專利名稱：一種用于邊遠山區人類血樣的dna提取試劑和方法
技術領域：
本發明涉及一種用于邊遠山區人類血樣的DNA提取的試劑和方法，屬生物技術領域。
背景技術：
21世紀是生命科學的世紀，基因研究則是該領域的前沿。在基因研究中，珍稀特有的遺傳資源的搶先保護與利用是搶占基因大戰的制高點，具有十分重要的戰略意義。中國擁有56個民族和一些未識別群體，是世界上人類遺傳多樣性最豐富的地區之一，而云南卻擁有中國最為豐富的人類遺傳資源，少數民族25種，其中15個特有民族，加之地理環境十分特殊，又由于交通落后閉塞，各民族之間長期隔離便形成了云南民族的遺傳多樣性及每個民族遺傳背景單一性的顯著特點。這些為研究人類群體遺傳和醫學遺傳提供了不可多得的珍貴遺傳資源。特別是同一民族不同地區某些疾病發病率和疾病特征上的差異是研究遺傳病基因的一條非常有價值的技術路線。同時也是研究環境對基因作用的理想人群，對進一步研究基因的結構與功能具有重要價值。然而，隨著經濟的迅速發展、交通條件的改善、生活方式的變遷、婚姻觀念的更新，這一寶貴資源正面臨迅速消失的危險，盡快對這一寶貴遺傳資源進行保護利用已刻不容緩。加強中國人群基因資源的保護和利用是實施可持續發展的國家戰略的需要。
提取和保存隔離人群的血樣基因組DNA是上述工作的基礎，常規的血樣DNA提取保存方法(《分子克隆》中的幾種標準方法)都需要較為嚴格的實驗室條件，如必須有冰凍離心機、水浴鍋、冰箱等體積較大的設備才能完成提取和保存任務，而中國目前少數民族隔離人群居住地大多位于遠離公路的大山深處。采集血樣往往需要在野外非實驗室條件下連續工作幾天甚至幾周。攜帶這些大型設備翻山越嶺進入不通公路的山區采集血樣標本幾乎是不可能的。因此發展一種只需個別小型便攜儀器、常溫下進行血樣采集、常溫下較長時間保存標本的方法是至關重要的。
發明內容
本發明是通過改進常規血樣DNA提取過程中冷凍離心去除紅細胞的過程，代之以常溫下加入紅細胞裂解液，常溫下低速短時間離心去除紅細胞，再將白細胞裂解液加入含有DNA的白細胞后，常溫下保存這種混合物最長可達4周，待收集任務完成后，在各地收集的這種混合物可以一并帶回實驗室用NaCl抽提DNA后進入常規流程。這樣，實現了僅需簡單的小型臺式離心機一種設備就可在常溫下完成血樣的采集、前期處理并較長時間保存中間樣品的方法。
本發明是這樣實現的
本發明的試劑包括DNA保存液、蛋白酶K，ACD抗凝劑(acidic citratedextrose)、紅細胞裂解液(RCLB，red cell lysis buffer)、白細胞裂解液(WCLB，white cell lysis buffer)；其中ACD抗凝劑為檸檬酸0.48g、檸檬酸鈉1.32g、葡萄糖1.47g，加水至1000ml，滅菌后備用；紅細胞裂解液(RCLB，red cell lysis buffer)為1mM NH4HCO3(碳酸氫氨)0.079g和115mM NH4Cl(氯化銨)6.15g，加水至1000ml，滅菌后備用；白細胞裂解液(WCLB，white cell lysis buffer)為100MmTris-Cl(三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸)、其PH為7.6，40mM EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)、其PH為8.0，50mM NaCl(氯化鈉)，0.2％SDS(十二烷基磺酸鈉)和0.05％Sodium azide(疊氮化鈉)，加水至1000ml，SDS在滅菌后加入。
DNA保存液1×TE蛋白酶K(德國Merck KgaA公司)本方法包括在非實驗室和常溫條件下對所采集血樣進行初步處理和保存、和在實驗室條件下將收集保存的樣品集中提取、純化后得到DNA的步驟。具體如下NaCl抽提DNA步驟1、在抽取的5ml靜脈血液中加入0.8ml ACD抗凝劑并搖勻，并將樣本放置于陰涼處待用；2、將置于陰涼處的血液轉到15ml的離心管中，加入RCLB 13ml-14ml，輕搖10Min；隨即在2000rpm的速度下離心5Min，然后棄上清，3、加入RCLB 13ml-14ml，輕搖10Min；2000rpm的速度下離心5Min，棄上清，再加入RCLB 13ml-14ml，輕搖10Min；2000rpm的速度下離心5Min，棄上清；4、加入1.8ml WCLB，用移液槍將白細胞沉淀和DNA混合物吹打均勻；5、將混合均勻的白細胞和DNA混合物移到凍存管中，這樣可以在室溫下保存四個星期；6、將白細胞和DNA混合物分裝到1.5ml的離心管中，每600ul的白細胞混合物需加入5ul 20mg/ml的蛋白酶K，搖均勻后放到50℃的水浴中消化8小時；7、消化后每個管中加入300ul NaCl，輕搖10Min分鐘，12000rpm離心5Min；8、將上清液分裝到1.5ml的離心管中，再加入1.2ml冰凍的無水乙醇，輕微搖均勻后放到-20℃下10Min；9、12000rpm下離心5Min，棄上清；10、用1ml 70％7醇洗鹽，在干燥的DNA中加入100ul-200ul的1×TE；11、加入TE后溶解1-2個小時就可以放到冰箱中保存或標化。
酚-氯仿抽提DNA的步驟
1.1-6的步驟和飽和NaCl溶液抽提DNA的步驟是一致的；2.在消化好的DNA樣品中加入等體積的TE飽和酚，輕微搖10Min分鐘，12000rpm離心5Min；3.將上清轉入另一個離心管中，再加入等體積的TE飽和酚，輕微搖10Min分鐘，12000rpm離心5Min；4.將上清轉入另一個離心管中，再加入等體積的TE飽和酚，輕微搖10Min分鐘，12000rpm離心5Min；5.取上清液，用等體積的氯仿抽提一次，12000rpm離心5Min；6.將上清液分裝到1.5ml的離心管中，加入1ul的3M的NaAc，再加入1.2ml冰凍的無水乙醇，輕微搖勻后放到-20℃下10Min；7.12000rpm下離心5Min，棄上清；8.用1ml 70％乙醇洗鹽，在干燥的DNA中加入100ul-200ul的1×TE，加入TE后溶解1-2個小時就可以放到冰箱中保存或標化。
本發明具有方法簡便、成本低、效果佳、有廣泛的應用領域等優點，特別適用于邊遠山區人類血樣的DNA提取。
具體實施例方式以下是本發明的實施例，但本發明的內容并不局限于此。
以下實施例采用發明內容所述的試劑和按照發明內容所述的步驟進行，其中加入到15ml的離心管中的RCLB分別為13ml、13.5ml和14ml；用1ml 70％乙醇洗鹽時，在干燥的DNA中加的1×TE分別為100ul、150ul和200ul；加入TE后溶解時間分別為1、1.5和2小時。
實施例一1999年開始，項目組歷經3年，行程1.5萬公里，深入云南的14個地州(怒江州、德宏州、寶山地區、大理州、麗江地區、迪慶州、楚雄往往州、玉溪地區、紅河州、文山州、曲靖地區、西雙版納州、臨滄地區)20多個縣的近50所中小學校及村莊，收集到了人口在5000人以上遺傳背景單一的云南25個少數民族共1250份基因樣本，其中每個民族采集50份父母三代均系本民族的血樣，每份5毫升靜脈血，提取基因組DNA，保存于-86度的超低溫冰箱，同時建立相應數據庫，完成云南少數民族遺傳信息資源庫建設。之后于2002至2004年的3年間，項目組分成7個樣品采集小組，分赴15個省份，行程數萬公里，收集了除云南外的其他32個少數民族群體共計1650份樣本，建立了DNA資源全、樣品量大、收集民族全、采樣標準的一個專業中國少數民族DNA庫(見表1)，已收存了全國55個民族的3000余份DNA樣本(僅缺臺灣高山族)。
表1、中國54個少數民族DNA庫
實施例二利用這種方法采集目標人群血樣DNA，進行中華民族源流的遺傳學研究，例如，云南寧蒗縣瀘沽湖畔的摩梭人是中國大陸目前惟一的母系社會群體。在第一次民族識別中被定為納西族，但是大部分摩梭人認為自己與納西族有本質的區別，后來通過云南省人民代表大會決議，稱之為“摩梭人”。將遺傳學的方法引入摩梭人的族源研究，對摩梭人以及居住于云南的納西族、藏族、白族、彝族和普米族6個群體線粒體DNA第一高變區、Y染色體上的13個SNP和8個STR位點進行了基因分型，結果顯示摩梭人相對缺乏南方民族特異的Y染色體類型，而mtDNA具有南北雙重特征。主成分分析和分子系統學分析進一步表明，摩梭人的父系遺傳結構與云南藏族最接近，而母系遺傳結構最接近麗江納西族，提示其父系和母系基因庫具有不同的來源。摩梭人特殊的母系社會結構可能是導致其母系、父系遺傳結構存在明顯差異的原因之一。該結果為摩梭人的族源研究提供了遺傳學方面的線索。云南25少數民族Y-DNA遺傳多樣性研究實施例三通過對云南少數民族隔離人群進行大規模的遺傳流行病學調查，應用這種DNA提取方法，完成了用于高血壓疾病相關基因研究的彝族和哈尼族各2個隔離人群6000余份樣本的采集工作，收集到4個典型的遺傳病大家系，相關疾病基因研究工作藝取得階段性成果。
權利要求
1.一種用于邊遠山區人類血樣的DNA提取的試劑，包括DNA保存液、蛋白酶K，其特征在于該試劑還包括ACD抗凝劑、紅細胞裂解液RCLB、白細胞裂解液WCLB；其中ACD抗凝劑為檸檬酸0.48g、檸檬酸鈉1.32g、葡萄糖1.47g，加水至1000ml，滅菌后備用；紅細胞裂解液為1mM NH4HCO30.079g和115mM NH4Cl 6.15g，加水至1000ml，滅菌后備用；白細胞裂解液為100Mm Tris-Cl、其PH為7.6，40mM EDTA、其PH為8.0，50mM NaCl，0.2％SDS和0.05％Sodium azide，加水至1000ml，SDS在滅菌后加入。
2.一種用于邊遠山區人類血樣的DNA提取的方法，包括在實驗室條件下將收集保存的樣品集中提取、純化后得到DNA的步驟，其特征在于該方法還包括在非實驗室和常溫條件下對所采集血樣進行初步處理和保存的步驟；該步驟為(1)在抽取的5ml靜脈血液中加入0.8ml ACD抗凝劑并搖勻，并將樣本放置于陰涼處待用；(2)將置于陰涼處的血液轉到15ml的離心管中，加入RCLB 13ml-14ml，輕搖10Min；(3)隨即在2000rpm的速度下離心5Min，然后棄上清，加入RCLB 13ml-14ml，輕搖10Min；2000rpm的速度下離心5Min，棄上清，再加入RCLB 13ml-14ml，輕搖10Min；2000rpm的速度下離心5Min，棄上清；(4)加入1.8ml WCLB，用移液槍將白細胞沉淀和DNA混合物吹打均勻；(5)將混合均勻的白細胞和DNA混合物移到凍存管中，這樣可以在室溫下保存四個星期；(6)將白細胞和DNA混合物分裝到1.5ml的離心管中，每600ul的白細胞混合物需加入5ul 20mg/ml的蛋白酶K，搖均勻后放到50℃的水浴中消化8小時；(7)消化后每個管中加入300ul NaCl，輕搖10Min分鐘，12000rpm離心5Min；(8)將上清液分裝到1.5ml的離心管中，再加入1.2ml冰凍的無水乙醇，輕微搖均勻后放到-20℃下10Min；(9)12000rpm下離心5Min，棄上清；(10)用1ml 70％乙醇洗鹽，在干燥的DNA中加入100ul-200ul的1×TE；(11)加入TE后溶解1-2個小時就可以放到冰箱中保存或標化。
全文摘要
本發明涉及一種用于邊遠山區人類血樣的DNA提取的試劑和方法，屬生物技術領域。試劑包括DNA保存液；蛋白酶K；由檸檬酸0.48g、檸檬酸鈉1.32g、葡萄糖1.47g，加水至1000ml的ACD抗凝劑；由1mM NH
文檔編號C12P19/00GK1706959SQ200510010800
公開日2005年12月14日 申請日期2005年5月11日 優先權日2005年5月11日
發明者肖春杰, 陳穗云, 俞海菁 申請人:云南大學