專利名稱：多元基因探針檢測轉基因的方法及其裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種轉基因檢測方法，更詳細的是一種非PCR擴增的多元基因探針檢測轉基因的方法及其裝置。
背景技術：
目前，基因檢測的方法主要有聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性分析；聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態性分析；熒光能量傳遞技術(Taqman探針技術，LightCycler探針技術，Amplisensor探針技術，復合探針技術)；分子燈塔技術；基因探針技術等。但是，這些技術都存在各自的不足有假陽性，靈敏度低，放射性元素，檢測時有熒光背景，操作繁瑣，檢測時間長等。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術存在的缺陷，提供一種檢測靈敏度高、安全、快速、準確、操作簡便的非PCR擴增的多元基因探針檢測轉基因的方法，用于檢測轉基因物種、轉基因植物、轉基因糧食和轉基因食品，待測樣品可以在儀器中進行探針雜交反應，然后進行電化學發光檢測。
本發明的目的還在于提供實現所述方法使用的非PCR擴增的多元基因探針檢測轉基因的裝置。
本發明非PCR擴增的多元基因探針檢測轉基因的方法包括以下步驟(1)提取待測樣品DNA；(2)用FOK I和BsrD I兩種限制性內切酶對樣品DNA進行酶切；(3)用DNA凝膠回收試劑盒將酶切片純化回收169bp的DNA片段；
(4)用一條標記有生物素和三條標記有三連吡啶釕的寡核苷酸探針與純化DNA片段進行雜交；非轉基因樣品DNA里面不含有169bp特異性序列，不能與探針雜交。
(5)雜交反應后的樣品用鏈霉親和素包被的磁珠在緩沖液中進行連接、清洗、收集并轉入檢測樣品池中；(6)在檢測樣品池中加入三丙胺，給定電壓，三連吡啶釕復合物與三丙胺發生電化學發光反應；(7)通過光纖接收檢測樣品池中發出的光信號，通過單光子計數模塊放大并轉換成電信號，通過計數卡進行數據采集并導入計算機中進行處理；(8)計算機根據采集的數據對待測序列進行定量分析。
本發明實現所述方法使用的非PCR擴增的多元基因探針檢測轉基因的裝置包括雜交樣品池、定時器、檢測樣品池、恒電位儀、光纖、光電倍增管、模數轉換器、計算機構成，其中檢測樣品池內安裝有進樣管、工作電極、對電極、參比電極、出樣管；雜交樣品池、檢測樣品池、光纖、光電倍增管、模數轉換器、計算機依次相連；定時器與雜交樣品池相連；檢測樣品池與恒電位儀相連。
檢測樣品池可以用清洗液反復清洗。所述的計算機數據處理軟件，如微軟公司的Excel軟件。所述的光電倍增管，如PerkinElmer公司研制的光電倍增管系列，所述的計數卡，如臺灣研華公司(Advantech)的PCL-836計數卡。
本發明的基本原理為根據絕大多數轉基因植物種都采用了CaMV35S啟動子，針對其設計四條寡核苷酸探針進行檢測(其中一條標記生物素，其余三條標記三連吡啶釕)。提取轉基因物種基因組DNA，經過Fok I和BsrD I兩種限制性內切酶進行酶切并回收169bp目的片斷，加入四種探針與目的片斷雜交，生物素可以與包被有鏈霉親和素的磁珠結合，進一步被磁極選擇性吸附，從而起到篩選目標序列的作用。最終使只有同時雜交上三連吡啶釕和生物素的目標序列才能被收集到檢測樣品池中并檢測到發光信號。在電場的作用下，三連吡啶釕復合物與三丙胺在陽極表面發生氧化還原反應，并放出一個光子。經過光纖收集到光電倍增管中，然后將其轉化電信號，經過模數轉換器，電信號被轉化為數字信號，被計算機采集處理。通過發光信號的強度來區別目標序列進行定量。
本發明與現有技術相比具有如下優點(1)電化學發光探針雜交儀可以對待測樣品進行準確的檢測。
(2)三條連有三連吡啶釕的探針與待測樣品進行雜交，不僅可以提高檢測的靈敏度，而且可以提高檢測的特異性。
(3)電化學發光探針雜交儀檢測靈敏度很高，并且可以有效的去除PCR中假陽性結果對檢測結果的干擾。
(4)非PCR檢測待測樣品，可以排除PCR操作的復雜性。
(5)電化學發光探針雜交儀操作方便，安全，沒有同位素等有害物質的使用。
(6)電化學發光探針雜交技術發光原理為電致發光，可以避免熒光PCR技術中熒光背景對結果的影響。
圖1是本發明裝置結構框圖；圖2是圖1的裝置的靈敏度測試圖；圖3是實施例1用本發明裝置檢測轉基因煙草中CaMV35S啟動子發光信號對比圖；(樣品1為TE緩沖液+三丙胺(本底)，樣品2為非轉基因煙草(花葉青)，樣品3為轉基因煙草(K306-2)。
具體實施例方式
下面結合附圖對本發明作進一步具體的描述，但本發明的實施方式不限于此。
圖1給出了本發明基因檢測的電化學發光PCR儀的具體結構示意圖。由圖一可知本裝置包括雜交樣品池、定時器、檢測樣品池、恒電位儀、光纖、光電倍增管、模數轉換器、計算機構成，其中檢測樣品池內安裝有進樣管、工作電極、對電極、參比電極、出樣管。雜交樣品池、檢測樣品池、光纖、光電倍增管、模數轉換器、計算機依次相連；定時器與雜交樣品池相連；檢測樣品池與恒電位儀相連。選用各構件組成本裝置，其中所述的光電倍增管，如PerkinElmer公司研制的光電倍增管系列。所述的計算機數據采集軟件，如National Instruments公司開發的LabVIEW軟件。
如圖2所示，本發明裝置可以檢測到0.1pmol的標記樣品，并在樣品含量0.1pmol至256pmol之間有很好的線性度。說明該儀器具有很高的靈敏度，而且可以進行定量的檢測。
實施例1將上述裝置應用于轉基因煙草的檢測轉基因煙草中都含有CaMV35S啟動子。
(1)提取非轉基因煙草(花葉青)，轉基因煙草DNA(K306-2)，轉基因煙草(K306-13)，轉基因煙草(G28-1)。
(2)在雜交樣品池中加入煙草DNA，Fok I酶切反應體系，進行反應。
(3)用-20℃的無水乙醇沉淀DNA。
(4)在DNA中再加入BsrD I酶切反應體系，進行反應。
(5)使用DNA凝膠回收試劑盒，回收169bp片斷大小的DNA。
(6)在回收的DNA樣品中加入三條分別標記有三連吡啶釕和一條標記有生物素的寡核苷酸探針，控制溫度95℃，5分鐘，然后降溫至55℃，30分鐘，使樣品和探針進行雜交反應；(7)雜交反應后的樣品用鏈霉親和素包被的磁珠在緩沖液中進行連接、清洗、收集并轉入檢測樣品池中；(8)在檢測樣品池中加入三丙胺，給定電壓1.25V，使三連吡啶釕復合物與三丙胺發生電化學發光反應；(9)通過光纖接收檢測樣品池中發出的光信號，通過單光子計數模塊放大并轉換成電信號，通過計數卡進行數據采集并導入計算機中進行處理；(10)使用計算機根據采集的數據對待測序列進行定量分析。
如圖3所示，是本例中用圖1裝置檢測轉基因煙草中CaMV35S啟動子發光信號對比圖。樣品1為TE緩沖液+三丙胺(本底)，樣品2為非轉基因煙草(花葉青)，樣品3為轉基因煙草(K306-2)，樣品4為轉基因煙草(K306-13)，樣品5為轉基因煙草(G28-1)，由圖可知本底與非轉基因煙草的電化學發光信號值低于閾值，而三種轉基因煙草電化學發光信號可以達到500左右。結果信號很明顯，信噪比很高，可以準確的判斷待測基因是否存在。
權利要求
1.一種多元基因探針檢測轉基因的方法，其特征在于包括以下步驟(1)提取待測樣品DNA；(2)用FOK I和BsrD I兩種限制性內切酶對樣品DNA進行酶切；(3)用DNA凝膠回收試劑盒將酶切片純化回收169bp的DNA片段；(4)用一條標記有生物素和三條標記有三連吡啶釕的寡核苷酸探針與純化DNA片段進行雜交；(5)雜交反應后的樣品用鏈霉親和素包被的磁珠在緩沖液中進行連接、清洗、收集并轉入檢測樣品池中；(6)在檢測樣品池中加入三丙胺，給定電壓，三連吡啶釕復合物與三丙胺發生電化學發光反應；(7)通過光纖接收檢測樣品池中發出的光信號，通過單光子計數模塊放大并轉換成電信號，通過計數卡進行數據采集并導入計算機中進行處理；(8)計算機根據采集的數據對待測序列進行定量分析。
2.一種實現權利要求1所述方法使用的裝置，其特征在于包括雜交樣品池、定時器、檢測樣品池、恒電位儀、光纖、光電倍增管、模數轉換器、計算機構成，其中檢測樣品池內安裝有進樣管、工作電極、對電極、參比電極、出樣管；雜交樣品池、檢測樣品池、光纖、光電倍增管、模數轉換器、計算機依次相連；定時器與雜交樣品池相連；檢測樣品池與恒電位儀相連。
全文摘要
本發明涉及一種非PCR擴增的多元基因探針檢測轉基因的方法及裝置，所述裝置包括雜交樣品池、定時器、檢測樣品池、恒電位儀、光纖、光電倍增管、模數轉換器、計算機，檢測樣品池內安裝有進樣管、工作電極、對電極、參比電極、出樣管；雜交樣品池、檢測樣品池、光纖、光電倍增管、模數轉換器、計算機依次相連；定時器與雜交樣品池相連；檢測樣品池與恒電位儀相連。所述檢測方法是待測樣品可以在儀器中用探針雜交篩選，然后進行電化學發光檢測，判斷待測樣品是否含有轉基因成分。本發明方法和裝置檢測靈敏度高、安全、快速、準確、操作簡便。該方法可用于轉基因物種、轉基因植物、轉基因糧食和轉基因食品的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK1661095SQ20041007751
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月22日 優先權日2004年12月22日
發明者邢達, 劉晉峰, 朱德斌 申請人:華南師范大學