專利名稱：人乳頭瘤病毒和熱休克蛋白重組蛋白疫苗及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種人乳頭瘤病毒和熱休克蛋白融合基因、其表達載體和重組蛋白疫苗，尤其涉及修飾的人乳頭瘤病毒16型(HPV-16)E6/E7和改造的分枝結核桿菌熱休克蛋白70(TBhsp70)融合基因，該融合基因的制備方法，含有該融合基因的高效表達載體的構建和表達載體，利用該融合基因所獲得的融合蛋白，以及所述融合基因和融合蛋白在制備防治人乳頭瘤病毒相關疾病及腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的常見病、多發病。目前腫瘤治療中的三大常規治療方法手術、放療和化療雖已經有了一定的發展，但是，手術切除為局部治療手段，而惡性腫瘤呈浸潤性生長，且易經過血管和/或淋巴管發生遠處轉移，因而對于中晚期惡性腫瘤患者單純手術很難達到完全清除癌細胞的目的；放療也是以局部為主的治療手段，同樣存在手術治療中的缺陷，且許多惡性腫瘤對放射治療并不敏感；化療是全身治療手段，但是其面臨著耐藥和毒副作用大的缺點。因此，研究惡性腫瘤新的治療措施及開發新的防治用生物藥物是各國腫瘤學工作者關注的重要課題之一。
國內外大量流行病學和臨床研究已經證明HPV，特別是HPV16型，與宮頸癌、食管癌、肺癌、頭頸部惡性腫瘤、胃賁門癌、皮膚癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、陰莖癌、肛門癌以及大腸癌等惡性腫瘤的發生密切相關。HPV與宮頸癌的病因學關系已經得到廣泛的認可，HPV16型是引起宮頸癌的主要病毒病因。一個涉及上海、廣州、北京、四川和香港5省市和地區的多中心研究(Int.J.Cancer，100327-331，2002)的資料顯示在我國78.7-87.7％的宮頸癌患者有HPV感染，其中61.7-91.8％為HPV16感染。對HPV的致癌機理研究顯示HPV感染宿主細胞后，其兩個癌基因E6和E7穩定整合到宿主細胞基因組DNA中并持續表達，這是HPV誘導細胞發生惡性轉化和維持惡性表型的關鍵。因此，E6和E7成為人們研究癌變機理和防治用新生物制品的熱點。研究還顯示用HPV的主要殼蛋白L1作為疫苗對預防HPV感染有效，但對已感染者無預防和治療作用；該疫苗制備困難是其另一個缺點，因為VLP(病毒樣顆粒)的制備耗時、耗材料、操作繁雜、需要經過3次超離心并且收率太低(僅為上超離心時蛋白總量的萬分之二到萬分之五)，因而給規模化批量生產帶來了很多困難。近年來的研究表明，單獨使用原核表達的E6或E7蛋白作為治療性疫苗有一定的防治效果，研究者曾設想使用未改造的E6/E7融合蛋白作為疫苗以期提高防治效果，但由于E6本身或E6/E7融合蛋白表達水平太低而無應用價值。且由于是未經改造的野生型癌基因產物，其安全性受到人們的質疑。含有E6和E7基因的病毒，或以質粒為載體的DNA疫苗，由于可能整合到細胞基因組中，也存在安全性問題。用合成的多肽作為疫苗，成本高且受MHC限制，使用范圍有限。
大量的研究顯示對于腫瘤等嚴重危害人類健康的疾病，免疫治療是一種有效的方法。目前正在開發的多種高度純化的新型疫苗雖具有良好的特異性和低毒性，但需要與高效的佐劑配合使用。對于佐劑的深入研究拓展了免疫治療的空間。但是，一方面由于不同的佐劑即使對同樣的抗原也可產生不同的效果；另一方面，由于對機體而言，佐劑是外源性物質，并且佐劑誘導的天然免疫應答特異性低，因此，可能引起一系列的毒副反應(包括局部炎癥、長期難以消退的結節、囊腫、致瘤作用、致畸作用和交叉免疫反應等)。因此，佐劑的應用具有必須考慮的有效性、安全性、選擇性、可控性及其它理論、技術和制造等問題。如經典的鋁佐劑雖與普通的疫苗聯合使用在提高抗體水平和安全性方面已獲得長期的實踐證實，但其對基因工程蛋白或多肽在誘導細胞免疫能力方面則無作用，加上對其作用機理了解較少，使之很難滿足新型疫苗的需要；再如，盡管弗氏不完全佐劑(IFA)在動物和人類中均證明是最成功的佐劑之一，但其可能的副作用人們仍有擔心，如應用局部常形成結節，甚至液化形成囊腫，有報道其在雄Swiss小鼠中有致瘤作用(BullWHO，1969；41617-621)，但在BALB/c和C57BL/6小鼠中不致瘤，因而就安全性問題仍存在擔心。最后，目前盡管已經開發了多種新型佐劑，但安全性及作用機理等仍有待深入研究。
大量的研究已經證明熱休克蛋白具有強有力的免疫原性，如①從腫瘤或病毒感染細胞分離的hsps復合物可以誘導強有力的抗腫瘤或抗病毒免疫；②分枝桿菌感染時，有高頻的以hsp70和60等為靶點的人CD4+T細胞出現；③hsps的多個鼠和人的B細胞和T細胞表位已經被鑒定，并可為哺乳動物細胞識別。這促使研究者利用hsps的這種特性發展感染性疾病疫苗和腫瘤免疫治療的策略，同時也為其被用作無佐劑載體提供了依據。研究者將hsp70與瘧疾小肽(NANP)40、HIV-1p24、卵清蛋白等共價連接后，在無其它佐劑條件下，激發了以這些肽或基因工程蛋白為靶點的特異性體液和細胞免疫反應。特異性CD8+CTL反應的誘導在抗腫瘤免疫中起重要作用，可能的機制有①與hsp70共價連接的目的蛋白本身含有T細胞表位，由于附加了hsp70的T細胞表位，因而免疫原性更強；②與hsp70共價連接的目的蛋白含有多種已知或尚未知的抗原表位，可以充分發揮其作用；③hsp70融合蛋白可通過激活共享的專職抗原遞呈細胞(APCs)，提供特異的同族CD4+輔助性T細胞，激活目的蛋白特異的CD8+CTL；④hsp70具有伴侶功能、可幫助蛋白折疊、可促進與之共價連接的蛋白泛素化而被很好的加工、TBhsp70融合蛋白可通過受體介導的內吞作用被專職的APCs攝取、hsp70融合蛋白可在體內外刺激專職APCs上調MHC I和II分子及共刺激分子的表達，這不僅有利于目的蛋白進入專職APCs并遞呈到相應的細胞亞單位，而且有利于MHC-肽復合物的形成并遞呈到細胞表面；⑤近年的研究(J.Exp.Med.，191403-408，2000)顯示hsp70融合蛋白誘導目的蛋白的CD8+CTL反應，不僅不需要佐劑，也不需要其伴侶功能，還克服了MHC的限制，還不需要CD4+T細胞的幫助。綜上所述，TBhsp70融合蛋白免疫治療可以誘導CD8+CTL反應，不需要佐劑，不需要CD4+T細胞的幫助，不受MHC限制，不需要病毒載體，避免了DNA疫苗的DNA序列潛在的安全性問題，并且容易大量制備、安全性好。在加上惡性腫瘤患者自身免疫力低下，癌細胞MHC分子和共刺激分子等表達下調，HIV感染引起CD4+T細胞顯著破壞等，這些都使得hsp70融合蛋白在發展抗腫瘤、抗HIV及其它感染性疾病的免疫治療策略上具有明顯的優勢。
發明內容
本發明目的之一是克服現有技術的不足，提供一種能夠有效治療與HPV相關的腫瘤且不需要免疫佐劑的重組蛋白疫苗。
本發明目的之一是通過以下技術途徑來實現的本發明的一種能夠有效治療與HPV相關的腫瘤且不需要免疫佐劑的重組蛋白疫苗，它是由hsp70蛋白中ATP結合位點161-370位氨基酸序列、人乳頭瘤病毒E6蛋白1-120位的氨基酸序列和E7蛋白總共98個氨基酸序列連接而成，其中將E6蛋白第50位的亮氨酸修飾為甘氨酸，將E7蛋白的第24位的半胱氨酸和26位的谷氨酸的分別修飾為甘氨酸；其中人乳頭瘤病毒E6蛋白位于該重組蛋白的氨基端，hsp70蛋白位于該重組蛋白的羧基端。
本發明重組蛋白疫苗優選的具有序列表中SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；本發明重組蛋白疫苗具有較強的免疫能力及抗腫瘤功能，且不需要免疫佐劑。
本發明的目的之二是提供一種編碼上述重組蛋白疫苗的融合基因。
本發明的目的之二是通過以下技術途徑來實現的本發明的一種融合基因，由經改構并修飾的人乳頭瘤病毒E6/E7基因和改造的分枝桿菌熱休克蛋白70基因融合而成，該融合基因包括hsp70基因編碼ATP結合位點的一部分(161-370氨基酸)的核苷酸序列；HPV的E6基因編碼前1-120位的氨基酸的核苷酸序列，包括E6中的完整的B-表位(1-23aa)和2個CTL表位(29-38aa；52-61aa)；HPV的E7基因編碼總共98個氨基酸的核苷酸序列，包括E7中的4個CTL表位(7-15aa；11-20aa；49-57aa和79-87aa)、Th表位(48-54aa)和3個B表位(1-18aa；25-37aa和43-60aa)。另外，E6基因的編碼第50位賴氨酸、E7基因的編碼第24位半胱氨酸和E7基因的編碼第26位谷氨酸的密碼子，采用定點突變方法進行基因突變，以去除其結合抑癌基因的作用，增加所表達重組蛋白疫苗的安全性。
本發明融合基因的特點是能夠在宿主中高效表達目的融合蛋白且具有較強的免疫能力及抗癌功能。
該融合基因通過以下步驟制備
(A)獲取TBhsp70、E6和E7基因；(B)將E6基因的編碼第50位賴氨酸、E7基因的編碼第24位半胱氨酸和E7基因的編碼第26位谷氨酸的密碼子進行定點突變；(C)將TBhsp70基因編碼ATP結合位點的一部分(161-370氨基酸)的核苷酸序列、E6基因編碼前1-120位的氨基酸的核苷酸序列和E7基因編碼總共98個氨基酸的核苷酸序列融合。
本發明的又一個目的是提供含有上述融合基因的表達載體及含有該表達載體的宿主細胞。
本發明還有一個目的是提供上述重組蛋白疫苗和融合基因在醫學中的應用。
本發明更進一步的目的是提供上述重組蛋白疫苗在制備治療和/或預防HPV相關腫瘤藥物中的應用。
本發明的人乳頭瘤病毒E6/E7和分枝桿菌熱休克蛋白70融合基因可用于制備安全、有效、能高效表達、容易大量制備的用于防治HPV相關腫瘤如宮頸癌等的蛋白疫苗，該蛋白疫苗誘導特異性CD8+CTL反應且不需要任何佐劑。由于惡性腫瘤患者自身免疫力低下，癌細胞MHC分子和共刺激分子等表達下調，因此，本發明重組蛋白疫苗在發展抗HPV相關腫瘤及其它感染性疾病免疫治療策略上具有明顯的優勢。
圖1 SDS-PAGE分析mE6△/mE7/hsp70△融合蛋白的表達、純化及融合蛋白的鑒定(Western blot)M蛋白分子量標準；1純化的融合蛋白；2BL21(DE3)空細菌誘導0小時；3、4轉PET30a(+)空載體的BL21(DE3)細菌誘導0小時、4小時；5、6轉PET30a(+)-mE6△/mE7/TBhsp70△重組質粒的BL21(DE3)細菌誘導0小時、4小時；7、8E6、E7 Western blot鑒定圖2無佐劑重組mE6△/mE7/hsp70△融合蛋白疫苗預防TC-1細胞的攻擊和再攻擊-◆-PBS組
-■-hsp70△組-▲-mE6△/mE7組-■-mE6△/mE7/hsp70△組圖3無佐劑重組mE6△/mE7/hsp70△融合蛋白疫苗預防TC-1腫瘤細胞的攻擊(接種TC-1細胞43天后的腫瘤平均體積)圖4無佐劑重組mE6△/mE7/hsp70△融合蛋白疫苗抑制已經形成的實體腫瘤的生長-◆-PBS組-■-mE6△/mE7/hsp70△組以下通過實施例來進一步描述本發明的有益效果，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發明的保護范圍。
具體實施例方式一、分枝桿菌熱休克蛋白70基因、人乳頭瘤病毒E6和E7基因的獲得、改造及mE6△/mE7/hsp70△融合基因和重組原核表達質粒載體的構建1.分枝桿菌熱休克蛋白70基因的獲得和改造培養分枝結核桿菌，提取基因組DNA，用PCR方法擴增hsp70基因編碼ATP結合位點的一部分(161-370氨基酸)的核苷酸序列(命名為TBhsp70△)，序列兩端分別引入BamH I和Xho I限制性酶切位點，經序列分析后，與GeneBank比較序列一致。
2.人乳頭瘤病毒E6和E7基因的獲得從HPV16陽性的宮頸癌患者腫瘤組織中提取基因組DNA，用PCR方法分別擴增E6和E7基因，經序列分析，E7基因DNA序列與國外報道一致，共編碼98個氨基酸；E6基因DNA序列除了第259位的T→C外，其余于與國外報道一致，共編碼158個氨基酸。該點突變導致編碼的氨基酸由半胱氨酸變為精氨酸(E6蛋白中第87位氨基酸)。該點突變位于E6已知表位之外，故對其免疫原性無影響。
3.人乳頭瘤病毒E6和E7基因的定點突變由于E6基因所編碼的蛋白中的第50位的亮氨酸引起抑癌基因p53失活的關鍵位點，E7基因所編碼的蛋白中的第24位的半胱氨酸和26位的谷氨酸是抑癌基因Rb失活的關鍵位點，故通過定點突變的方法將這三個位點改變為甘氨酸。以去除其結合并滅活抑癌基因的活性，增加疫苗的安全性。突變后的E6和E7基因分別命名為mE6和mE7。
4.mE6△/mE7/TBhsp70△融合基因和重組原核表達質粒載體的構建以上述mE6為模板用PCR方法擴增其編碼前1-120位氨基酸的核苷酸序列，并在其5′端引入NcoI限制性酶切位點。然后用PCR分段延長方法在mE6△的3′端逐步加上E7基因編碼總共98個氨基酸的核苷酸序列，并在其3′端加上BamH I限制性酶切位點。經序列分析證明所獲得的融合基因序列正確無誤，保留了突變位點。命名為mE6△/mE7。然后用Nco I和BamH II分別雙酶切PET30a(+)質粒和mE6△/mE7融合基因，回收后，用T4 DNA連接酶12℃連接過夜，轉化DH5α感受態細菌，在氨芐青霉素LB瓊脂平板上篩選陽性克隆，挑取單菌落擴增并提取重組質粒載體。命名為PET30a(+)-mE6△/mE7。用BamH I和Xho I分別雙酶切hsp70△和PET30a(+)-mE6△/mE7，回收，同上連接、轉化、篩選、挑取單菌落擴增并提取重組質粒。命名為PET30a(+)-mE6△/mE7/TBhsp70△。至此，成功構建了mE6△/mE7/TBhsp70△融合基因(測序結果見SEQ ID NO1)及其重組原核表達質粒載體。同時構建的僅含TBhsp70△的重組質粒載體命名為PET30a(+)-TBhsp70△。
二、高效表達工程菌的構建及融合蛋白的表達鑒定將上述構建的重組原核表達質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen公司)，并隨機挑取80個單菌落觀察表達情況。37℃搖菌至OD600為0.5-0.6時，用1mM(終濃度)的IPTG誘導蛋白表達，4小時后取樣走SDS-PAGE電泳(12.5％)，然后用考馬氏亮藍染色，脫色液脫色后可見約52KD的融合蛋白條帶(圖1)。然后用抗his-tag、HPV16E6和E7的單克隆抗體(Santa Cruz公司)分別對表達的蛋白進行Western blot分析鑒定(圖1)，證明該蛋白是目的融合蛋白，且分子量與預計相符。再用同樣條件進行發酵，取不同時間點(1-5小時)的樣品經SDS-PAGE電泳分析，同時與已知濃度的BSA為參照標準同時進行電泳，經染色及脫色后，用自動成像掃描儀進行光密度分析，當發酵培養4小時后，目的蛋白表達達飽和狀態，占菌體總量的30％左右。進一步的實驗證明該融合蛋白以包含體的形式存在。
三、蛋白產物的純化和透析復性(以100ml培養的細菌為例)1.誘導及收獲細胞37℃培養高效表達工程菌至OD600為0.5-0.6時，用1mM(終濃度)的IPTG誘導蛋白表達，4小時后離心收獲細胞，用裂解緩沖液(150mM NaCL，NP401％，脫氧膽酸0.5％，SDS 0.1％)重懸細胞并在冰浴中進一步超聲破碎細胞。
2.包含體的制備及溶解12000g，4℃離心，20分鐘，棄去上清，用10ml變性抽取/洗滌緩沖液(50mMNa3PO4，6M鹽酸胍，300mM NaCL)冰上充分溶解沉淀；12000g，4℃離心，20分鐘，保存上清于4℃冰箱中。
3.平衡樹脂及上載融合蛋白取6ml親和層析介質即TALONTMMetal親和層析樹脂儲存液，3600g，4℃離心，5分鐘；用10ml變性抽取/洗滌緩沖液平衡2次，將含包含體的溶液與樹脂混合，用10ml變性抽取/洗滌緩沖液洗2次后，小心裝入層析柱中。
4.洗滌雜蛋白和洗脫融合蛋白用20ml變性抽取/洗滌緩沖液洗滌層析柱，流速0.5ml/分鐘；用20ml咪唑洗脫緩沖液(45mM Na3PO4，5.4M鹽酸胍，270mM NaCL，150ml咪唑)洗脫融合蛋白，流速0.3ml/分鐘，分步收集，每管0.5ml。
5.透析復性及蛋白濃縮將洗脫的融合蛋白溶液裝入透析袋，對含不同濃度的鹽酸胍的PBS進行透析，逐級降低鹽酸胍的濃度直至對不含鹽酸胍的PBS進行透析。透析完成后用PEG20000濃縮融合蛋白至需要的濃度。
6.融合蛋白純度鑒定和定量取透析復性并濃縮的蛋白溶液5-10ul進行SDS-PAGE電泳分析(圖1)蛋白的純度(＞95％)，按Bradford方法測定蛋白濃度。
用以上方法反復試驗，融合蛋白回收率在50-60％。用1L發酵液，按比例放大上述步驟，最終可得產品(純度＞95％)150-180mg。
本發明融合蛋白疫苗預防腫瘤效果試驗將C57BL/6雌性小鼠(購自中國醫學科學院實驗動物中心，體重18-20克)隨機分為四組PBS組、TBhsp70△組、mE6△/mE7組和mE6△/mE7/TBhsp70△組，每組10只。分別用PBS(0.2ml)、TBhsp70△(含1.5nM蛋白的PBS0.2ml)、mE6△/mE7(含1.5nM蛋白的PBS0.2ml)、mE6△/mE7/TBhsp70△(含1.5nM融合蛋白的0.2mlPBS)經皮下注射(腹股溝處)進行免疫，第一次免疫2周后，同上加強免疫一次，加強免疫2周后，用6×104TC-1腫瘤細胞于皮下右肋腹側進行攻擊(TC-1是用HPV16型E6和E7基因及激活的Ras癌基因轉化而成的小鼠腫瘤細胞，由美國Johns Hopkins大學吳博士惠贈)，觀察實驗動物出瘤時間、測量腫瘤大小并計算腫瘤體積腫瘤體積＝長徑×短徑2/2。結果顯示mE6△/mE7/hsp70△組出瘤時間晚，7只至實驗結束(43天)未見腫瘤生長，3只雖長出腫瘤，但其中2只又完全消退，即至實驗結束僅有1只荷瘤鼠。而3個對照組所有實驗動物均有腫瘤生長(圖2)。實驗第43天時PBS組、hsp70△組、mE6△/mE7組和mE6△/mE7/hsp70△組腫瘤平均體積分別為3835.2±172.7mm3、3685.3±158.6mm3、3135.3±181.7mm3和10mm3(圖3)。實驗第51天，用更大劑量的TC-1腫瘤細胞對mE6△/mE7/hsp70△組9只無瘤鼠進行再攻擊，結果顯示有2只小鼠有一過性的腫瘤生長，但之后又完全消退(圖2)。
以上結果說明無佐劑mE6△/mE7/hsp70△融合蛋白疫苗免疫后，可以使免疫實驗動物產生強有力的特異性抗腫瘤免疫反應，該免疫反應可排斥癌細胞的攻擊，防止腫瘤的形成，因而具有預防作用。可用于在HPV16感染的高危人群防止HPV相關腫瘤的發生。
本發明融合蛋白疫苗抑制腫瘤的生長作用試驗鑒于預防實驗結果已經說明單用hsp70△或mE6△/mE7實驗動物均不能產生特異性的抗腫瘤免疫反應，所以隨后的研究不再單獨設組。實驗動物、免疫方法等同上。先將20只小鼠于皮下右肋腹側接種TC-1腫瘤細胞，1.3×105/只，待腫瘤平均體積達5mm3時，隨機分組，10只/組，并進行第一次免疫，2周后加強免疫一次。觀察腫瘤大小和小鼠生存時間，按上述公式計算腫瘤體積。結果顯示mE6△/mE7/hsp70△組腫瘤生長明顯受到抑制，實驗第35天時PBS組和mE6△/mE7/hsp70△組腫瘤平均體積分別為3508.4±156.9mm3和408.5±80.3mm3(圖4)，PBS組和mE6△/mE7/hsp70△組荷瘤鼠平均生存時間分別為34.2天和80.8天，其中mE6△/mE7/hsp70△組有2只動物腫瘤完全消退，獲得長期生存。
以上結果說明無佐劑mE6△/mE7/hsp70△融合蛋白疫苗免疫，可以使免疫實驗動物產生強有力的特異性抗腫瘤免疫反應，該免疫反應可以明顯抑制已經形成的實體腫瘤的生長，因而具有治療作用。可用于HPV相關腫瘤的治療。
本發明融合蛋白疫苗對腫瘤轉移的預防和治療作用實驗動物和免疫方法同試驗例2，先免疫2次，4周后尾靜脈注射TC-1腫瘤細胞(2×104/只)，接種TC-1細胞5周后處死小鼠觀察肺轉移情況(如果肉眼未見轉移則將肺全部包埋，連續切片觀察鏡下轉移情況)。結果顯示PBS組10只小鼠全部發生肺轉移(其中7只肉眼可見轉移灶，3只在顯微鏡下可見肺轉移)；mE6△/mE7/hsp70△融合蛋白組有2只在顯微鏡下可見轉移，8只肉眼和鏡下均沒有轉移(表1)。
表1
說明無佐劑mE6△/mE7/hsp70△融合蛋白疫苗免疫后，可以使免疫實驗動物產生強有力的特異性抗腫瘤免疫反應，該免疫反應可以防止腫瘤細胞的轉移，因而具有預防轉移的作用。可用于HPV相關腫瘤細胞轉移的預防。
先尾靜脈注射TC-1腫瘤細胞(2×104/只)，1周后隨機分組，每組10只，治療分2組，一組在給TC-1細胞1周后開始免疫(治療1組)，另一組在給TC-1細胞5周后開始免疫(治療2組)，各組均在免疫5周后處死小鼠觀察肺轉移情況(如果肉眼未見轉移則將肺全部包埋，連續切片觀察鏡下轉移情況。結果顯示PBS組10只小鼠全部發生肺轉移(其中8只肉眼可見轉移灶，2只在顯微鏡下可見肺轉移)；治療1組有1只可見肉眼轉移，2只在顯微鏡下可見轉移，7只肉眼和鏡下均沒有轉移；治療2組有2只可見肉眼轉移，3只在顯微鏡下可見轉移，5只肉眼和鏡下均沒有轉移(表2)。
表2
說明無佐劑mE6△/mE7/hsp70△融合蛋白疫苗免疫后，可以使免疫實驗動物產生強有力的特異性抗腫瘤免疫反應，該免疫反應可抑制轉移性腫瘤的生長，因而對腫瘤轉移有作用。可用于HPV相關腫瘤細胞轉移的治療。
綜上，本發明的優點是人乳頭瘤病毒E6/E7和分枝桿菌熱休克蛋白70融合基因可用于制備安全、有效、能高效表達、容易大量制備的用于預防和治療HPV相關腫瘤(如宮頸癌等)及其轉移的融合蛋白疫苗，本發明重組蛋白疫苗誘導特異性CD8+CTL反應不需要佐劑。由于惡性腫瘤患者自身免疫力低下，癌細胞MHC分子和共刺激分子等表達下調，再加上目前對于蛋白疫苗來講，最佳的佐劑和載體的缺乏已經嚴重困擾了蛋白疫苗的發展，因此，本發明重組蛋白疫苗在發展抗HPV相關腫瘤及其它感染性疾病免疫治療策略上具有明顯的優勢。無疑具有重要的臨床應用價值。
序列表SEQUENCE LISTING<110>中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤研究所<120>人乳頭瘤病毒和熱休克蛋白重組蛋白疫苗及其用途<130>20050126<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1293<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1atgcaccaaa agagaactgc aatgtttcag gacccacagg agcgacccag aaagttacca 60cagttatgca cagagctgca aacaactata catgatataa tattagaatg tgtgtactgc 120aagcaacagt tactgcgacg tgaggtaggt gactttgctt ttcgggattt atgcatagta 180tatagagatg ggaatccata tgctgtatgt gataaatgtt taaagtttta ttctaaaatt 240agtgagtata gacattatcg ttatagtttg tatggaacaa cattagaaca gcaatacaac 300aaaccgttgt gtgatttgtt aattaggtgt attaactgtc aaaagccact gtgtcctgaa 360atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 420gatctctacg gttatggtca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt 480ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag 540tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa 600gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accaaagctt 660gagaaggagc agcgaatcct ggtcttcgac ttgggtggtg gcactttcga cgtttccctg 720ctggagatcg gcgagggtgt ggttgaggtc cgtgccactt cgggtgacaa ccacctcggc 780ggcgacgact gggaccagcg ggtcgtcgat tggctggtgg acaagttcaa gggcaccagc 840ggcatcgatc tgaccaagga caagatggcg atgcagcggc tgcgggaagc cgccgagaag 900gcaaagatcg agctgagttc gagtcagtcc acctcgatca acctgcccta catcaccgtc 960gacgccgaca agaacccgtt gttcttagac gagcagctga cccgcgcgga gttccaacgg1020atcactcagg acctgctgga ccgcactcgc aagccgttcc agtcggtgat cgctgacacc1080ggcatttcgg tgtcggagat cgatcacgtt gtgctcgtgg gtggttcgac ccggatgcca1140
序列表gcggtgaccg atctggtcaa ggaactcacc ggcggcaagg aaccaaacaa gggcgtcaac1200ccagatgagg ttgtcgcggt gggagccgct ctgcaggccg gcgtcctcaa gggcgaggtg1260aaagacgttc tgctgcttga tgttaccccg taa 1293<210>2<211>430<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro1 5 10 15Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp20 25 30Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu35 40 45Val Gly Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly50 55 60Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile65 70 75 80Ser Glu Tyr Arg His Tyr Arg Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu85 90 95Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn100 105 110Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu115 120 125His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly130 135 140Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly145 150 155 160Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr165 170 175
序列表Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr180 185 190His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly195 200 205Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Lys Leu Glu Lys Glu Gln210 215 220Arg Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu225 230 235 240Leu Glu Ile Gly Glu Gly Val Val Glu Val Arg Ala Thr Ser Gly Asp245 250 255Asn His Leu Gly Gly Asp Asp Trp Asp Gln Arg Val Val Asp Trp Leu260 265 270Val Asp Lys Phe Lys Gly Thr Ser Gly Ile Asp Leu Thr Lys Asp Lys275 280 285Met Ala Met Gln Arg Leu Arg Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Ile Glu290 295 300Leu Ser Ser Ser Gln Ser Thr Ser Ile Asn Leu Pro Tyr Ile Thr Val305 310 315 320Asp Ala Asp Lys Asn Pro Leu Phe Leu Asp Glu Gln Leu Thr Arg Ala325 330 335Glu Phe Gln Arg Ile Thr Gln Asp Leu Leu Asp Arg Thr Arg Lys Pro340 345 350Phe Gln Ser Val Ile Ala Asp Thr Gly Ile Ser Val Ser Glu Ile Asp355 360 365His Val Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Met Pro Ala Val Thr Asp370 375 380Leu Val Lys Glu Leu Thr Gly Gly Lys Glu Pro Asn Lys Gly Val Asn385 390 395 400
序列表Pro Asp Glu Val Val Ala Val Gly Ala Ala Leu Gln Ala Gly Val Leu405 410 415Lys Gly Glu Val Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro420 425 430
權利要求
1.一種重組蛋白疫苗，該重組蛋白疫苗是由hsp70蛋白中ATP結合位點161-370位氨基酸序列、人乳頭瘤病毒E6蛋白1-120位的氨基酸序列和E7蛋白總共98個氨基酸序列連接而成，其中將E6蛋白第50位的亮氨酸修飾為甘氨酸，將E7蛋白的第24位的半胱氨酸和26位的谷氨酸的分別修飾為甘氨酸。
2.按照權利要求1所述的重組蛋白疫苗，其特征是選自下述任一氨基酸序列1)SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；2)在嚴緊的雜交條件下與編碼1)的氨基酸序列雜交的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。
3.按照權利要求2所述的重組蛋白疫苗，其特征是選自下述氨基酸序列SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
4.按照權利要求1所述的重組蛋白疫苗，其特征是人乳頭瘤病毒E6蛋白位于該重組蛋白的氨基端，hsp70蛋白位于該重組蛋白的羧基端。
5.編碼權利要求1～4任意一項重組蛋白疫苗的核苷酸序列。
6.按照權利要求5所述的核苷酸序列，其特征是具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
7.含有權利要求5～6任意一項所述核苷酸序列的表達載體。
8.含有權利要求7所述表達載體的宿主細胞。
9.權利要求1～4任意一項所述的重組蛋白疫苗在制備治療和/或預防與人乳頭瘤病毒相關的疾病及腫瘤藥物中的用途。
10.權利要求5～6任意一項所述的核苷酸序列在制備治療和/或預防與人乳頭瘤病毒相關的腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及修飾的人乳頭瘤病毒16型(HPV－16)E6/E7基因和改造的分枝結核桿菌熱休克蛋白70(TBhsp70)基因融合在一起所得到的融合基因，該融合基因的制備方法，含有該融合基因的高效表達載體的構建和表達載體，利用該融合基因所獲得的重組蛋白疫苗，以及所述融合基因和重組蛋白疫苗在制備防治人乳頭瘤病毒相關腫瘤藥物中的應用。實驗證實，本發明重組蛋白疫苗具有較強的免疫能力及抗腫瘤功能，且不需要與任何其它免疫佐劑聯合應用。
文檔編號C12N15/63GK1679930SQ20051000499
公開日2005年10月12日 申請日期2005年1月31日 優先權日2005年1月31日
發明者趙清正, 千新來 申請人:中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤研究所