(6)577-84 Macher BA，Holmes EH，Swiedler SJ，Stults CL，Srnka CA；Histochem J 1992十一月；24(11)761-70 de Vries T，van den Eijnden DH)。
進一步，當將從百脈根根瘤菌中獲得的具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的nodZ蛋白顯微注射到斑馬魚的受精卵中，胚胎發育中其身體和尾鰭變形(Proc Natl Acad Sci USA 1997七月22；94(15)7982-6Bakkers J，Semino CE，Stroband H，Kijne JW，Robbins PW，SpainkHP；Ann NY Acad Sci 1998四月15；84249-54 Semino CE，AllendeML，Bakkers J，Spaink HP，Robbins PP)。
當將從人獲得的β1，4-半乳糖轉移酶基因cDNA導入到培養的煙草細胞中，在這種植物細胞中獲得了具有轉移的半乳糖殘基的糖鏈結構。隨著來源于人的糖轉移酶基因的導入，植物細胞中糖鏈的加工途徑可被改造(Proc Natl Acad Sci USA 1999四月13；96(8)4692-7Palacpac NQ，Yoshida S，Sakai H，Kimura Y，Fujiyama K，YoshidaT，Seki T)。
另外，Steinkellner已證實，利用從煙草中克隆的N-乙酰氨基葡糖轉移酶IcDNA，可采用反義基因抑制法或轉錄后基因沉默法抑制N-乙酰氨基葡糖轉移酶基因的表達，或減少其表達量(國際分子操作會議，倫敦，安大略省，加拿大，八月.29九月1，1999，Abstract Book，W79，p.46，Steinkellner H)。
發明人辛勤地研究了以上描述的由不同生物體中不同的糖鏈加成功能所造成的問題，并完成了本發明。本發明是用來通過在植物細胞中導入巖藻糖基轉移酶基因解決以上描述的傳統問題，而這種基因最初并不存在于植物細胞中。本發明的目的是提供一種具有動物型糖鏈加成功能的植物細胞，一種從這種植物細胞再生的植物，一種生產該植物細胞的方法，以及一種利用該植物細胞生產動物型糖蛋白的方法。
發明公開本發明涉及一種具有動物型糖鏈加成功能的植物細胞。這種植物細胞含有一個編碼動物來源的酶的導入基因，這種酶可以將一個巖藻糖殘基轉移到糖蛋白中糖鏈還原末端的乙酰氨基葡糖殘基上。
優選的，這種來源于動物的酶是α1，6-巖藻糖基轉移酶。
一方面，本發明涉及一種從該植物細胞再生的植物。
另一方面，本發明涉及一種生產具有動物型糖鏈加成功能的植物細胞的方法。該方法包括在植物細胞中導入一種來源于動物的編碼酶的基因的步驟，其中這種酶可以將一個巖藻糖殘基轉移到糖蛋白糖鏈中的還原末端的乙酰氨基葡糖殘基上。
在另一方面，本發明涉及一種生產具動物型糖鏈的糖蛋白的方法。該方法包括以下步驟通過在植物細胞中導入一種編碼來源于動物的酶的基因，以及一種編碼外源性糖蛋白的基因來轉化植物細胞，其中的酶可將一個巖藻糖殘基轉移到糖蛋白的還原末端的乙酰氨基葡糖殘基上，并且培養獲得的轉化的植物細胞。
本發明也涉及用上述方法所生產的一種糖蛋白。這種糖蛋白具有一個動物型糖鏈。
附圖簡要描述

圖1顯示用于生產本發明中植物細胞的載體pBI221-FT的構建圖。pBI221-FT載體特有的SacI位點被更換為SalI位點。在該位點中插入一個α1，6-FT基因。
圖2顯示用于生產本發明中植物細胞的載體pGPTV-HPT-FT的構建圖。
圖3是一張電泳后顯色的膠的照片，染色體DNA是從轉化株BY2-FT2-13制備并通過PCR進行擴增的。
圖4是一張電泳后顯色的膠的照片，染色體DNA是從轉化株BY2-FT2，3，4和6制備的RNA中通過RT-PCR擴增所獲得的。
圖5是顯示高效液相色譜(HPLC)分析一個結果的圖。
圖6是顯示高效液相色譜(HPLC)分析一個結果的圖。
圖7是顯示高效液相色譜(HPLC)分析一個結果的圖。
圖8是電泳膠印跡PVDF膜顯色后的照片，顯示本發明中應用植物凝血素的植物細胞產生的糖蛋白的分析結果。
圖9是顯示一種植物和一種動物的復合型糖鏈結構的示意圖。在復合型糖鏈結構的核心部分，植物型糖鏈包含一個木糖殘基，而動物型糖鏈也包含一個木糖殘基。另外，一個巖藻糖殘基以α1，6方式與動物型糖鏈最內部的N-乙酰氨基葡糖殘基連接，一個巖藻糖殘基以α1，3方式與植物型糖鏈最內部的N-乙酰氨基葡糖殘基連接。
圖10是一個顯示用于測量α1，6-FT以及一種活性測量體系中底物糖鏈結構的示意圖。
圖11是轉化體BY2-FT3培養細胞所產生的糖蛋白HPLC分析的色譜圖。
圖12顯示從轉化體BY2-FT3培養細胞所產生的糖蛋白的一種糖鏈結構(高甘露糖型糖鏈)的分析結果圖。
圖13顯示從轉化體BY2-FT3培養細胞所產生的糖蛋白的一種糖鏈結構(復合型糖鏈)的分析結果圖。
圖14顯示從轉化體BY2-FT3培養細胞所產生的糖蛋白的一種糖鏈結構(α1，6-巖藻糖連接糖鏈)的分析結果圖。
圖15是一張電泳后顯色的膠的照片，染色體DNA是通過PCR擴增從轉化的植物FT(1)、FT(2)、FT1、FT2和FG3中制備的。
圖16是電泳膠印跡PVDF膜顯色后的照片，顯示本發明中應用植物凝血素的植物細胞產生的糖蛋白的分析結果。
最佳實施方式以下將詳細描述本發明。
本行業中已知的分離和分析蛋白質的方法，以及免疫分析法，除特別提到的以外，可用于本發明中。這些技術可通過市場提供的試劑盒、抗體、標記物以及其它實施。本發明中所使用的技術將在以下的材料與方法部分中進行描述。
根據本發明的方法是針對一種具有動物型糖鏈加成功能的植物細胞，這里所用的術語“動物型糖鏈”是指這樣一種糖鏈，即其中巖藻糖殘基與糖蛋白的核心糖鏈中的還原末端部分存在的N-乙酰氨基葡糖殘基以α1，6方式連接。優選的，巖藻糖殘基是與存在于核心糖鏈的最核心部分的N-乙酰氨基葡糖殘基連接的，而這種核心糖鏈是與蛋白質的天冬酰胺殘基連接的。
植物細胞可以是任何植物細胞。植物細胞可以是培養的細胞、培養的組織、培養的器官或一種植物。優選的，植物細胞應是培養的細胞、培養的組織、或培養的器官，最優選的是培養的細胞。應用于本發明生產方法中的植物類型可以是可用于基因導入的任何類型的植物。可用于本發明中生產方法的植物類型的例子包括，茄科、poaeae、蕓苔科、薔薇科、豆科、瓜科(curcurbitaceae)、唇形科、百合科、藜科、傘形科家族的植物。
茄科家族植物的例子包括煙草屬、茄屬、曼陀羅屬、番茄屬、牽牛花屬的植物。特別的例子包括煙草、茄子、土豆、西紅柿、紅辣椒和牽牛花。
POAEAE家族植物的例子包括稻屬、大麥屬、黑麥屬、甘蔗屬、稻田稗屬和玉蜀黍屬。特別的例子包括大麥、黑麥、稗、高粱和玉米。
蕓苔科家族植物的例子包括蘿卜屬、蕓苔屬、ARABIDOPSIS、WASABIA和薺屬。特別的例子包括日本白蘿卜、油菜籽、擬南芥、日本辣根和薺菜。
薔薇科家族植物的例子包括orunus、蘋果屬(malus)、梨屬(pynus)、草莓屬和玫瑰屬。特別的例子包括李子、桃、蘋果、梨、荷蘭草莓和玫瑰。
豆科家族植物的例子包括大豆屬、豇豆屬、菜豆屬、碗豆、蠶豆屬、花生屬、紅花草屬、紫花苜蓿和苜蓿屬。特別的例子包括大豆、小豆、菜豆、豌豆、蠶豆、花生、苜蓿和紫花苜蓿。
瓜科家族植物的例子包括絲瓜，黃瓜屬和香瓜屬。特別的例子包括南瓜、倭瓜、黃瓜和甜瓜。
唇形科家族植物的例子包括薰衣草屬、薄荷屬和紫蘇屬。特別的例子包括熏衣草，薄荷和白蘇植物。
百合科家族植物的例子包括蔥屬、百合屬、郁金香屬。特別的例子包括洋蔥、大蒜、百合和郁金香。
藜科家族植物的例子包括菠菜屬，特別的例子是菠菜。
傘形科家族植物的例子包括當歸屬、胡蘿卜屬、鴨兒芹屬和芹屬。特別的例子包括日本土當歸、胡蘿卜、北柴胡和芹菜。
優選的，本發明的生產方法中所使用的植物應該是煙草、西紅柿、土豆、稻、玉米、蘿卜、大豆、豌豆、紫花苜蓿或菠菜。更優選的，本發明的生產方法中所使用的植物應該是煙草、西紅柿、土豆、玉米或大豆。
“能將巖藻糖殘基轉移到還原末端的乙酰氨基葡糖殘基的酶”是指植物細胞中糖蛋白的蛋白質部分合成以后，在糖鏈添加過程中可以將巖藻糖殘基轉移到還原末端的乙酰氨基葡糖殘基的酶。這種酶的例子之一是α1，6-巖藻糖基轉移酶。這個酶可使巖藻糖以α1，6的方式連接到糖蛋白離肽鏈最近處的N-端連接的糖鏈的N-乙酰氨基葡糖殘基上，GDP-巖藻糖用作糖的供體。該酶可從任何動物細胞中獲得，優選的是哺乳動物，更優選的是人。
優選的，這個酶定位于細胞的細胞器中。發明人相信，該酶存在于細胞的細胞器中(例如內質網和高爾基體)，并導致巖藻糖以α1，6的方式連接到植物細胞外源蛋白質的還原末端部分所存在的N-乙酰氨基葡糖殘基上。盡管發明人并不拘泥于一種特定的理論。
“能將巖藻糖殘基轉移到還原末端的乙酰氨基葡糖殘基的酶的基因”可以是利用編碼該酶的核苷酸序列從任何動物細胞中分離到的基因，或是一種市售商品。這類酶可經修飾后適應于在植物中表達。對這種分離和修飾，有本行業熟練人員已知的方法。
例如對于哺乳動物，已從人和豬中克隆到α1，6-巖藻糖基轉移酶的cDNA(J Biochem(Tokyo)1997三月；121(3)626-32 YanagidaniS，Uozxumi N，Ihara Y，Miyoshi E，Yamaguchi N，Taniguchi N；Japanese Laid-Open Publication No.10-84975，Japanese Laid-OpenPublication No.10-4959；J Biol Chem 1996十一月1；271(44)27810-7 Uozumi N，Yanagidani S，Miyoshi E，Ihara Y，Sakuma T，Gao CX，Teshima T，Fujii S，Shiba T，Taniguchi N；Japanese Laid-Open Publication No.10-4969，Japanese Laid-OpenPublication No.9-2011191)。已顯示了cDNA的結構。
這里所用的術語“基因”是指結構基因部分。可將操縱序列如啟動子、操縱子和終止子連接到這段基因上，以便在植物中正確表達該基因。
術語“外源性糖蛋白”是指在植物中以基因工程方法表達所得到的糖蛋白。這類外源性糖蛋白的例子包括酶、激素、細胞因子、抗體、疫苗、受體和血清蛋白。酶的例子包括辣根過氧化物酶、激酶、葡糖腦苷脂酶、α-半乳糖苷酶、組織型纖維蛋白溶酶原激活劑(TPa)和HMG-CoA還原酶。激素和細胞因子的例子包括內啡肽、α-干擾素、GM-CSF、G-CSF、絨毛膜刺激激素、白介素-2、β-干擾素、γ-干擾素、紅細胞生成素、血管內皮細胞生長因子、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、促黃體(生成)激素(LH)、甲狀腺刺激激素(TSH)、催乳素和卵巢刺激激素。抗體的例子包括免疫球蛋白G(IgG)和單鏈抗體可變區基因片段(ScFv)。疫苗的例子包括乙型肝炎表面抗原、輪狀病毒抗原、大腸桿菌腸毒素、瘧疾抗原、狂犬病毒G蛋白和艾滋病毒糖蛋白(如gp120)。受體和基質蛋白的例子包括EGF受體、纖維結合素、α1-抗胰蛋白酶和凝集因子III。血清蛋白質的例子包括白蛋白、補體蛋白、纖溶酶原、類皮質酮結合球蛋白、甲狀腺素-結合球蛋白和蛋白質C。
術語“外源性糖蛋白基因”是指從任何動物細胞中分離的基因，可應用核苷酸序列編碼該基因，或市場提供的基因。這類基因可通過修飾以適應在植物細胞中表達。
能將巖藻糖殘基轉移到還原末端的N-乙酰氨基葡糖殘基的酶的基因，以及外源性糖蛋白的基因均可通過本行業中已知的方法導入到植物細胞中。這些基因可分別或同時導入到植物細胞。將基因導入到植物細胞的方法的例子包括土壤桿菌屬法、電穿孔法和粒子轟擊法。
轉移植物細胞的合適的方法包括顯微注射(Crossway等人，BioTechniques 4320-334(1986))、電穿孔(Riggs等人，Proc NatlAcad Sci USA 835602-5606(1986))、土壤桿菌屬介導的轉化(Hinchee等人，Biotechnology 6915-921(1988)；也見Ishida等人，Nature Biotechnology 14745-750(六月1996)的玉米轉化)、直接基因轉移(Paszkowski等人，EMBO J 32717-2722(1984)；Hayashimoto等人，Plant Physiol 93857-863(1990)(水稻))，以及利用以下公司出售的儀器進行彈道粒子加速法Agracetus公司，Madison，Wis以及Dupont公司，Wilmington，Del(見，例如，Sanford等人，美國專利號4945050；以及McCabe等人，Biotechnology6923-926(1998))，也見于Weissinger等人，Annual Rev Genet22421-477(1988)；Sanford等人，Particulate Science andTechnology 527-37 91987(洋蔥)；Svab等人，Proc Natl Acad SciUSA 878526-8530(1990)(煙草葉綠粒)；Christou等人，PlantPhysiol 87671-674(1988)(大豆)；McCabe等人，Bio/Technology6.923-926(1988)(大豆)；Klein等人，Proc Natl Sci USA854305-4309(1988)(玉米)；Klein等人，Bio/Technology 6.559-563(1988)(玉米)；Klein等人，Plant Physiol 91440-444(1988)(玉米)；Fromm等人，Bio/Technology 8833-839(1990)；和Gordon-Kamm等人，Plant Cell 2603-618(1990)(玉米)；Koziel等人，Biotechnology11194-200(1993)(玉米)；Shimamoto等人，Nature 338274-277(1989)(水稻)；Christou等人，Biotechnology 9957-962(1991)(水稻)；Datta等人，Bio/Technology 3736-740(1980)(水稻)；歐洲專利申請EP 0332581(果園草和其它POOIDEAE)；Vasil等人，Biotechnology 111553-1558(1993)(小麥)；Weeks等人，PlantPhysiol 1021077-1084(1983)(小麥)；Wan等人，Plant Physiol10437-48(1984)(大麥)；Jahne等人，Theor Appl Genet 89525-533(1994)(大麥)；Umbeck等人，Bio/Technology 5263-266(1987)(棉花)；Casas等人，Proc Natl Sci USA 9011212-11216(1983年12月)(高粱)；Somers等人，Bio/Technology 101589-1594(1982年12月)(橡膠)；Torbert等人，Plant Cell Reports 14635-640(1995)(橡膠)；Weeks等人，Plant Physiol 1021077-1084(1983)(小麥)；Chang等人，WO 94/13822(小麥)和Nehra等人，The Plant Journal 5285-297(1994)(小麥)。一套特別優選的通過顯微注射轟擊將重組DNA分子導入玉米的實施方案可見于Koziel等人，Tiotechnology 11194-200(1993)，Hill等人，Euphytica 85119-123(1995)和Koziel等人，紐約科學院年鑒792164-171(1996)。另一種優選的實施方案是在歐洲專利0292435中披露的玉米的原生質體轉化法。植物轉化可以用單一種類的DNA或多種類DNA進行(例如聯合轉移)，這些技術均適用于過氧化物酶編碼的序列。
導入植物細胞中基因的表達可用本行業中任何已知的方法觀察。這類方法的例子包括銀染或加強法、免疫印跡法、RNA印跡雜交和酶活性檢測法。表達導入基因的細胞即轉化細胞。
可以表達能將巖藻糖殘基轉移到還原末端的N-乙酰氨基葡糖殘基的酶以及外源性的糖蛋白的轉化細胞表達具有動物型糖鏈的外源性糖蛋白。也就是說，轉化的細胞具有動物型糖鏈加成功能。通過培養這類轉化細胞，可大量生產具有動物型糖鏈的糖蛋白。動物型糖蛋白包含核心糖鏈和外部糖鏈。核心糖鏈由一個甘露糖和一個或一個以上的乙酰氨基葡糖所組成。這類糖蛋白的外部糖鏈包含非還原末端糖鏈部分。外源糖鏈可具有一個直鏈結構或一個支鏈結構。優選的，外部糖鏈可具有一個支鏈結構。支鏈糖鏈部分有一、二、三或四級結構。用這類轉化細胞生產的糖蛋白優選的包含以α1，6-方式連接到離糖蛋白肽鏈最近的N端糖鏈的N-乙酰氨基葡糖上的任何巖藻糖殘基。
這些轉化的植物細胞可以是培養的細胞或分化成特異組織或器官的形式。替代地，這些細胞也可以再生為植物。在這種情況下，轉化的植物細胞可以分布于整個植物中或存在于植物特定的部位，例如種子、果實、果核、葉子、根、干或植物的花。
對于培養來講，轉化的植物細胞的分化和再生均使用本行業已知的方法和培養基。培養基的例子包括MURASHIGE-SKOOG(MS)培養基、GAMBORG B5(B)培養基、WHITE培養基和NITSCH&NITSCH(NITSCH)培養基，然而，本發明并不僅限于此。這類培養基一般在添加合適量的植物生長調節物(例如植物激素)及同類物以后使用。
這些體系在不同植物株的應用取決于該植物株從原生質體再生的能力。已有描述谷類由原生質體再生的示范性方法(Fujimura等人，Plant Tissue Culture Letters，274，1985；Toriyama等人，TheorAppl Genet，7316，1986；Yamada等人，Plant Cell Rep，485，1986；Abdullah等人，Biotechnology，41087，1986)。
對于不能由原生質體成功轉化的植物株，可利用其它將DNA導入完整細胞或組織的方法。例如，谷類可按描述的方法由不成熟的胚胎或外植體有效再生(Vasil，Biotechnology，6397，1988)。
土壤桿菌介導的轉化也是在植物細胞中導入基因所廣泛應用的體系，這是由于DNA可導入到整個植物組織中，從而越過了從原生質體到完整植物的再生的需要。應用土壤桿菌介導的植物整個載體向植物細胞中導入DNA是本行業中熟知的方法。例如，本方法在以上已進行了描述。
由轉化植物細胞生產的具動物型糖鏈的糖蛋白可從植物細胞中分離或萃取。分離糖蛋白的方法可以是本行業已知的任何方法。本發明中的糖蛋白可應用于食品中，而糖蛋白仍存留于轉化的細胞中。本發明中植物細胞生產的糖蛋白由于添加了動物型糖鏈，可以在動物、特別是人身上注射而沒有抗原性。
(實施例)實施例中使用的材料、試劑以及操作步驟將在以下的材料與方法部分進行描述。
(實施例1在培養的煙草細胞中導入α1，6-巖藻糖基轉移酶基因(此后指α1，6-FT))應用可以感染植物細胞的土壤桿菌在培養的煙草細胞中導入α1，6-巖藻糖基轉移酶基因。土壤桿菌農桿根瘤菌經常用于轉化雙子葉植物。最近的研究顯示，Ti質粒上的vir區編碼的一組基因參與了腫瘤的形成。當感染植物時，土壤桿菌接受由雙子葉植物分泌的作為感染信號的酚，然后激活vir基因組的轉錄。結果，vir基因編碼的幾個蛋白通過切割、轉移，摻入T-DNA基因。單個的T-DNA和vir基因不具備腫瘤形成的能力。即使當T-DNA和vir基因存在于同一土壤桿菌細胞但在不同復制子時，T-DNA和vir基因可以共同致癌。利用一個雙載體導入外源性基因的方法利用了這種特性。
在這個實施例中，來源于人α1，6-FT(序列鑒定號2)的cDNA(序列鑒定號1)，例如糖轉移酶(α1，6-FT亞克隆所得到的pBluescript-FT由大阪大學醫學系的Naoyuki Taniguchi惠贈)插入到T-DNA區域以構建雙載體pGPTV-HPT-FT、pGPTV-DHFR-FT和pGPTV-BAR-FT。這種雙載體的構建方案以圖1和圖2表示。
最初，利用pBluescript-FT為模板，通過PCR擴增所獲得的α1，6-FT基因片段用限制性內切酶進行消化。同樣，將該基因片段插入到PBI221載體(CLONTECH LABORATRIES INC)，通過PCR對其限制性酶切位點進行修飾以獲得一個pBI221-FT載體(圖1)。引物參照Yanagidani等人的報告而產生(J Biochem(Tokyo)1997三月；121(3)626-32 Yanagidani S，Uozumi N，Ihara Y，Miyoshi E，Yamaguchi N，Taniguchi N；J Biol Chem 1996十一月1；271(44))。
另外，XbaI-EcoRI片段含有一個CALIFLOWER花葉病毒35S啟動子基因，α1，6-FT，并從pBI221-FT載體中切掉一個胭脂堿合成酶終止子基因。XbaI-EcoRI片段摻入到三個植物轉化雙載體pGPTV-HPT(例如從美國典型培養物保藏中心(ATCC，12301 Parklawn Drive，Rockbill，Maryland USA 20852)獲得的ATCC77390)、pGPTV-DHFR(例如，ATCC77390從ATCC獲得)pGPTV-BAR(例如，ATCC77391從ATCC獲得)(圖2)。這三種雙載體在其T-DNA區域具有不同的抗藥性基因，因此可以使用不同的藥物篩選轉化的植物細胞。
制備三種不同抗藥性表達基因(即pGPTV-HPT-FT、pGPTV-DHFR-FT和pGPTV-BAR-FT)的原因是，用于篩選轉化細胞的藥物和導入的糖轉移酶對細胞具有不可知的影響。尚未發現一種可以確定應用于該情況的篩選的藥物。因此，提前構建了三種α1，6-FT的表達載體。構建這三種載體主要是源于這樣的觀點，即當將來將多個外源基因導入到同一克隆中時，含具備不同作用機制的篩選標記的載體是有用的。
在制備的表達載體中，pGPTV-HPT-FT在這個實施例中用來轉化一種煙草BY2的培養細胞。
土壤桿菌是用Bevan等人的三親株交配法轉化的(Bevan M，Nucleic Acid Res，12，8711，1984)。含有pGPTV型質粒(Plant MolBiol 1992十二月；20(6)1195-7 Becker D，Kemper E，Schell J，Masterson R)的大腸桿菌DH5α(suE44，ΔlacU169，(Φ80lazΔM15)，hsdR17)(Bethesda Research Laboratories IncFocus8(2)，9(1986))，以及含有輔助質粒pRK2103(Bevan M，Nucleic AcidRes，12，8711，1984)的大腸桿菌HB101分別在含12.5mg/l四環素、50mg/l卡那霉素的2×YT培養基中37℃過夜培養。土壤桿菌農桿根瘤菌EHA101(Elizanbeth EH，J Biacteriol，168，1291，1986)在含50mg/l卡那霉素、25mg/l氯霉素的2×YT培養基中28℃培養兩晚。然后，每種培養液取1.5ml到Eppendorf管中。收集到每種菌株的細胞后，用LB培養液將細胞洗三遍。以這種方式獲得的細胞接著用100μl 2×YT培養液懸浮，與三種細菌混合，涂布到2×YT瓊脂培養基上，在28℃培養，然后pGPTV型質粒從大腸桿菌結合轉移到土壤桿菌。兩天后，將出現在2×YT瓊脂培養基上的某些菌落用白金環轉移到含50mg/l卡那霉素、12.5mg/l四環素和25mg/l氯霉素的LB瓊脂培養皿中。將內容物在28℃培養2天后，可篩選到單菌落。
培養的煙草細胞的轉化是用An G.，Plant Mol Bio Mannual A3，1所描述的方法。首先，將100μl含pGPTV型質粒的土壤桿菌EHA101在含12.5mg/l四環素的LB培養基中，于28℃培養48小時，在培養的第四天，將4ml培養的煙草細胞煙草屬煙草L.cv.亮黃2的懸液(菌株號BY2是從Tsukuba生命科學研究中心基因庫的植物細胞發展組，用分類號RPC1獲得的)在一個培養皿中充分混勻，并在暗處于25℃放置。兩天后，從培養皿中取出部分溶液，通過離心(1000rpm，5分鐘)分離上清。細胞沉淀加入到新的培養基中并再次離心。將細胞接種到含20mg/l潮霉素和250mg/l羧芐青霉素的加強LS瓊脂皿中，在暗處于25℃放置。兩至三星期后，將生長到胼胝期的細胞轉移到新的培養皿中，并挑選生長的菌落。再過兩到三星期后，傳代后將菌落轉移到30ml含潮霉素和羧芐青霉素的加強型LS瓊脂皿中。由于篩選中用了潮霉素，獲得一個轉化的胼胝的時間(約5星期)是平常的兩倍。對于所得到的轉化的胼胝，用含潮霉素的選擇性培養基再重復篩選約一個月。從這種方法所獲得的抗性菌株中隨機選擇12個抗性菌株(BY2-FT2至13)，用于DNA水平的分析。
(BY2-FT細胞DNA水平的分析)所獲得的轉化菌株BY2-FT2至13的研究如下利用其胼胝，根據以下材料和方法部分第10節所描述的方法，制備基因組DNA，α1，6-FT基因的摻入用PCR檢測(見材料和方法部分12)。對于PCR，引用以下的引物FT-Xba5’-TGGTTCCTGGCGTTGGATTA(序列鑒定號3)，和FT-Sal5’-GGATATGTGGGGTACTTGAC(序列鑒定號4)。PCR擴增產物用材料和方法部分第8節所描述的方法進行電泳，結果表示于圖3。
如圖3所顯示，11個菌株即BY2-FT2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和13在1700bp附近顯示條帶，被認為是α1，6-FT基因區的擴增片段。相對照，從培養的野生型煙草細胞中制備的基因組DNA用于模板時，未發現條帶(在圖3的右邊用WT指示的電泳道)。因此，確定α1，6-FT基因摻入到BY2-FT細胞的染色體中。
(BY2-FT細胞RNA水平的分析)在PCR分析證實導入的α1，6-FT基因是基因組DNA的轉化子中，研究了具有高生長率的4株菌株BY2-FT2、3、4和6。其中的RNA是根據下面材料與方法第11節中所描述的方法制備的，進行了RT-PCR(見下面材料與方法第13節)。結果顯示于圖4中。RT-PCR中所使用的引物與以上描述的一致，擴增產物用以上DNA分析中描述的相同條件進行電泳。如圖4中所顯示的結果，觀察到所有4株菌株在1700bp附近顯示條帶，被認為是α1，6-FT基因區的擴增片段。野生型BY2株中未發現擴增條帶(圖4中WT所指示的泳道)。進一步，用根據一種CaWV35S啟動子序列所設計的引物(CaWV引物)(序列鑒定號5)和FT-Sal引物進行RT-PCR，結果沒有條帶(圖4中第A道)。CaWV引物5‘-CGTCTTCAAAGCAAGTGGAT(序列鑒定號5)。
在這些實驗中，用制備RNA標本的試劑盒所制備的RNA液有可能被基因組DNA污染。在RT-PCR之前，所有制備的RNA標本均經過了DNA酶的處理。在使用經DNA酶處理的RNA標本作模板進行PCR的情況中，未發現擴增條帶(圖4的B道)。因此，證實上述的條帶不是從DNA擴增的片段。
(α1，6-FT酶活性的觀察)在這些實驗中所使用的檢測α1，6-FT活性的一種α1，6-FT活性檢測試劑盒中，一種具有圖10上端所顯示的結構的熒光素標記糖鏈是一種底物糖鏈。熒光素標記糖鏈是在Toyobo Co公司制備的，參照以下Yazawa等人和Seko等人的報告(Glycoconj J 1998九月；15(9)863-71 Yazawa S，Kochibe N，Nishimura T，Shima C，TakaiI，Adachi M，Asao T，Hada T，Enoki Y，Juneja LR；Biochim BiophysActa 1997四月17；1335(1-2)23-32 Seko A，Koketsu M，NishizonoM，Enoki Y，Ibrahim HR，Juneja LR，Kim M，Yamamoto T)。具有一個連接的天冬酰胺殘基的糖鏈是從卵黃中制備的(Gn和Gn-bi-Asn)。一種熒光底物(4-氟-7-硝基苯呋咱(NBD-F，Dojin KagakuKenkyujo))貼附于天冬酰胺殘基(Gn，Gn-bi-Asn-NBD)。傳統上，還原末端是由2-氨基吡啶進行熒光標記的PA糖鏈是用于檢測糖轉移酶的活性的。然而，在這種PA糖鏈中，還原末端的N-乙酰氨基葡糖有一個開-環結構。因此，PA糖鏈不能作為α1，6-FT的底物糖鏈。因此，嘗試了用于檢測α1，6-FT活性的多種受體糖鏈和方法。
反應產物在材料和方法第18.3節中所描述的條件下進行了HPLC分析。未反應的底物在約9.5分鐘洗脫(在圖5的上部)，而一種α1，6-巖藻糖化的糖鏈標準品在約15分鐘洗脫(圖5的底部)。mRNA的表達在RNA水平分析時觀察到的BY2-FT2、3、4和6的研究如下。根據材料和方法第14或18.1節制備了一種酶的粗提液。這種酶的粗提液與α1，6-FT活性檢測試劑盒進行反應。反應液進行HPLC分析。結果在洗脫至約15分鐘時，BY2-FT3、4和6的酶粗提液的反應液顯示一個峰組合(在圖6的中和下部，以及圖7的上部)。這個洗脫時間與α1，6-巖藻糖化糖鏈標準品的洗脫時間一致。
進一步，對含培養的煙草細胞的植物中存在的α1，3-巖藻糖基轉移酶(α1，3-FT)，Studacher等人(GlycoconjJ 1995十二月；12(6)780-6 Staudacher E，Dalik T，Wawra P，Altmann F，Marz L；Glycoconj J 1998一月；15(1)89-91 Roitinger A，Leiter H，Staudacher E，Altmann F)已報道，從Mung綠豆中所獲得的α1，3-FT絕對需要如Mn2+和Zn2+這樣的二價陽離子，并且在沒有這樣的陽離子時無活性。在該實施例中，在α1，6-FT活性檢測試劑盒和α1，3-FT酶粗提液中沒有添加二價陽離子。有鑒于此，建議在HPLC分析中洗脫至15分鐘時所發現的峰不是α1，3-巖藻糖化糖鏈。事實上，野生型BY2樣品HPLC圖中，在洗脫15分鐘的位置，未發現對應的洗脫峰(圖7下部)。
(α1，6-巖藻糖基轉移酶特異活性的檢測)檢測了從BY2-FT3、4和6中所獲得的蛋白粗提液的α1，6-巖藻糖基轉移酶的特異活性。這種特異活性是根據以下的材料和方法中第18.4節所描述的HPLC層析譜評價的。結果，未轉化的BY2菌株(圖1中用WT指示)的特異活性低于檢測極限，而BY2-FT6株顯示6.03U/mg蛋白質的最高特異活性(表1)，其中1U是指每分鐘轉化1pmol底物所需的酶量。
表1BY2-FT的酶粗提物中α1，6-FT的特異活性

1U1pmol/min(實施例2α1，6-FT對培養的煙草細胞中糖蛋白的影響)BY2-FT細胞中導入的α1，6-FT對糖蛋白的影響是采用豌豆凝集素(PSA)進行研究的，豌豆凝集素的天冬酰胺連接型糖鏈的還原末端存在的N-乙酰氨基葡糖殘基以α1，6方式與一個巖藻糖殘基緊密連接。首先，根據材料與方法第14節所描述的方法，從BY2-FT細胞中制備蛋白粗提物，粗提蛋白的大約濃度是通過測量A280吸光度值得到的(材料與方法第15節)。根據以下材料與方法第16和17節，對蛋白粗提物進行SDS-PAGE。然后，進行凝集素染色。
圖18中的結果顯示轉化細胞中的糖蛋白糖鏈在約23KDa處有對應的染色，通過與未轉化的BY2菌株比較，表明與凝集素有反應(圖8右邊用WT所指示的泳道)。該結果提示在BY2-FT2、3和4細胞的糖蛋白中，存在一個α1，6-巖藻糖殘基。未轉化的BY2(WT)細胞有輕微的染色。考慮原因是PSA與所存在的植物復合型糖鏈上的其它巖藻糖殘基有親和力(包括α1，3-巖藻糖殘基)。應該注意，圖8中用A所指的泳道是電泳的膠使用甲狀球蛋白作陽性對照作印跡所獲得的，顯示與凝集素的反應是陽性的。
(實施例3轉化的培養煙草細胞所產生的糖蛋白的分析)選擇了3株具有最高生長率的BY2-FT菌株。分析了具有導入的α1，6-FT基因的轉化細胞所產生的糖蛋白的糖鏈結構。
1.由菌株BY2-FT3生產的糖蛋白的制備將BY2-FT3(培養的煙草細胞)的培養細胞(濕重約3kg)用一個玻璃勻漿器進行研磨，從而獲得細胞的裂解物。這些細胞裂解物在4℃、12000rpm離心20分鐘，從而得到含糖蛋白的的上清液。上清液用去離子水進行透析(1.5×104倍稀釋)，然后冷凍干燥，從而獲得干粉標本。
2.N-連接糖鏈的制備然后，將這些干粉標本在100℃肼解10小時，從而從糖蛋白中切掉糖鏈。在肼解產物中加入過量的丙酮，再于4℃、8000rpm離心20分鐘以沉淀糖鏈。在得到的沉淀中加入飽和的碳酸鈉溶液和N-乙酸酐以使糖鏈乙酰化。然后，將得到的反應產物用Dowex 50×2(MuromachiKagaku Kogyo)進行脫鹽。進一步，將得到的溶液應用到0.1N氨水平衡過的TSK gel YOYO PERAL HW-40(TOSOH)凝膠過濾柱(2.5×30cm)，以使N-連接的糖鏈復性。
3.吡啶基氨基(PA)糖鏈的制備復性后的N-連接糖鏈用2氨基吡啶轉換為PA糖鏈。PA糖鏈通過用0.1N氨水平衡過的TSK凝膠YOYO PERAL HW-40(TOSOH)凝膠過濾柱(2.5×30cm)進行純化。
4.用HPLC對PA糖鏈進行分級和分析PA糖鏈的結構用反相(RP)HPLC和體積分級(SF)HPLC進行分析，用外源性糖蛋白酶消化進行雙向糖鏈描圖，并進行MALDI-TOF MS分析。
HPLC分析采用的是裝有日立公司FL檢測器L-7480的日立HPLC系統，其中熒光的密度是在310納米的激發波長和380納米的熒光波長檢測的。RP-HPLC分析采用的是Cosmosil5C18-P柱(6×250mm；Nacalai Tesque)，PA糖鏈的洗脫是通過以1.2ml/min的流速，在40分鐘內將0.02％TFA水溶液中乙腈的濃度從0％增加到6％。SF-HPLC分析是采用Asahipak NH2P-50柱(4.6×250mm；Showa Denko)，PA糖鏈的洗脫是通過以0.7ml/min的流速，在25分鐘內將去離子水-乙腈混合液中乙腈的濃度從26％增加到50％。
PA糖鏈的結構是用雙向糖鏈描圖評價的，其中洗脫時間是用反相(RP)HPLC和體積分級(SF)HPLC進行比較的。
5.用外源性糖蛋白酶消化分析PA糖鏈利用N-乙酰氨基葡糖酶(肺炎雙球菌；Roche)進行酶消化的研究如下每種PA糖鏈在含3mUN-乙酰氨基葡糖酶的50mM醋酸鹽緩沖液(pH5.45)中于37℃反應2天。α-L-巖藻糖酶的酶反應是在含10mMα-L-巖藻糖酶的0.1M醋酸鹽緩沖液(pH5.45)中于37℃反應2天。每種酶的消化反應是通過100℃煮沸3分鐘來終止，然后在12000rpm離心5分鐘。上清進行HPLC分析。糖鏈標本的洗脫時間與已知糖鏈的洗脫時間進行比較。
6.MALDI-TOF MS分析MALDI-TOF MS分析是采用PerSeptive生物系統Voyager DE RP工作平臺進行的。
7.由菌株BY2-FT3獲得的PA糖鏈的結構從約3公斤BY2-FT3所制備的PA糖鏈用RP-HPLC和SF-HPLC進行純化。特別的，由RP-HPLC所得到的成分(1至10)(見圖11A所示的層析譜)進行復性，再進行SF-HPLC。由SF-HPLC所得到的1-9的峰再進一步進行SF-HPLC分析，共得到55個峰(部分數據表示于圖11B)。其中的部分峰含有多個PA糖鏈。在這種情況時，這些峰再做一次SF-HPLC，從而可完全純化糖鏈。
對應于55個峰的組分中，組分4D-V、5A-III、5C-III、5D-II、6B、6F-I和7E可由巖藻糖苷酶切割，分解的產物在完整產物之前用RP-HPLC進行洗脫(未顯示數據)。這種情況提示這些糖鏈包含α1，6-巖藻糖(Glycoconj J 1998一月；15(1)89-91用于檢測Fuc與天冬酰胺連接的GlcNAc巖藻糖基轉移酶的HPLC方法。Roitinger A，Leiter H，Staudacher E，Altmann F)。
每個糖鏈的結構用雙向糖鏈描圖法分析，外源性糖蛋白酶消化，或MALDI-TOF MS分析。結果，糖鏈結構表示于圖12至14。
組分4D-V、5C-III和5D-II的PA糖鏈有與M3FFX(1413.33)基本相同的m/z(1413.59)。用巖藻糖苷酶處理的PA糖鏈在雙向糖鏈描圖與M3FX匹配，而且也有與M3FFX(1267.19)基本相同的m/z(1267.36)。
組分6B和5A-III的PA糖鏈有與M2FFX(1251.19)基本相同的m/z(1251.57)(圖14)。用巖藻糖苷酶處理的PA糖鏈有與M2FX(1105.05)基本相同的m/z(1105.79)。
組分6F-I的PA糖鏈有與Gn1M3FFX(1616.52)基本相同的m/z(1616.14)(圖14)。用巖藻糖苷酶處理的PA糖鏈在雙向糖鏈描圖與Gn1M3FX匹配，而且也有與Gn1M3FX(1470.38)基本相同的m/z(1470.35)。
組分7E的PA糖鏈有與M5F(1459.36)基本相同的m/z(1459.33)(圖14)。用巖藻糖苷酶處理的PA糖鏈在雙向糖鏈描圖與M5A匹配，而且也有與M5A(1313.22)基本相同的m/z(1313.43)。
組分5CII3II和5DI2II的PA糖鏈與M5A在雙向糖鏈描圖匹配，與M5A(1313.22)有基本相同的m/z(1313.14)。
組分4F的PA糖鏈與M6B在雙向糖鏈描圖匹配，與M6B(1475.36)有基本相同的m/z(1475.82)。
組分3B的PA糖鏈與M7B在雙向糖鏈描圖匹配，與M7B(1637.50)有基本相同的m/z(1638.35)。
組分2C的PA糖鏈與M7A在雙向糖鏈描圖匹配，與M7A(1637.50)有基本相同的m/z(1638.33)。
組分2D中1E峰的PA糖鏈與M8A在雙向糖鏈描圖匹配，與M8A(1475.36)有基本相同的m/z(1800.44)。
進一步，組分1AIII和2A中的PA糖鏈與M3FX在雙向糖鏈描圖匹配，組分5CIII的PA糖鏈與M3X在雙向糖鏈描圖匹配。當用N-乙酰氨基葡糖苷酶切割組分7C中PA糖鏈時，在SF-HPLC分析中，片段的洗脫位置移動的數量對應于一個GlcNAc1。片段與M3X在雙向描圖匹配，與GnM3X(1324.24)有基本相同的m/z(1324.83)。因此，組分7C的PA糖鏈被認為是Gn1M3X(見圖13中每種糖鏈的結構)。
當用N-乙酰氨基葡糖苷酶切割組分5CII2和5DI1中的PA糖鏈時，在SF-HPLC分析中，片段的洗脫位置移動的數量對應于一個GlcNAc1。每個片段與M3X在雙向糖鏈描圖匹配，與GnM3X(1324.24)有相同的m/z(1324.61)。因此，組分5CII2和5DI1的PA糖鏈被認為是Gn1M3X。這些PA糖鏈的洗脫位置與RP-HPLC分析中組分7C的PA糖鏈不同。因此，認為這些PA糖鏈是結構變異體。
當用N-乙酰氨基葡糖苷酶切割組分4EI中的PA糖鏈時，在SF-HPLC分析中，片段的洗脫位置移動的數量對應于一個GlcNAc1。片段與M3FX在雙向糖鏈描圖匹配，與GnM3FX(1470.38)有相同的m/z(1471.21)。因此，組分4EI的PA糖鏈被認為是Gn1M3FX。
當用N-乙酰氨基葡糖苷酶切割組分2BII的PA糖鏈時，在SF-HPLC分析中，片段的洗脫位置移動的數量對應于一個GlcNAc1。片段與M3FX在雙向描圖中匹配，其m/z為1471.29，與GnM3FX(1470.38)基本相同。因此，組分2BII的PA糖鏈被認為是Gn1M3FX。這個PA糖鏈的洗脫位置與RP-HPLC分析中組分4EI的PA糖鏈不同。因此，認為組分2BII的PA糖鏈是結構變異體。
組分3A的PA糖鏈有與Gn2M3FX(1673.57)基本相同的m/z(11674.56)。當用N-乙酰氨基葡糖苷酶切割組分3A中的PA糖鏈時，在SF-HPLC分析中，片段的洗脫位置移動的數量對應于GlcNAc1的2倍數量。片段與M3FX在雙向糖鏈描圖匹配，因此，組分3A的PA糖鏈被認為是Gn2M3FX。
對于數據，如m/z數值和雙向糖鏈描圖結果，其它糖鏈與任何N-連接糖鏈不匹配。可以判斷其它糖鏈并不是N-連接糖鏈。
如上所述分析的結果，N-連接糖鏈的比例以百分比表示。高甘露糖型糖鏈占10.8％，復合型糖鏈占28.1％，α1，6-巖藻糖連接糖鏈占61.1％。α1，6-巖藻糖連接于由α1，6-巖藻糖苷酶基因轉化的BY2-FT3中61.1％的糖鏈。
如上所述，α1，6-巖藻糖連接于由α1，6-巖藻糖苷酶基因轉化的BY2-FT3中61.1％的糖鏈。然而，α1，3-巖藻糖或β1，2-木糖也連接于α1，6-巖藻糖連接糖鏈。有報道指出，α1，3-巖藻糖或β1，2-木糖有可能對動物具有抗原性。為使這種糖鏈的結構不可能對動物造成抗原性，有必要滅活α1，3-巖藻糖基轉移酶或β1，2-木糖轉移酶。這是通過篩選或生產一種植物宿主的變種來實現的，其中不含α1，3-巖藻糖基轉移酶活性或β1，2-木糖轉移酶活性，或通過一種酶基因來抑制基因的表達。
抑制基因表達是通過反義技術實現的(Wenderoth I，von SchaewnA“植物N-乙酰氨基葡糖轉移酶I的分離和鑒定”，“擬南芥cgl突變體和反義植物中的功能分析”Plant Physiol 2000七月；(3)1097-1108)，利用嵌合DNA-RNA寡糖產生一種位點特異性突變(Beetham PR，Kipp PB，Sawycky XI，Arntzen CJ，May GD“一種用于功能性植物基因組的工具嵌合DNA-RNA寡核苷酸在體內導致基因特異性突變”，Proc Natl Acad Sci USA 1999七月；96(15)8774-8778)，用一種植物病毒實現基因沉默(Covey SN，Al-Kaff NS.“植物DNA病毒與基因沉默”Plant Mol Biol 2000六月；43(2-3)307-322)。這些技術在本行業中已知。
(實施例4從轉化的煙草細胞再生而產生植物以及由該植物所產生的糖蛋白的分析)1.滅菌的煙草植物的產生將1粒煙草種子(Nicotiana tabacum SR1(從日本煙草公司的煙草葉實驗室所獲得，700 Higashihara，Toyoda-cho，Iwata-gun，Shizuoka))放入1.5ml微量離心管中，在管中加入70％乙醇。將離心管搖動3分鐘以對種子進行滅菌，然后，棄乙醇溶液。用1ml滅菌水洗種子。接著在試管中加入1ml安替佛民(antiformin)溶液(市售次氯酸鹽溶液的10倍稀釋液)，放置15分鐘，并間隔搖晃。然后，去掉安替佛民溶液，并用滅菌水將種子洗3遍。
另一方面，在一個培養皿中將奧古佩寧(由Meiji Seika Kaisha公司生產)稀釋至終濃度為160mg/l。將1張滅菌濾紙浸入到培養皿中，煙草種子在濾紙上發芽。將發芽的種子轉移至MS培養基，并在一個明亮的環境中培養。將長成的煙草SR1株植物在芽的頂端4厘米處用刀切，切下來的植物種植于新的MS培養基中生根，并進一步培養于明亮的環境中。
2.煙草植物的轉化根據An等人描述的方法(An，G，Ebert PR，Mitra A and Ha SB(1988)Binary vectors. In Plant Molecular Biology Manual A3，1-19，Academic Dordrecht)轉化煙草植物。
簡言之，從罐中的植物上切掉一片無菌的煙草葉，葉子在一個培養皿中切成1cm×1cm2(葉片)。將葉片移到另一個滅菌的培養皿中。將已在2×YT培養基中于28℃培養了2天的5ml土壤桿菌培養液(含pGPTV-HPT-FT的土壤桿菌EHA101)加入培養皿中并充分混勻，然后靜置3分鐘。將葉片取出，并用一個KIM毛巾吸去粘著的多余菌液。接著，將葉片放于MS-NB培養液中(4.0g Murashige-Skoog植物鹽混合物，30g蔗糖，10ml 5％MES-KOH(Ph5.7)，3g結冷膠，0.1mg NAA，1.0mg BAP，10mg鹽酸硫胺，1mg煙酸，1mg鹽酸吡哆辛(pyridoxin)/ml水)，并在明亮處于25℃培養。
2天后，將葉片轉移到一個裝有滅菌水的50ml圓錐管中，通過充分振蕩清洗。在用KIM毛巾將葉片上的水擦干后，將葉片放入滅菌過的培養液中，于25℃培養一周。然后，將葉片移入含潮霉素B(終濃度20mg/L)和羧芐青霉素(終濃度250mg/L)的MS-NB培養液中(芽形成培養液)。長大的胼胝以無菌方式移入含芽形成培養液的玻璃罐中。1個月以后，將植物上含新生蒂的芽和葉子切下，以無菌方式植入含潮霉素B(終濃度20mg/L)和羧芐青霉素(終濃度250mg/L)的MS-NB培養液中(根形成培養液)(注意該培養液與上述的除BAP和NAA之外的基礎培養基MS-NB一樣)，在明亮處于25℃培養直到芽長成根。將罐中長大的植物移入盤中繼續生長，這樣就得到了含FT(1)、FT(2)、FT1、FT2和FT3的轉化植物。
3.從煙草植物中制備染色體DNA將分別從轉化植物FT(1)、FT(2)、FT1、FT2和FT3中得到的約100g植物標本凍于液氮中。將這些凍存的標本研磨碎之后，用微型Daeasy植物試劑盒(QIAGEN)按照其中的操作說明制備染色體DNA。
然后，按照與實施例1中描述的從BY2-FG細胞中擴增基因組DNA相似的條件，對每種染色體DNA進行PCR。實驗證實α1，6-FT基因已摻入到轉化植物的染色體中。采用的引物是，CaMV引物(5’-CGTCTTCAAAGCAAGTGGAT)和FT-Sal(5’-GGATATGTGGGGTACTTGAC)。
類似實施例1，所得到的PCR產物進行電泳。結果顯示于圖14中。如圖14所示，FT(1)、FT(2)、FT1、FT2和FT3在1700bp附近有擴增帶，被認為是α1，6-FT基因區域的擴增片段。另一方面，當以野生型SR1為模板制備基因組DNA時，在1700bp附近沒有發現擴增帶。因此，在轉化植物FT(1)、FT(2)、FT1、FT2和FT3的染色體中摻入了α1，6-FT基因。
4.α1，6-FT轉化植物所產生的糖蛋白的分析植物凝集素染色與實施例2相似，α1，6-FT-介導的轉化體所產生的糖蛋白用豌豆凝集素(PSA)進行分析，PSA與天冬酰胺連接型糖鏈的還原末端存在的N-乙酰氨基葡糖殘基以α1，6方式與一個巖藻糖殘基緊密連接(Yamamoto K，Tsuji T，Osawa T，(1982) Carbohydrate Res，110，283-289，Debray H，Montreuil J，(1989) Carbohydrate Res，185，15-26)。
結果示于圖15中。如圖15所示，轉化植物FT(1)、FT(2)、FT1、FT2和FT3有染色，提示與SR1植物比較，凝集素與糖蛋白的糖鏈有反應。因此，轉化植物的糖蛋白中存在α1，6-巖藻糖殘基。
應當指出的是，盡管SR1植物的凝集素反應水平微弱，但在培養的用α1，6-FT基因轉化的煙草細胞中也觀察到了這種反應，陽性克隆用凝集素進行了篩選。認為可能的原因是PSA凝集素與其它巖藻糖殘基，包括植物混合型糖鏈中存在的α1，3-巖藻糖殘基。
以下將對在上述實施例中所采用的材料與方法進行簡要描述。
材料與方法1.植物，菌株，質粒(1.1植物)作為植物轉化體，使用了一種煙草BY2培養細胞(煙草屬煙草L.cv.亮黃2)。
(1.2菌株)所使用的植物列于表2中。
表2 菌株

(1.3質粒)所用的質粒示于表3中表3 質粒

2.培養基(2.1培養細菌的培養基)2×YT培養基使用的是細菌-胰蛋白胨16g/l，酵母提取物10g/l，氯化鈉5g/l。對于平皿培養基，加入12g/l純化的瓊脂粉。選擇性地加入氨芐青霉素(Meiji Seika Kaisha，Ltd)，卡那霉素(Meiji SeikaKaisha，Ltd)，潮霉素(Wako Chemicals)，氯霉素(Wako Chemicals)，利福平(Wako Chemicals)，鏈霉素(Wako Chemicals)，使終濃度分別為50mg/l，50mg/l，20mg/l，25mg/l，50mg/l，和20mg/l。
(2.2培養煙草細胞的培養基)表4加強的LS培養基(mg/l，)NH4NO31650 CaCl2.2H2O440KNO31900 MgSO4.7H2O370KH2PO4370 Na2.DETA 37.3H3BO46.2 FeSO4.7H2O27.8MnSO4.4H2O 22.3 氫氯硫胺 10ZnSO4.7H2O 8.6 煙酸 1KI 0.83 氫氯吡哆辛 1Na2MoO4.2H2O0.25 內消旋肌醇 100CuSO4.5H2O 0.025 蔗糖 30000CoCl2.2H2O 0.025用氫氧化鉀調pH至5.8進一步，用Murashige-Skoog培養基中的混合鹽制備以上的組合物。
加強型LS瓊脂培養基加強型LS瓊脂培養基中KH2PO4的含量為170mg/l，pH用KOH調為5.8，再在培養基中加入3g/l結冷膠(Wako Chemicals)。選擇性地加入卡那霉素、羧芐青霉素(Wako Chemicals)、潮霉素、氨甲蝶呤(Wako Chemicals)，和雙丙胺磷(Meiji Seika Kaisha公司)，使終濃度分別為150mg/l，250mg/l，20mg/l，0.1mg/l，和10mg/l。
3.試劑和酶除非特別指出，所使用的試劑是從Wako Chemicals和NacaliTesque得到的。限制酶和修飾酶是從Toyobo有限公司、Takara Shuzo有限公司、Nippon Gene，Sigma和NEB公司購得的，使用方法按照其中的說明。
4.大腸桿菌的轉化(4.1感受態細胞的制備)宿主大腸桿菌接種到2ml 2×YT培養基中，并過夜培養。將培養基接種到含200ml 2×YT培養基的sakaguchi燒瓶中。燒瓶在37℃振蕩直到濁度在600nm是0.6，然后進行離心(5000rpm，10分鐘，0℃)。去掉上清，用5ml 50mM的CaCl2和15％的甘油懸浮細菌。然后，將懸浮液分裝于Eppendorf管中，在-80℃保存作為感受態細胞。
(4.2大腸桿菌的轉化)將感受態細胞在冰上融化，然后，將1-15微升DNA溶液加入到感受態細胞中，并在冰上放置30分鐘。接著，將溶液在42℃放90秒，然后放于冰上。將1ml 2×YT培養基加入到溶液中，將感受態細胞在37℃培養1小時，加入到含適量抗生素的瓊脂培養基上，于37℃過夜培養。
5.土壤桿菌的轉化土壤桿菌的轉化采用Bevan等人的三親體雜交方法。簡言之，將含PGPTV型質粒的大腸桿菌和含輔助質粒PRK2013的大腸桿菌于37℃在含抗生素的培養基中分別過夜培養。將土壤桿菌EHA101或LBA4044于28℃在含抗生素的培養基中培養兩夜。
將每種培養液1.5ml倒入到Eppendorf管中，然后離心收集細菌。收集的細菌用2×YT培養基洗兩次，然后再懸于1ml 2×YT培養基中。將三種菌株混合并加入到2×YT培養基中，培養于28℃，以使質粒從大腸桿菌中通過結合轉化到土壤桿菌中。兩天后，將2×YT培養基上出現的部分菌落用白金環轉移到含抗生素的2×YT瓊脂培養基上。在28℃培養兩天后，挑選一個單菌落。
6.培養的煙草細胞的轉化(6.1培養的煙草細胞的傳代)將95ml加強型LS培養基倒入一個300ml Mayer燒瓶中，在暗處于25℃-27℃、120rpm進行振蕩培養。將2ml到達靜止期的培養細胞每7天進行傳代。當第7天沒有得到足夠量的細胞時，將加倍(4ml)的細胞進行傳代培養。
(6.2培養的煙草細胞的轉化)將100微升在含抗生素的2×YT培養基中于28℃培養了兩天的土壤桿菌培養液(含pGPTV型質粒的土壤桿菌EHA101和LBA4044)，在一個培養皿中與4ml培養到第四天的培養煙草細胞懸液混勻，然后將混合液在25℃于暗處靜置。兩天后，將培養皿中的懸液移到一個離心管中，離心(1000rpm，5分鐘)去除上清。在得到的沉淀中加入含250mg/l羧芐青霉素的新培養基，再離心以清洗細胞，這種清洗共重復三次以去除土壤桿菌。將不含土壤桿菌的培養煙草細胞加入到含20mg/l潮霉素和250mg/l羧芐青霉素的潮霉素和250mg/l羧芐青霉素潮霉素和250mg/l羧芐青霉素瓊脂培養基上，在暗處于25℃進行培養。兩至三周后，將長到胼胝階段的細胞轉移到新的加強型LS瓊脂培養基上以篩選生長的菌落。再過兩到三周后，將長到直徑為1厘米的菌落轉移到30ml含潮霉素和羧芐青霉素的加強型LS液體培養基中，并進行傳代培養。
7.小量質粒DNA的制備小量質粒是以Birnboin和Doly’s堿性提取方法從大腸桿菌和土壤桿菌中得到的。將細菌在含抗生素的2×YT培養基中過夜培養(土壤桿菌培養兩夜)。將培養基轉移到一個Eppendorf管進行離心(12000rpm，5分鐘，室溫)收集細菌。所獲得的細菌用100微升溶液I懸浮(對土壤桿菌，含5mg/ml的溶菌酶(Sigma))，并在室溫靜置5分鐘。然后，在懸液中加入200微升溶液II并進行充分振蕩。所得到的混合物在冰上放置5分鐘，接著，在混合物中加入150微升溶液III并進行充分振蕩，所得到的混合物在冰上放置5分鐘。離心后(12000rpm，5分鐘，室溫)，將上清轉移到另一個管中。上清用RNA酶處理(37℃，5分鐘)，經酚-氯仿抽提、乙醇沉淀后，將獲得的沉淀物用適量的TE緩沖液溶解。
TBE緩沖液12.1g/l Tris6.18g/l 硼酸鹽0.7g/l EDTA凝膠-上樣緩沖液0.25％溴酚蘭0.25％二甲苯腈藍40％(w/v)蔗糖8.DNA電泳用TBE緩沖液配制1.0-1.5％(w/v)的瓊脂糖。在5份樣品中加入1份凝膠上樣緩沖液，將樣品加入到凝膠的槽中。所使用的電泳儀是Mupid-2(Cosmobio)。電泳是在1×TBE中用100伏的常壓下進行的。電泳完后，將凝膠在0.5μg/ml溴化乙錠水溶液中浸泡20分鐘。將染色后的凝膠置于穿透性照明燈下觀察。
9.電泳凝膠中DNA片段的復原DNA片段從瓊脂糖凝膠中的復原使用的是一種基因清除II試劑盒(Funakoshi)。將含有目的片段的凝膠移到一個Eppendorf管中。在1份瓊脂糖凝膠中加入1/2份的TBE加強液和4.5份的NaI，將混合物在55℃孵育以使凝膠完全溶解。將5μl基質加入到混合物中并完全混勻，然后，將混合物在冰上放置10分鐘。短促離心后棄上清，用200μl的清洗緩沖液將沉淀物洗三次，再將溶液于55℃洗脫5-10分鐘，進行離心，可獲得含有DNA的上清液。
10.從煙草中制備染色體DNA(10.1從培養的煙草細胞中制備染色體DNA)從培養的煙草細胞中制備染色體DNA使用的是ISOPLANT(NipponGene)。將300μl溶液I加入到大約0.1g培養的煙草細胞中，并完全攪拌。再加入150μl溶液II并用振蕩器完全攪拌。將細胞于50℃孵育15分鐘。再在細胞中加入150μl溶液III，振蕩，并放置15分鐘。離心后(12000rpm，15分鐘，4℃)，將上清用乙醇沉淀兩次，將沉淀溶于20μl TE緩沖液中，并用1μl RNA酶A處理30分鐘。
(10.2從煙草胼胝中制備染色體DNA)用DNeasy Plant Mini Prep Kit(QIAGEN)從胼胝中制備染色體DNA。當胼胝長到直徑大約為1厘米后，將其于液氮中冷凍，用研磨器將胼胝研磨成粉，用這種粉(100mg)作標本按照試劑盒的說明制備DNA。
11.從煙草培養的細胞胼胝中制備總RNA胼胝的總RNA的制備采用RNeasy Mini Prep Kit(QIAGEN)。在這種情況下，用0.05％二甲基焦碳酸鹽處理研磨器、乳缽和滅菌水，然后高壓消毒(120℃，30分鐘)。當胼胝長到直徑大約為1厘米后，將其于液氮中冷凍，用研磨器和乳缽將胼胝研磨成粉，用這種粉(100mg)作標本按照試劑盒的說明制備RNA。
12.PCR(12.1反應體系)將1μl染色體DNA、5μl 10×PCR緩沖液(由Takara Shuzo有限公司生產的Takara ExTaq所附帶)，4μl dNTP(由Takara Shuzo有限公司生產的Takara ExTaq所附帶2.5mM)，引物(每種20pmol)，0.5μl Takara ExTaq(5U/μl，Takara Shuzo有限公司)，以及滅菌水混合并使總體積至50μl。
(12.2反應條件)反應以以下的條件進行。所使用的熱循環儀是PCR系統9700(PEBiosystems)。
第一階段1個循環變性(94℃)5分鐘退火(60℃2分鐘)延伸(72℃3分鐘)第二階段30個循環 變性(94℃)1分鐘退火(60℃2分鐘)延伸(72℃3分鐘)第三階段1個循環變性(94℃)1分鐘退火(60℃2分鐘)延伸(72℃3分鐘)退火溫度根據引物的Tm值而改變。
13.RT-PCR(13.1反轉錄反應)反轉錄反應采用的是RNA PCR試劑盒2.1(Takara Shuzo有限公司)。將5μl MgCl2(5mM)，2μl 10×RNA PCR緩沖液，8.5μl無RNA酶的水，2μl dNTP(1mM)，0.5μl RNA酶抑制劑(1U/μl)，1μl反轉錄酶(0.25U/μl)以及1μl試劑盒中所附的連接Oligo dT的引物(0.125μM)，1μl按上述第11節中所制備的RNA樣本混合，按以下所述的程序進行反應。所采用的熱循環儀是PCR系統9700(PEBiosystems)，循環數是1，1個循環包括50℃30分鐘，99℃5分鐘，以及5℃5分鐘。
(13.2反轉錄反應后的PCR)將6μl MgCl2(2.5mM)，8μl 10×RNA PCR緩沖液，63.5μl滅菌的蒸餾水，0.5μl TaKaRa Taq酶(2.5U/100μl)，以及引物混勻并加入到上述第13.1節已制備的反轉錄反應物中。用一個小離心機離心10秒后，將管子按以下條件進行反應，第1階段1個循環；94℃2分鐘；第2階段45個循環；94℃30秒，60℃30秒，以及72℃1.5分鐘。
14.從培養的煙草細胞中制備蛋白質粗提溶液通過離心收集傳代后第7天的煙草細胞(3000rpm，15分鐘，4℃)，然后，通過輕輕地將管子上下顛倒，將所得到的細胞用等量的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)進行清洗，將這一過程重復三次，然后離心(3000rpm，15分鐘，4℃)。將所收集的細胞轉到一個手持勻槳器中(20ml IKEMOTO)進行研磨。接著將細胞研磨液轉移到一個50ml的離心管中并離心(12000rpm，20分鐘，4℃)，所獲得的上清即蛋白質粗提液。在每50ml提取液中選擇性地加入一顆蛋白酶抑制劑藥片(BOEHRINGERMANNHEIM)。進一步，如果需要粗蛋白的濃縮液，在粗蛋白中選擇性加入硫酸銨(Wako Chemicals)到70％的飽和度，在冰上放置4-5小時，然后離心(12000rpm，20分鐘，4℃)。將所得到的蛋白質懸浮于500μl滅菌水中，用于以下的分析。
15.蛋白質定量用DC蛋白質分析試劑盒(Bio-Rad)進行蛋白質定量。該試劑盒基于Lowly-Folin方法，根據其中的說明，將反應液混勻并于室溫放置15分鐘。然后，測量750nm的吸光度。用小牛白蛋白作標準在0.05-0.4mg/ml的范圍內作標準曲線。以標準曲線作參考，測定蛋白質的量。
16.蛋白質電泳(16.1Tris-甘氨酸十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)是根據Laemmli方法進行的。用于電泳的凝膠，分離膠用的是12.5％的聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠用的是2.5％的聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺＝30∶0.8)，電泳緩沖液采用的是Tris-甘氨酸緩沖液。將12μl樣品在加樣緩沖液中于100℃變性3分鐘，電泳中使用的電壓是100伏恒壓。
(16.2分子量標記)[表7]分子量標記品用的是蛋白質分子量標記品“第一”(DaiichiKagaku Yakuhin)磷酸化酶 97400小牛白蛋白66270醛縮酶42200碳酸酐酶 30000大豆蛋白酶抑制劑 20100
溶菌酶14000或者，預先染色的SDS-PAGE標準(Bio-Rad)磷酸化酶B 106000小牛白蛋白80000卵白蛋白 49500碳酸酐酶 32500大豆蛋白酶抑制劑 27500溶菌酶18500(16.3蛋白質染色)進行了考馬斯蘭染色和銀染。對考馬斯蘭染色，將凝膠浸入到染色液中30分鐘(0.1％考馬斯亮蘭R-250，甲醇∶乙酸鹽∶水＝5∶5∶2(v/v)混合物)，然后浸于脫色液(甲醇∶乙酸鹽∶水＝2∶1∶7(v/V)混合物)并振蕩過夜。銀染是用銀染試劑盒(Wako chemicals)，根據其中所描述的說明進行的。
17.凝集素染色SDS-PAGE電泳后，將凝膠在印跡緩沖液中平衡15分鐘，然后將凝膠中的蛋白質轉印到PVDF膜(Bio-Rad，用于蛋白質印跡的免疫印跡PVDF膜，0.2mm)，使用的是半干式轉印儀(半干式轉移儀BE-310Biocraft)于1mA/cm2的恒流進行60-70分鐘。轉印后，將PVDF膜浸于0.6％H2O2/甲醇(v/v)溶液，以阻斷培養煙草細胞中的內源性過氧化物酶。阻斷后，用沖洗緩沖液(10分鐘，三次)洗PVDF膜，然后將膜浸于含5％脫脂奶的洗液中，在室溫溫和反應兩小時。同樣，將PVDF膜用洗液進行清洗。然后，將PVDF膜浸于用沖洗緩沖液1000倍稀釋的氧化物酶標記的PSA凝集素(1mg/ml，EY LABORATORIES，INC)中，于室溫反應90分鐘。反應后，用上述類似的方法沖洗膜。然后用POD免疫染色盒進行染色(Wako chemicals)。上述沖洗緩沖液的配方是10Mm Tris-HCl(pH7.4)，0.15M NaCl，0.05％吐溫20。
18.α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的測定
(18.1粗酶液的制備)通過離心(3000rpm，20分鐘，4℃)收集培養至第7天的轉化培養煙草細胞，然后用類似于上面第14節中的抽提緩沖液沖洗并收集細胞。接著用一個手持式勻漿器研磨細胞，并離心(12000rpm，20分鐘，4℃)。上清被用作粗酶溶液。以上抽提緩沖液的配方是20mM Tris-HCl(pH7.5)，0.175％CHAPS。
(18.2α1，6-巖藻糖基轉移酶的酶反應)α1，6的活性總是在暗處測定的。使用了一種由Toyobo有限公司提供的底物溶液(15μl)來測量α1，6-巖藻糖基轉移酶的活性。將以上第19.1節中制備的粗酶溶液5μl加入到一個含底物溶液的管子中，于37℃反應三小時，通過煮沸1分鐘來終止酶反應，然后立即將管子移到冰上放置1分鐘，再將管上的冰水去掉。在管中加入80μl去離子水并離心(12000rpm，20分鐘，4℃)。將30μl獲得的上清液進行HPLC分析。每15μl測量α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的底物溶液包括8μl 0.5M MES/NaOH緩沖液(pH7.5)，1nmole/μl Gn，1μl Gn-bi-Asn-NBD，2μl 5nmole/ml GDP-巖藻糖(Wako chemicals)，以4μl超純水。使用的HPLC體系(HITACHI生產)包括接口(L-7000)，熒光檢測儀(LsChrom L-7480)，泵(LaChrom L-7100)以及柱加熱爐(LaChrom L-7300)。
(18.3酶活性的有或無)酶活性的有或無是用HPLC分析測定的。柱子用的是反相Mightysil RP-18 GP150-4.6(5μm)(Kanto Kagaku 4.6×150mm)。用于測量α1，6-FT活性的底物糖鏈進行了熒光標記以使底物糖鏈可以用熒光檢測儀(Ex；470nm，Em；530nm)特異地進行檢測。進一步，用以下方法制備了α1，6-巖藻糖鏈的標準品。將5μl α1，6-巖藻糖基轉移酶(40mU/ml，Toyobo有限公司)加入到底物混合液中，以測量α1，6-巖藻糖基轉移酶的活性，并按上面第1.18節中的方法與37℃反應15分鐘。
(18.4活性的測定)計算了按以下條件進行的HPLC分析中底物的峰面積與反應產物的峰面積的比值，活性的計算是按每分鐘于每毫克粗酶溶液蛋白質中轉化巖藻糖的量。粗酶溶液中總蛋白的量是以上述第15節中描述的方法定量的。
緩沖液A20mM 乙酸氨 pH4.0緩沖液B20mM 乙酸氨 pH4.0-80％乙腈緩沖液比率B＝5％模式恒溶劑流速1ml/分鐘柱溫度55℃Ex470mmEm530mm工業實用性本發明提供一種具動物型糖鏈加成功能的植物細胞，一種從植物細胞再生的植物，一種生產該植物細胞的方法，一種應用植物細胞生產動物型糖蛋白的方法。本發明中用植物細胞生產的糖蛋白具動物型糖鏈，以使糖蛋白對動物特別是人無抗原性。因此，本發明中的糖蛋白適應于給動物，包括人進行注射。
序列表<110>藤山和仁關達治<120>具有動物型糖鏈加成功能的植物細胞<130>62734A(J1-00356138)<140>PCT/JP02/02091<141>2002-03-06<150>JP2001-062704<151>2001-03-06<160>5<170>Microsoft Word 97 SR-2<210>1<211>1759<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>17..1744<400>
aaaatctctc tagaaa atg cgg cca tgg act ggt tcc tgg cgt tgg att atg 52Met Arg Pro Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met1 5 10ctc att ctt ttt gcc tgg ggg acc ttg ctg ttt tat ata ggt ggt cac 100Leu Ile Leu Phe Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His15 20 25ttg gta cga gat aat gac cat cct gat cac tct agc cga gaa ctg tcc 148Leu Val Arg Asp Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser30 35 40aag att ctg gca aag ctt gaa cgc tta aaa cag cag aat gaa gac ttg 196Lys Ile Leu Ala Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu45 50 55 60
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<223>人工序列的描述引物
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<223>人工序列的描述引物<400>5cgtcttcaaa gcaagtggat 20
權利要求
1.一種具有動物型糖鏈加成功能的植物細胞，其中的植物細胞中導入了編碼動物來源的酶的基因，這種酶可以將一種巖藻糖殘基轉移到糖蛋白糖鏈還原末端的乙酰氨基葡糖殘基上。
2.根據權利要求1所述的植物細胞，其中來源于動物的酶是α1，6-巖藻糖基轉移酶。
3.一種從根據權利要求1或2所述的植物細胞中再生的植物。
4.一種生產具動物型糖鏈加成功能的植物細胞的方法，包括在植物細胞中導入編碼動物來源酶的基因的步驟，其中的酶可以將一種巖藻糖殘基轉移到糖蛋白糖鏈還原末端的乙酰氨基葡糖殘基上。
5.一種生產具有動物型糖鏈加成功能的糖蛋白的方法，包括以下步驟通過在植物細胞中導入一種編碼動物來源的酶的基因和編碼外源性糖蛋白的基因轉化植物細胞，其中的酶可以將巖藻糖殘基轉移到糖蛋白的還原末端的乙酰氨基葡糖殘基上，并且培養所獲得的轉化的植物細胞。
6.一種生產具動物型糖鏈的糖蛋白的方法，包括以下步驟通過在植物細胞中導入一種編碼能將巖藻糖殘基轉移到還原末端的乙酰氨基葡糖殘基上的酶的基因和編碼外源性糖蛋白的酶的基因來轉化植物細胞，并且在細胞器中表達該酶。
7.一種用根據權利要求6所述的方法生產的具動物型糖鏈的糖蛋白。
全文摘要
本發明提供一種具有動物型糖鏈加成功能的植物細胞。這種植物細胞含有一個編碼動物來源的酶的外源基因，這種酶可以將一個巖藻糖殘基轉移到糖蛋白中糖鏈還原末端的乙酰氨基葡糖殘基上。
文檔編號C12N9/10GK1541059SQ02805959
公開日2004年10月27日 申請日期2002年3月6日 優先權日2001年3月6日
發明者藤山和仁, 關達治 申請人:陶氏化學公司