專利名稱：通過發酵生產靶物質的方法
技術領域：
本發明涉及一種發酵工業技術，特別涉及一種通過使用微生物發酵生產靶物質如L-氨基酸的方法。
相關技術描述大腸桿菌(E.coli)的染色體DNA由兩個或更多的DNA結合蛋白折疊成一種所謂類核的核小體樣結構。這些蛋白被稱為類核構建蛋白(nucleoid-structuring proteins)。
FIS(倒位刺激因子)，是主要的類核構建蛋白之一，由存在于大腸桿菌染色體73.4min位置的fis基因編碼。FIS表達在生長期被誘導而在穩定期被抑制。已有報道稱，如果大腸桿菌野生型菌株的fis基因被斷裂，則其在營養豐富的培養基中培養時的生長率下降，更確切地說，在原本應當產生高生長率的條件下，卻表現為當最初生長率不高時其生長率沒有發生變化(非專利文獻1)。在細菌生產物質的條件下，細菌的生長率符合后者的情形。進一步而言，FIS是正負調節兩種或多種基因表達的全局轉錄調節因子，已有報道稱FIS調節轉運RNA和核糖體RNA的表達(非專利文獻2)，也調節包括代謝等方面基因的表達(非專利文獻3)。
作為一種類核構建蛋白，H-NS與FIS一樣，在生長期被誘導并且正負調節兩種或多種基因的表達(非專利文獻4)。H-NS由存在于大腸桿菌染色體27.8min位置的hns基因編碼。
其它主要的類核構建蛋白的實例包括，例如HU、DPS等。HU是一種由hupA和hupB基因分別編碼的Huα和Huβ組成的異源二聚體，hupA和hupB基因分別存在于大腸桿菌染色體的90.5min和9.7min(非專利文獻5)，HU在生長期和穩定期都被表達。DPS由存在于大腸桿菌染色體18.3min的dps基因編碼，其表達在生長期被抑制而在穩定期被誘導(非專利文獻6)。
迄今尚無關于通過調節編碼類核構建蛋白的基因如fis、hns、hupAB和dps基因的表達來提高物質生產的報道。
(非專利文獻1)Nilsson等，生物化學雜志(The Journal of Biololcal Chemistry)，269，9460-9465，1994(非專利文獻2)Nilsson等，EMBO雜志(The EMBO Journal)，9，727-734，1990(非專利文獻3)Xu等，細菌血雜志(Journal of Bacteriology)，177，938-947，1995(非專利文獻4)Hulton等，細胞(Cell)，63，631-642，1990(非專利文獻5)Wada等，分子生物學雜志(Journal of Molecular Biology)，204，581-591，1988(非專利文獻6)Almion等，基因與發育(Genes and Development)，6，2646-2654，1992發明概述本發明的目的是通過使用屬于埃希氏菌屬(Escherichia)細菌的發酵來提高有用物質生產的生產效率或生產率。
本發明的發明人為達到上述目的進行了刻苦研究。結果發現通過修飾編碼普遍存在于大腸桿菌的類核構建蛋白的基因能提高埃希氏菌屬細菌的物質生產。特別是發現通過斷裂埃希氏菌屬細菌的fis基因能提高其生產靶物質的能力，從而實現本發明。
因此，本發明提供(1)一種通過使用屬于埃希氏菌屬的細菌生產靶物質的方法，包括在培養基中培養細菌，生產和積累培養基或細胞中的靶物質，并收集靶物質，其中的細菌具有生產靶物質的能力，且FIS蛋白在細胞中不能正常地起作用。
(2)按照(1)的方法，其中細菌染色體上的fis基因已被斷裂，致使FIS蛋白不能正常地起作用。
(3)按照(1)或(2)的方法，其中的屬于埃希氏菌屬細菌是大腸桿菌。
(4)按照(1)至(3)中的任何一種方法，其中的靶物質是一種L-氨基酸或者一種蛋白。
(5)按照(4)的方法，其中的L-氨基酸是天冬氨酸家族的L-氨基酸。
(6)按照(5)的方法，其中天冬氨酸家族包括賴氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸。
(7)按照(6)的方法，其中所述氨基酸是L-賴氨酸。
附圖簡述
圖1表示菌株sMG1655、MG1655Δfis、MG1655Δhns、MGΔdps和MGΔhupAB的生長圖。
圖2表示WC196和WC196Δfis的生長圖。
圖3表示菌株WC196和WC196Δfis的葡萄糖消耗圖。
圖4表示菌株WC196和WC196Δfis的賴氨酸積累圖。
圖5表示菌株WC196/pCABD2和WC196Δfis/pCABD2的生長圖。
圖6表示菌株WC196/pCABD2和WC196Δfis/pCABD2的葡萄糖消耗圖。
圖7表示菌株WC196/pCABD2和WC196Δfis/pCABD2的賴氨酸積累圖。
發明詳述下面將對本發明進行詳細描述。
本發明使用的屬于埃希氏菌屬的細菌沒有特殊限制，只要它是屬于埃希氏菌屬的微生物且具有生產靶物質的能力。特別是可以使用那些在Neidhardt等人的文章中提到的(Neidhardt，F.C.等，大腸桿菌和傷寒沙門氏菌(Escherichia coliand Salmonella Typhimurium)，美國微生物學切會，華盛頓特區，1208，表1)。更特別提到的是大腸桿菌。
“生產靶物質的能力”是指當本發明使用的埃希氏菌屬細菌在培養基中培養時，在細胞或培養基中生產具有可收集量的靶物質的能力。更確切的是指比野生型或未修飾的埃希氏菌屬細菌菌株生產量更大的靶物質的能力。
靶物質沒有特殊限制，只要可由屬于埃希氏菌屬的細菌生產的物質。該靶物質的實例包括各種L-氨基酸如L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-高絲氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-苯丙氨酸，蛋白質(包括肽)，核酸如鳥嘌呤、次黃苷、鳥苷酸和次黃苷酸，維生素，抗生素，生長因子，生理活性物質等，它們通常通過使用埃希氏菌屬細菌能生產出。進一步而言，本發明甚至可應用于那些迄今尚未通過使用屬于埃希氏菌屬的細菌生產的物質。
靶物質可以是天冬氨酸家族的L-氨基酸。所述家族包括L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-甲硫氨酸。
至于產L-賴氨酸的埃希氏菌屬細菌，可以用具有L-賴氨酸類似物抗性的突變體為例。賴氨酸類似物抑制屬于埃希氏菌屬的細菌的生長，但是當培養基中同時存在L-賴氨酸時，這種抑制變得完全或部分地不敏感。L-賴氨酸類似物的實例包括溶菌素、賴氨酸氧肟酸、S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、α-甲基賴氨酸、α-氯己內酰胺等。對這些賴氨酸類似物具有抗性的突變體可以通過常規的人為誘變處理屬于埃希氏菌屬的細菌而得到。用來生產L-賴氨酸的細菌菌株的特例包括大腸桿菌AJ11442(FERM BP-1543，NRRL B-12185；參見日本專利公開(Kokai)第56-18596號和美國專利第4,346,170號)和大腸桿菌VL611。在這些微生物中，由L-賴氨酸對天冬氨酸激酶的反饋抑制是不敏感的。
除上述以外，需要提到的是，例如后面描述的產L-蘇氨酸細菌，在產L-蘇氨酸細菌中，由L-賴氨酸對天冬氨酸激酶的抑制通常也是不敏感的。
在后面描述的實例中，WC196菌株用作大腸桿菌的產L-賴氨酸細菌。該細菌菌株是通過賦予源自大腸桿菌K-12的W3110菌株以AEC抗性而培育得到。該菌株被命名為大腸桿菌AJ13069菌株，且在國家生物科學和人體技術研究所(現為國家高等工業科學和技術協會，國際專利生物體保藏組織，TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)于1994年12月6日進行了保藏，得到的保藏號為FERM P-14690。然后，該菌株于1995年9月29日被轉移到布達佩斯條約規定的國際保藏單位，得到的保藏號為FERM BP-5252(參見國際專利公開WO96/17930)。
屬于埃希氏菌屬的產L-蘇氨酸細菌的實例包括大腸桿菌VKPM B-3996(RIA1867)(參見美國專利第5,175,107號)、MG442菌株(參見Gusyatiner等，Genetika(in Russian)，14，pp.947-956，1978)等。
屬于埃希氏菌屬的產L-高絲氨酸細菌的實例包括菌株NZ10，它是菌株C600的Leu+回復突變型(參見Appleyard R.K.，遺傳學(Genetics)，39，pp.440-452，1954)。
屬于埃希氏菌屬的產L-谷氨酸細菌的實例包括AJ12624菌株(FERM BP-3853，參見法國專利公開第2,680,178號)和L-纈氨酸抗性菌株如大腸桿菌B11、大腸桿菌K-12(ATCC10798)、大腸桿菌B(ATCC11303)和大腸桿菌W(ATCC9637)。
屬于埃希氏菌屬的產L-亮氨酸細菌的實例包括具有β-2-噻吩丙氨酸抗性的細菌菌株、具有β-2-噻吩丙氨酸抗性和β-羥基亮氨酸抗性的細菌菌株(參見日本專利公開(Kokoku)第62-34397號)和具有4-氮亮氨酸抗性或5，5，5-三氟亮氨酸抗性的細菌菌株(日本專利公開(Kokai)第8-70879號)。特別需要提到的菌株是AJ11478(FERMP-5274，參見日本專利公開(Kokoku)第62-34397號)。
屬于埃希氏菌屬的產L-異亮氨酸細菌的實例包括大腸桿菌KX141(VKPMB-4781，參見歐洲專利公開第519,113號)。
屬于埃希氏菌屬的產L-纈氨酸細菌的實例包括大腸桿菌VL1970(VKPMB-4411，參見歐洲專利公開第519,113號)。
屬于埃希氏菌屬的產L-苯丙氨酸細菌的實例包括大腸桿菌AJ12604(FERMBP-3579，參見歐洲專利公開第488,424號)。
進一步而言，屬于埃希氏菌屬的具有L-氨基酸生產能力的細菌，也可以通過導入具有L-氨基酸生物合成遺傳信息的DNA和利用基因重組技術提高這種生產能力來培育。例如，至于產L-賴氨酸細菌，可以導入的基因的實例包括，例如，編碼L-賴氨酸生物合成途徑的酶如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸激酶、二氧吡啶二羧酸合酶、二氧吡啶二羧酸還原酶、琥珀酰二氨基庚二酸轉氨酶和琥珀酰二氨基庚二酸脫酰酶的基因。假設一種基因編碼受L-天冬氨酸或L-賴氨酸反饋抑制的酶如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或天冬氨酸激酶和二氧吡啶二羧酸合酶，期望使用編碼該酶的突變基因，使該抑制不敏感。
進一步而言，至于產L-谷氨酸細菌，可以導入的基因的實例包括編碼谷氨酸脫氫酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、異檸檬酸脫氫酶、順烏頭酸水合酶、檸檬酸合酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶、烯醇酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、果糖二磷酸醛縮酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖磷酸異構酶等的基因。
至于產L-纈氨酸細菌，可以導入的基因的實例包括，例如，ilvGMEDA操縱子，優選為不表達蘇氨酸脫氨酶活性和消除弱化作用的ilvGMEDA操縱子(參見日本專利公開(Kokai)第8-47397號)。
進一步而言，酶從L-氨基酸生物合成途徑脫離來催化生產非靶L-氨基酸的化合物的活性可能下降或減少。例如，從L-賴氨酸生物合成途徑脫離來催化生產非靶L-賴氨酸的化合物的酶的實例包括高絲氨酸脫氫酶(參見國際專利公開WO95/23864)。進一步而言，從L-谷氨酸生物合成途徑脫離來催化生產非靶L-谷氨酸的化合物的酶的實例包括α-酮戊二酸脫氫酶、異檸檬酸裂解酶、磷酸乙酰基轉移酶、乙酸激酶、乙酰羥酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰基轉移酶、乳酸脫氫酶、谷氨酸脫羧酶、1-吡咯啉脫氫酶等。
進一步而言，屬于埃希氏菌屬的具有生產核酸能力的細菌在例如國際專利公開WO99/03988中作了詳細描述。更特別的，需要提到的是在那篇申請中描述的大腸桿菌FADRaddG-8-3KQ菌株(purFKQ，purA-，deoD-，purR-，add-，gsk-)。該菌株具有生產次黃苷和鳥嘌呤核苷的能力。該菌株具有突變的編碼PRPP氨基轉移酶的purF基因，其中326位上的賴氨酸殘基被谷氨酸殘基取代，且AMP和GMP的反饋抑制不敏感。在該菌株中，琥珀酰AMP合酶基因(purA)、嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)、嘌呤阻遏基因(purR)、腺苷脫氨酶基因(add)和次黃苷-鳥嘌呤核苷激酶基因(gsk)被斷裂了。該菌株的專有號為AJ13334，在國家生物科學和人體技術研究所、工業科學和技術代理機構、國際貿易和工業部門(現為國家高等工業科學和技術協會，國際專利生物體保藏組織，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)于1997年6月24日作為布達佩斯條約規定的國際保藏進行了保藏，得到的保藏號為FERM BP-5993。
進一步而言，本發明適用的蛋白沒有特殊的限制，只要它們能通過基因工程方法生產出，而特別需要提到的是酸性磷酸酶和GFP(綠色熒光蛋白)或其類似物。
此外，屬于埃希氏菌屬的具有生產有用物質如其它L-氨基酸、蛋白質(包括多肽)、核酸、維生素、抗生素、生長因子和生理活性物質能力的細菌，也可以為本發明所使用。
培育屬于埃希氏菌屬的具有上述生產靶物質能力的細菌，向埃希氏菌屬細菌中導入基因來提高它們的能力，可以使用將屬于埃希氏菌屬細菌細胞中的自主復制載體與基因連接構建重組DNA，并用于轉化大腸桿菌的方法。此外，也可能通過轉導、轉座子(Berg，D.E.和Berg，C.M.，生物技術，1，p.417，1983)、Mu噬菌體公開(日本專利(Kokai)第2-109985號)或同源重組(分子遺傳學實驗，冷泉港實驗室，1972)的方法將靶基因結合到染色體上。
本發明使用的埃希氏菌屬細菌是具有上述生產靶物質能力的細菌，其中的FIS蛋白在細胞中不能正常地起作用。“FIS蛋白不能正常地起作用”的表述可以指fis基因的轉錄或翻譯水平降低，從而該基因的產物FIS蛋白不生產或生產量下降，或者指生產的FIS蛋白發生突變，從而FIS蛋白原先的功能退化或消失。FIS蛋白不能正常地起作用的埃希氏菌屬細菌的典型的實例包括基因斷裂的菌株，其染色體上的fis基因通過基因重組技術被斷裂，和突變的菌株，其中由于染色體的表達調節序列或fis基因編碼區發生突變，不再生產功能性FIS蛋白。
大腸桿菌fis基因的核苷酸序列(GenBank登記號為AE000405的核苷酸序列中1067至1363位的核苷酸序列)和FIS蛋白的氨基酸序列的實例，如SEQ IDNOS21和22所示。
本發明中，“FIS蛋白”可以是除了具有如SEQ ID NO22所示氨基酸序列的大腸桿菌FIS蛋白外，還可以是該蛋白的同源物。進一步而言，被斷裂的fis基因可以是除了具有如SEQ ID NO21所示核苷酸序列的大腸桿菌fis基因外，還可以是該基因的同源物。例如，fis基因同源物的實例包括可以與具有SEQID NO21所示核苷酸序列或其部分的探針，在嚴格條件下進行雜交和編碼具有FIS蛋白功能的蛋白的基因。這里提到的“嚴格條件”，是指在該條件下產生所謂的特異性雜交，而不產生非特異性雜交。盡管很難通過使用一些數值來清楚地表述該條件，例如，該嚴格條件包括DNA具有高度同源性，例如DNA具有50％或以上，優選70％或以上，更優選90％或以上，甚至更優選95％或能相互雜交，而具有低于上述同源性的DNA之間不能相互雜交。可供選擇地，作為實例的嚴格條件是在該條件下，當鹽濃度符合Southern雜交洗脫條件時，即1×SSC，0.1％SDS，優選0.1×SSC，0.1％SDS，60℃，DNA相互雜交。
作為探針，也可以使用SEQ ID NO21所示核苷酸序列的部分。這樣的探針可以通過PCR生產，用根據SEQ ID NO21所示核苷酸序列制備的寡核苷酸作為引物，用包含SEQ ID NO21所示核苷酸序列的DNA片段作為模板。當長度約300bp的DNA片段作為探針時，2×SSC，0.1％SDS，50℃可作為雜交的洗脫條件。
作為在下面描述的基因破壞中使用的fis基因，優選使用與目標埃希氏菌屬細菌染色體上的fis基因相同的基因。然而，具有一定程度同源性的基因，以至于細胞內可能發生同源重組，也可被使用。
下面將描述通過基因重組技術斷裂染色體上fis基因的方法的一個實例。可以用具有被修飾的fis基因的DNA轉化埃希氏菌屬細菌來斷裂染色體上的fis基因，致使不生產FIS。這一般是通過缺失fis基因的一部分(缺失型fis基因)以及使缺失型fis基因和染色體上的fis基因發生重組來實現的。通過同源重組來斷裂基因方法已經建立，有使用線性DNA的方法、使用具有溫度敏感性復制控制區的質粒的方法等。考慮到可靠性，優選使用具有溫度敏感性復制控制區的質粒的方法。
宿主染色體的fis基因可以用缺失型fis基因代替如下。例如，可以通過將溫度敏感性復制控制區、突變型fis基因和顯示藥物如氨芐青霉素抗性的標記基因連接而制備重組DNA，用該重組DNA轉化屬于埃希氏菌屬的細菌，將轉化體菌株在溫度敏感性復制控制區不起作用的溫度下培養，然后在含有藥物的培養基中進一步培養，以獲得轉化體菌株，其中重組DNA結合到染色體DNA中。
如上所述，菌株中的重組DNA結合到染色體DNA上，與原先存在于染色體上的fis基因序列發生重組，兩個融合基因染色體fis基因和缺失型fis基因插入到染色體中，位于重組DNA的其它部分(載體部分、溫度敏感性復制控制區和藥物抗性標記)的兩端。因此，由于正常fis基因在該狀態下為顯性，轉化體菌株表達正常的FIS蛋白。
隨后，為了在染色體DNA上僅保留缺失型fis基因，通過兩種fis基因的重組，從染色體DNA上除去fis基因的一個拷貝以及載體區(包括溫度敏感性復制控制區和藥物抗性標記)。此時，染色體DNA上保留了正常fis基因而除去了缺失型fis基因，或者相反地，染色體DNA上保留了缺失型fis基因而除去了正常fis基因。在任何一種情況下，當菌株在溫度敏感性復制控制區起作用的溫度中培養時，被除去的DNA以質粒形式停留在細胞中。另一方面，如果菌株在溫度敏感性復制控制區不起作用的溫度中培養，染色體DNA上保留了缺失型fis基因的細胞中會除去包含正常fis基因的質粒。因此，通過PCR克隆或類似方法確定細胞中fis基因的結構，可以獲得染色體DNA上包含缺失型fis基因的菌株，而該細胞中正常fis基因被除去。
溫度敏感性復制控制區在屬于埃希氏菌屬細菌的細胞中起作用，作為具有該控制區的質粒，需要提到的是pMAN997(國際專利公開WO99/03988)，其在后面描述的實例中被使用。
常規基因重組技術如DNA的消化和連接、轉化、從轉化體菌株提取重組DNA和PCR，在參考文獻中詳細描述，這對于本領域的技術人員來說是熟知的，例如，Sambrook，J.，Fitsch，E.F.，Maniatis，T.，分子克隆，冷泉港實驗室，1989等。
進一步而言，通過用紫外線照射或使用常規突變處理用的誘變劑如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或亞硝酸處理屬于埃希氏菌屬的細菌，可以獲得不再生產功能性FIS蛋白的突變菌株。
生產靶物質，可以在培養基中培養上述獲得的具有生產靶物質能力和細胞中FIS蛋白不能正常地起作用的埃希氏菌屬細菌，在培養基或細胞中生產和積累靶物質，并收集靶物質。本發明中，使用具上述特性的埃希氏菌屬細菌，能提高靶物質的生產率或者生產效率。據信這是因為具有fis基因的野生型埃希氏菌屬細菌在培養過程中表達fis基因，促進或抑制一組轉錄受FIS蛋白調節的基因(包括已知和未知的基因)的表達，然而，在FIS蛋白不能正常地起作用的菌株中，上述這組基因的表達則不被調節。
作為培養本發明中屬于埃希氏菌屬細菌的培養基，根據使用的細菌菌株種類或靶物質，可以使用常規熟知的培養基。也就是說，可以使用包含碳源、氮源、無機離子和作為需要的其它有機成分的常規培養基。實施本發明不需要特殊的培養基。
作為碳源，可以使用糖類如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解產物，醇類如甘油和山梨醇，有機酸如反丁烯二酸、檸檬酸和琥珀酸等。
作為氮源，可以使用無機銨鹽如硫酸銨、氯化銨和磷酸銨，有機氮如大豆水解產物，氨氣，氨水等。
至于有機微量營養素，根據埃希氏菌屬細菌的特性，優選添加適量的所需物質如維生素B1、L-高絲氨酸和L-酪氨酸、酵母提取物等。除這些物質外，按需可添加少量磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。
培養可根據使用的細菌菌株，在熟知的常規使用的條件下進行。例如，優選地，在有氧條件下培養16-120小時。在培養過程中，培養溫度控制在25-45℃，pH控制在5-8。可以使用無機或有機酸或堿物質以及氨氣等來調節pH。
培養完成后，本發明不需要特殊的方法來收集培養基或細胞中的靶物質。也就是說，收集靶物質可以根據靶物質的種類，通過結合熟知的方法如那些使用離子交換樹脂、沉淀法和其它方法達到。進一步而言，積累在細胞中的靶物質，可以在經物理地或酶促破碎細胞之后，根據靶物質從細胞提取物或膜級分(membrane fraction)中收集。根據靶物質，當其存在于細胞中時，該靶物質可以作為微生物催化劑或類似物利用。
按照本發明，通過使用埃希氏菌屬細菌，能提高有用物質如L-氨基酸生產的生產率或者生產效率。
實施例下面將通過實施例更詳細地描述本發明。
實施例1編碼大腸桿菌MG1655的類核構建蛋白基因的斷裂及其對生長的作用通過交換PCR斷裂編碼大腸桿菌類核構建蛋白的基因(參見Link，A.J.，Phillips，D.，Church，G.M.，細菌血雜志(J.Bacteriol.)，Vol.179，6228-6237，1997)。
(1)fis基因的斷裂合成SEQ ID NOS1和2所示的寡核苷酸(引物1和2)作為引物，用來擴增一段約300bp的區域包括fis基因編碼區的N-末端約20bp和其上游區。合成SEQ ID NOS3和4所示的寡核苷酸(引物3和4)作為引物，用來擴增一段約300bp的區域包括fis基因編碼區的C-末端約20bp和其下游區。引物2和3包括部分互補的共同序列，設計引物使得當擴增產物被連接到那些部分時，fis基因的ORF的一部分將被除去。
進行第一個PCR，使用引物1和2結合、引物3和4結合以及以通過常規方法制備的野生型菌株MG1655的基因組DNA作為模板。在該PCR中，引物1和2與引物4和3的摩爾比為10∶1。進行第二個PCR，使用第一個PCR獲得的產物作為模板和引物1和4。將由第二個PCR構建的具有缺失型fis基因的DNA片段克隆到pGEMT-Easy，一種由Promega生產的克隆載體試劑盒中，按照操作步驟獲得重組載體pGEM-fis。
用EcoR I消化pGEM-fis以獲得包括缺失型fis基因的DNA片段。將該消化片段連接到溫度敏感性質粒pMAN997(參見國際專利公開WO99/03988)中，用相同的酶消化后，再用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo)純化。上述pMAN997可以通過將pMAN031的Vsp I-HindIII片段(細菌血雜志(J.Bacteriol.)，162，1196(1985))和pUC19(Takara Shuzo)交換而獲得。
大腸桿菌JM109感受態細胞(Takara Shuzo)用上述連接反應混合物轉化，接種到含有25μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上(Meiji Seika)(LB+氨芐青霉素)，在30℃中培養，以篩選氨芐青霉素抗性的克隆。將這些克隆在含有25μg/ml氨芐青霉素的LB培養基的試管中30℃培養，用Wizard Plus Miniprep(Promega)從細胞中提取質粒。用EcoR I消化這些質粒，篩選出含有目標長度片段的質粒作為fis斷裂的質粒pMANΔfis。
用pMANΔfis轉化大腸桿菌MG1655。
該轉化菌株在LB+氨芐青霉素平板上30℃培養，并篩選氨芐青霉素抗性克隆。篩選的克隆在30℃下液體培養過夜，稀釋103倍后接種到LB+氨芐青霉素平板上，在42℃下篩選氨芐青霉素抗性克隆。在這一階段，pMANΔfis結合到染色體DNA中。
隨后，篩選的克隆涂布在LB+氨芐青霉素平板上，30℃培養。然后，將適量細胞加到2mlLB培養基中，42℃搖床培養4至5小時。將培養液稀釋105倍后接種到LB平板上。在獲得的克隆中，將幾百個克隆接種到LB平板和LB+氨芐青霉素平板上，并檢測它們的生長，以確定氨芐青霉素敏感性和抗性。氨芐青霉素敏感性菌株的染色體DNA缺少pMANΔfis載體部分和原先存在于染色體DNA上的正常fis基因，或者缺失型fis基因。幾個氨芐青霉素敏感性菌株經過了克隆PCR，以篩選預期用期望的缺失型基因取代fis基因的菌株。因此，由大腸桿菌MG1655制備得到fis基因斷裂的菌株即MG1655Δfis。
(2)hns基因的斷裂和(1)中的方法一樣，由MG1655制備得到hns基因斷裂的菌株。合成SEQID NOS5和6所示的寡核苷酸(引物5和6)作為引物，用來擴增一段約600bp的區域包括hns基因編碼區的N-末端約40bp和其上游區，合成SEQ ID NOS7和8所示的寡核苷酸(引物7和8)作為引物，用來擴增一段約600bp的區域包括hns基因編碼區的C-末端約40bp和其下游區。
進行第一個PCR，使用引物5和6結合、引物7和8結合以及用通過常規方法制備的野生型菌株MG1655的基因組DNA作為模板。進行第二個PCR，使用第一個PCR獲得的產物作為模板和引物5和8。獲得由第二個PCR構建的具有缺失型hns基因的DNA片段。后面進行的程序與(1)中的方法相同，以獲得hns基因斷裂的菌株MG1655Δhns。
(3)dps基因的斷裂和(1)中的方法一樣，由MG1655制備得到dps基因斷裂的菌株。合成SEQID NOS9和10所示的寡核苷酸(引物9和10)作為引物，用來擴增一段約400bp的區域包括dps基因編碼區的N-末端約20bp和其上游區，合成SEQ ID NOS11和12所示的寡核苷酸(引物11和12)作為引物，用來擴增一段約300bp的區域包括dps基因編碼區的C-末端約20bp和其下游區。
進行第一個PCR，使用引物9和10結合、引物11和12結合以及用通過常規方法制備的野生型菌株MG1655的基因組DNA作為模板。進行第二個PCR，使用第一個PCR獲得的產物作為模板和引物9和12。獲得包括由第二個PCR構建的缺失型dps基因的DNA片段。后面進行的程序與(1)中的方法相同，以獲得dps基因斷裂的菌株MG1655Δdps。
(4)hupAB基因的斷裂由于hupA和hupB在基因組中是不相鄰的，因此這些基因需分別進行斷裂。首先，斷裂hupA基因。合成SEQ ID NOS13和14所示的寡核苷酸(引物13和14)作為引物，用來擴增一段約300bp的區域包括hupA基因編碼區的N-末端約20bp和其上游區，合成SEQ ID NOS15和16所示的寡核苷酸(引物15和16)作為引物，用來擴增一段約300bp的區域包括hupA基因編碼區的C-末端約20bp和其下游區。
進行第一個PCR，使用引物13和14結合、引物15和16結合以及以通過常規方法制備的野生型菌株MG1655的基因組DNA作為模板。進行第二個PCR，使用第一個PCR獲得的產物作為模板和引物13和16。獲得由第二個PCR構建的具有缺失型hupA基因的DNA片段。后面進行的程序與(1)中的方法相同，以獲得hupA基因斷裂的菌株MG1655ΔhupA。
隨后，在hupA基因斷裂的菌株MG1655ΔhupA中斷裂hupB基因。合成SEQID NOS17和18所示的寡核苷酸(引物17和18)作為引物，用來擴增一段約300bp的區域包括hupB基因編碼區的N-末端約20bp和其上游區，合成SEQ IDNOS19和20所示的寡核苷酸(引物19和20)作為引物，用來擴增一段約300bp的區域包括hupB基因編碼區的C-末端約20bp和其下游區。
進行第一個PCR，使用引物17和18結合、引物19和20結合以及用通過常規方法制備的野生型菌株MG1655的基因組DNA作為模板。進行第二個PCR，使用第一個PCR獲得的產物作為模板和引物17和20。獲得由第二個PCR構建的具有缺失型hupB基因的DNA片段。后面進行的程序與(1)中的方法相同，以獲得hupA基因和hupB基因斷裂的菌株MG1655ΔhupAB。
(5)基因斷裂菌株的培養用容量10ml的L-管，將fis基因斷裂的菌株MG1655Δfis、hns基因斷裂的菌株MG1655Δhns、hupAB基因斷裂的菌株MG1655ΔhupAB、dps基因斷裂的菌株MG1655Δdps和它們的親本菌株MG1655，培養在含有20mMNH4Cl、2mM MgSO4、40mM NaHPO4、30mM KH2PO4、0.01mM CaCl2、0.01mMFeSO4、0.01mM MnSO4、5mM檸檬酸、10mM葡萄糖、2mM鹽酸硫胺素、2.5g/L水解酪蛋白氨基酸(Difco)和50mM MES-NaOH(pH6.8)的培養基中。開始培養時，液體培養基的量為5ml。在37℃下以70rpm的旋轉率進行旋轉搖動培養。培養基、容器等在使用前都經過高壓滅菌。
持續測定液體培養基中的細胞濃度。細胞濃度是通過使用生物光檢測器(biophotodetector)(Advantech)測量660nm處的混濁度來測定的。結果如圖1所示。
結果發現，dps基因斷裂的菌株顯示出與對照菌株相似的生長水平，而hns基因斷裂的菌株和hupAB基因斷裂的菌株顯示出生長水平下降。另一方面發現，與對照菌株相比，fis基因斷裂的菌株顯示出生長水平提高。因此，證實了fis基因斷裂在發酵生產上的作用。
實施例2大腸桿菌fis基因的斷裂及其對L-賴氨酸生產的作用(1)fis基因的斷裂與實施例1中的方法相同，由大腸桿菌WC196菌株制備得到fis基因斷裂的菌株WC196Δfis。WC196菌株是一種源自AEC抗性大腸桿菌的L-賴氨酸生產細菌。該菌株的專有號為AJ13069，保藏在國家生物科學和人體技術研究所、工業科學和技術代理機構(現為國家高等工業科學和技術協會，國際專利生物體保藏組織，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)，得到的保藏號為FERM P-14690。然后，它于1995年9月29日被轉移到布達佩斯條約規定的國際保藏單位，得到的保藏號為FERM BP-5252(參見國際專利公開WO96/17930)。使用實施例1中獲得的fis基因斷裂的質粒pMANΔfis來轉化產L-賴氨酸細菌大腸桿菌WC196。隨后進行的程序與實施例1中的方法相同，由L-賴氨酸細菌大腸桿菌產WC196制備得到fis基因斷裂的菌株WC196Δfis。
(2)fis基因斷裂菌株的培養用200ml錐形瓶，將fis基因斷裂的菌株WC196Δfis和其親本菌株WC196培養在含有20mM NH4Cl、2mM MgSO4、40mM NaHPO4、30mM KH2PO4、0.01mM CaCl2、0.01mM FeSO4、0.01mM MnSO4、5mM檸檬酸、50mM葡萄糖、2mM鹽酸硫胺素、2.5g/L水解酪蛋白氨基酸(Difco)和50mM MES-NaOH(pH6.8)的培養基中。開始培養時，液體培養基的量為20ml。在37℃下以144rpm的旋轉率進行旋轉搖動培養。培養基、容器等在使用前都經過高壓滅菌。
持續測定液體培養基中的細胞濃度、葡萄糖濃度和L-賴氨酸的積累。細胞濃度是通過使用分光光度計(Beckman)測量經水稀釋至適當濃度的液體培養基在562nm處的混濁度來測定的。離心除去細胞后，將培養上清液稀釋至適當濃度，再用生物技術分析儀(biotech analyzer)(Sakura Seiki)測定葡萄糖濃度和L-賴氨酸的濃度。結果如圖2至4所示。進一步而言，培養8小時后的L-賴氨酸的積累值和殘余葡萄糖濃度如下所示。
表1fis斷裂的菌株8小時后的L-賴氨酸積累和殘余葡萄糖濃度
結果發現，與對照菌株相比，fis基因斷裂的菌株顯示出其生長水平(圖2)、葡萄糖消耗率(圖3)和L-賴氨酸生產率(圖4)都提高了。
實施例3將產L-賴氨酸的質粒導入fis基因斷裂的大腸桿菌菌株極其對L-賴氨酸生產的作用(1)將產L-賴氨酸的質粒導入fis基因斷裂的菌株用含有突變的二氫吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)合成酶基因、突變得源自埃希氏菌屬細菌的天冬氨酸激酶III基因和二氫吡啶二羧酸還原酶基因以及源自乳發酵短桿菌(Brevibacterium Lactofermentum)的二氨基庚二酸脫氫酶基因的質粒pCABD2(WO95/16042)，轉化實施例2中獲得的fis基因斷裂的菌株WC196Δfis和其親本菌株WC196，以獲得WC196/pCABD2菌株和WC196Δfis/pCABD2菌株。上述突變的二氧吡啶二羧酸合成酶基因和突變的天冬氨酸激酶III基因，都具有對L-賴氨酸的反饋抑制不敏感的突變。
(2)fis基因斷裂菌株的培養用200ml錐形瓶，將fis基因斷裂的WC196Δfis/pCABD2菌株和具有fis基因的野生型菌株WC196/pCABD2培養在含有20mM NH4Cl、2mM MgSO4、40mM NaHPO4、30mM KH2PO4、0.01mM CaCl2、0.01mM FeSO4、0.01mMMnSO4、5mM檸檬酸、50mM葡萄糖、2mM鹽酸硫胺素、2.5g/L水解酪蛋白氨基酸(Difco)和50mM MES-NaOH(pH6.8)的培養基中。開始培養時，液體培養基的量為20ml。在37℃下以144rpm的旋轉率進行旋轉搖動培養。培養基、容器等在使用前都經過高壓滅菌。
持續測定液體培養基中的細胞濃度、葡萄糖濃度和L-賴氨酸的積累。細胞濃度是通過使用分光光度計(Beckman)測量經水稀釋至適當濃度的液體培養基在562nm處的混濁度來測定的。離心除去細胞后，將培養上清液稀釋至適當濃度，再用生物技術分析儀(Sakura Seiki)測定葡萄糖濃度和L-賴氨酸的濃度。結果如圖5至7所示。進一步而言，培養8小時后的L-賴氨酸的積累值和殘余葡萄糖濃度如下所示。
表2fis斷裂的菌株8小時后的L-賴氨酸積累和殘余葡萄糖濃度
結果發現，與對照菌株相比，導入產L-賴氨酸質粒的fis基因斷裂的菌株的生長水平(圖5)、葡萄糖消耗率(圖6)和L-賴氨酸生產率(圖7)都提高了。
序列表<110>味之素株式會社<120>生產物質的方法<130>OP1626<140>
<141>2003-11-11<150>JP 2002-327205<151>2002-11-11<160>22<170> PatentIn version 3.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>1cctggatctt tcgggaaatc<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>2tacgcgttgt tcgaacatag<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>3ctatgttcga acaacgcgta aaatacggca tgaactaatt<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>4cactctgcaa tcacttcaaa<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>5atagggaatt ctcgtaaaca<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>6tttaagtgct tcgctcattg<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>7caatgagcga agcacttaaa ttcctgatca agcaataatc<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>8agaaacggtg gaagcctatc<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>9cccatacagc tactggcgct<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>10taatttagcg gtactcataa<210>11<211>42<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>11ttatgagtac cgctaaatta gagtctaaca tcgaataaat cc<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>12cggcaaaaac gtgatgcacg<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>13atattccgac ttttagctga<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>14cagttgagtc ttgttcataa<210>15<211>40<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>15ttatgaacaa gactcaactg aaagacgcag ttaagtaaga<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>16aacattgata ttgatgagcg<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>17tggacattca tcctgtgaag<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>18caattgagat ttattcactc<210>19<211>40<212>DNA<213>人工序列
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<223>人工序列的描述PCR引物<400>19gagtgaataa atctcaattg aaagacgcgg taaactaagc<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PCR引物<400>20cgccaatcag gtaaccactc<210>21<211>497<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(101)..(397)<400>21cgcacattca acgccattga ggatgccagc gaacagctgg aggcgttgga ggcatacttc 60gaaaattttg cgtaaacaga aataaagagc tgacagaact atgttcgaac aacgcgtaaa 120ttctgacgta ctgaccgttt ctaccgttaa ctctcaggat caggtaaccc aaaaacccct 180gcgtgactcg gttaaacagg cactgaagaa ctattttgct caactgaatg gtcaggatgt 240gaatgacctc tatgagctgg tactggctga agtagaacag cccctgttgg acatggtgat 300gcaatacacc cgtggtaacc agacccgtgc tgcgctgatg atgggcatca accgtggtac 360gctgcgtaaa aaattgaaaa aatacggcat gaactaattc aggttagcta aatgcttgat 420taaaaaggcg ctactcggca tggggaagcg ccttttttat aggtgtcaca aagggagtga 480ccatgagaac aggatgt497<210>22<211>98<212>PRT<213>大腸桿菌<400>22
Met Phe Glu Gln Arg Val Asn Ser Asp Val Leu Thr Val Ser Thr Val1 5 10 15Asn Ser Gln Asp Gln Val Thr Gln Lys Pro Leu Arg Asp Ser Val Lys20 25 30Gln Ala Leu Lys Asn Tyr Phe Ala Gln Leu Asn Gly Gln Asp Val Asn35 40 45Asp Leu Tyr Glu Leu Val Leu Ala Glu Val Glu Gln Pro Leu Leu Asp50 55 60Met Val Met Gln Tyr Thr Arg Gly Asn Gln Thr Arg Ala Ala Leu Met65 70 75 80Met Gly Ile Asn Arg Gly Thr Leu Arg Lys Lys Leu Lys Lys Tyr Gly85 90 95Met Asn
權利要求
1.一種通過使用屬于埃希氏菌屬的細菌生產靶物質的方法，包括在培養基中培養細菌以在培養基或細胞中生產和積累靶物質，并收集靶物質，其中的細菌具有生產靶物質的能力，且FIS蛋白在細胞中不能正常地起作用。
2.按照權利要求1的方法，其中細菌染色體上的fis基因已被斷裂，致使FIS蛋白不能正常地起作用。
3.按照權利要求1或2的方法，其中屬于埃希氏菌屬的細菌是大腸桿菌。
4.按照權利要求1至3中任一項的方法，其中靶物質是L-氨基酸或蛋白。
5.按照權利要求4的方法，其中L-氨基酸是天冬氨酸家族的L-氨基酸。
6.按照權利要求5的方法，其中天冬氨酸家族包括賴氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸。
7.按照權利要求6的方法，其中所述氨基酸是L-賴氨酸。
全文摘要
一種利用微生物生產靶物質的方法，包括在培養基中培養埃希氏菌屬細菌以生產和積累培養基或細胞中的靶物質，并收集靶物質，例如，染色體上fis基因被斷裂的、致使FIS蛋白在細胞中不能正常地起作用的菌株，可被用作該細菌。
文檔編號C12P13/00GK1498969SQ20031011986
公開日2004年5月26日 申請日期2003年11月11日 優先權日2002年11月11日
發明者瀧川里繪, 今泉明, 松井和彥, 児島宏之, 之, 彥 申請人:味之素株式會社